A selenocisteína (Sec, U) é o aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação é um processo co-traducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase e requer uma complexa maquinaria molecular. O repertório completo de genes envolvidos nessa via de síntese em procariotos é conhecido, porém algumas das interações moleculares ainda não foram totalmente esclarecidas. Este projeto visa à caracterização molecular nas interações entre o Fator de Elongação específico para incorporação de Sec (SelB) e Seril-tRNA sintetase (SerRS) com distintas construções do tRNASec de Escherichia coli afim de compreender a sua especificidade, seletividade e ordem de eventos. Para isso, medidas de Espectroscopia de Anisotropia de Fluorescência (FAS), Ultracentrifugação Analítica (AUC) e Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação das constantes de interação desses complexos proteína-tRNA. Além disto, experimentos de Espalhamento de Raios-X a baixo ângulo (SAXS) e Microscopia eletrônica de transmissão por contraste negativo (NS-EM) foram realizados para elucidação estrutural destes complexos. Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação e de especificidade do tRNA para este aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de possibilitar um aumento na compreensão de complexos do tipo proteína-tRNA bem como salientar a importância dos elementos estruturais do tRNA para sua especificidade no processo de síntese de novas proteínas. / Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents the main biological form of the selenium element and its incorporation is a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA codon and requires complex molecular machinery. The complete repertoire of genes involved in this pathway of synthesis in prokaryotes is known, although some of the molecular interactions have not yet been fully elucidated. This project aims at the molecular characterization in the interactions between the specific elongation factor for the incorporation of Sec (SelB) and Seril-tRNA synthase (SerRS) with different constructions of tRNASec from Escherichia coli in order to their specificity, selectivity and order of events. For this, measurements using Fluorescence Anisotropy Spectroscopy (FAS), Analytical Ultracentrifugation (AUC) and Differential Scanning Calorimetry (DSC) were employed to determine the interaction constants of the protein-tRNA complexes. In addition, Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) experiments and negative stain transmission electron microscopy (NS-EM) were performed for structural elucidation of these complexes. The proposed studies will help to understand the mechanism of tRNA incorporation and specificity for this amino acid in bacteria as well as other domains of life. In addition, it allows an increase in the understanding of protein-tRNA-like complexes as well as emphasizing the importance of structural elements of tRNA for its specificity in the process of synthesis of new proteins.

A selenocisteína (Sec, U) é o aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação é um processo co-traducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase e requer uma complexa maquinaria molecular. O repertório completo de genes envolvidos nessa via de síntese em procariotos é conhecido, porém algumas das interações moleculares ainda não foram totalmente esclarecidas. Este projeto visa à caracterização molecular nas interações entre o Fator de Elongação específico para incorporação de Sec (SelB) e Seril-tRNA sintetase (SerRS) com distintas construções do tRNASec de Escherichia coli afim de compreender a sua especificidade, seletividade e ordem de eventos. Para isso, medidas de Espectroscopia de Anisotropia de Fluorescência (FAS), Ultracentrifugação Analítica (AUC) e Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação das constantes de interação desses complexos proteína-tRNA. Além disto, experimentos de Espalhamento de Raios-X a baixo ângulo (SAXS) e Microscopia eletrônica de transmissão por contraste negativo (NS-EM) foram realizados para elucidação estrutural destes complexos. Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação e de especificidade do tRNA para este aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de possibilitar um aumento na compreensão de complexos do tipo proteína-tRNA bem como salientar a importância dos elementos estruturais do tRNA para sua especificidade no processo de síntese de novas proteínas. / Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents the main biological form of the selenium element and its incorporation is a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA codon and requires complex molecular machinery. The complete repertoire of genes involved in this pathway of synthesis in prokaryotes is known, although some of the molecular interactions have not yet been fully elucidated. This project aims at the molecular characterization in the interactions between the specific elongation factor for the incorporation of Sec (SelB) and Seril-tRNA synthase (SerRS) with different constructions of tRNASec from Escherichia coli in order to their specificity, selectivity and order of events. For this, measurements using Fluorescence Anisotropy Spectroscopy (FAS), Analytical Ultracentrifugation (AUC) and Differential Scanning Calorimetry (DSC) were employed to determine the interaction constants of the protein-tRNA complexes. In addition, Small Angle X-Ray Scattering (SAXS) experiments and negative stain transmission electron microscopy (NS-EM) were performed for structural elucidation of these complexes. The proposed studies will help to understand the mechanism of tRNA incorporation and specificity for this amino acid in bacteria as well as other domains of life. In addition, it allows an increase in the understanding of protein-tRNA-like complexes as well as emphasizing the importance of structural elements of tRNA for its specificity in the process of synthesis of new proteins.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. A doença representa um grave problema de saúde pública nos países tropicais subdesenvolvidos. Mais de 500.000 casos graves de leptospirose são notificados a cada ano e a taxa de mortalidade excede 10% (World Health Organization, 1999). Os roedores são o principal reservatório urbano da doença, e eliminam leptospiras viáveis no meio ambiente ao longo de toda a vida. As bactérias entram no hospedeiro por abrasões na pele ou por membranas mucosas e rapidamente se espalham pelo organismo atingindo vários órgãos. A identificação de mecanismos de invasão e de evasão imune apresentados por leptospiras patogênicas é extremamente relevante e tem sido alvo de pesquisas recentes desenvolvidas por vários grupos. Nesse contexto, a caracterização funcional de proteínas de membrana externa de Leptospira, principais alvos de interação com moléculas do hospedeiro, é de grande importância. O Fator de Elongação Tu (EF-Tu), uma proteína bacteriana abundante envolvida na síntese protéica, pertence à categoria das proteínas conhecidas como \"moonlighting\". Tais moléculas possuem a capacidade de exercer mais de uma função e, normalmente, localizam-se em diferentes compartimentos da célula. Há relatos de que EF-Tu de agentes patogênicos possa atuar como um fator de virulência. No presente trabalho, demonstrou-se que EF-Tu de Leptospira está localizado na superfície da bactéria e possui funções adicionais, sendo receptor para moléculas presentes no plasma do hospedeiro. Tal proteína interage com vários componentes da matriz extracellular e também com plasminogênio, de maneira dosedependente. Resíduos de lisina são importantes para essa interação. Plasminogênio ligado a EF-Tu é convertido em sua forma ativa, plasmina, que, por sua vez, é capaz de clivar os substratos naturais C3b e fibrinogênio. EF-Tu de Leptospira também se liga a Fator H, principal regulador da via alternativa do sistema complemento, e este mantém sua atividade funcional ao agir como co-fator de Fator I na clivagem de C3b. O potencial imunoprotetor de EF-Tu em modelo animal foi avaliado, tendo em vista o alto grau de conservação da proteína em diferentes espécies de Leptospira. EF-Tu não conferiu proteção significativa e, portanto, não deve ser considerado como um candidato vacinal contra a leptospirose. Em suma, EF-Tu de Leptospira deve contribuir para o processo de invasão e evasão ao sistema imune inato do hospedeiro, inativando o sistema complemento. Tanto quanto é do nosso conhecimento, essa é a primeira descrição de uma proteína \"moonlighting\" em Leptospira. / Leptospirosis is a zoonosis caused by pathogenic bacteria from the genus Leptospira. The disease represents a serious public health problem in underdeveloped tropical countries. More than 500,000 cases of severe leptospirosis are reported each year, with mortality rates exceeding 10% (World Health Organization, 1999). Rodents are the main urban reservoir of the disease, shedding viable leptospires throughout their lives in the environment. Leptospires infect hosts through small abrasions in the skin or mucous membranes and they rapidly disseminate to target organs. The identification of invasion mechanisms and immune evasion strategies employed by pathogenic leptospires is of great relevance. In this context, functional characterization of leptospiral outer membrane proteins, which represent the main targets for interaction with host molecules, is extremely important. The elongation factor Tu (EF-Tu), an abundant bacterial protein involved in protein synthesis, has been shown to display moonlighting activities. Known to perform more than one function at different times or in different places, it is found in several subcellular locations in a single organism, and may serve as a virulence factor in a range of important human pathogens. In this work we demonstrate that Leptospira EF-Tu is surface-exposed and performs additional roles as a cell-surface receptor for host plasma proteins. It interacts with several extracellular matrix components and also binds plasminogen in a dose-dependent manner. Lysine residues are critical for this interaction. Bound plasminogen is converted to active plasmin, which, in turn, is able to cleave the natural substrates C3b and fibrinogen. Leptospira EF-Tu also acquires Factor H (FH), the main soluble regulator of the alternative pathway of the complement system. FH bound to immobilized EF-Tu displays cofactor activity, mediating C3b degradation by Factor I (FI). Given the wide distribution of EF-Tu among Leptospira species, its immunoprotective potential was evaluated in an animal model. EF-Tu was not able to afford significant immunoprotection, and might not be considered a vaccine candidate against leptospirosis. In conclusion, EF-Tu may contribute to leptospiral tissue invasion and complement inactivation. To our knowledge, this is the first description of a leptospiral protein exhibiting moonlighting activities.

A leptospirose é uma zoonose causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira. A doença representa um grave problema de saúde pública nos países tropicais subdesenvolvidos. Mais de 500.000 casos graves de leptospirose são notificados a cada ano e a taxa de mortalidade excede 10% (World Health Organization, 1999). Os roedores são o principal reservatório urbano da doença, e eliminam leptospiras viáveis no meio ambiente ao longo de toda a vida. As bactérias entram no hospedeiro por abrasões na pele ou por membranas mucosas e rapidamente se espalham pelo organismo atingindo vários órgãos. A identificação de mecanismos de invasão e de evasão imune apresentados por leptospiras patogênicas é extremamente relevante e tem sido alvo de pesquisas recentes desenvolvidas por vários grupos. Nesse contexto, a caracterização funcional de proteínas de membrana externa de Leptospira, principais alvos de interação com moléculas do hospedeiro, é de grande importância. O Fator de Elongação Tu (EF-Tu), uma proteína bacteriana abundante envolvida na síntese protéica, pertence à categoria das proteínas conhecidas como \"moonlighting\". Tais moléculas possuem a capacidade de exercer mais de uma função e, normalmente, localizam-se em diferentes compartimentos da célula. Há relatos de que EF-Tu de agentes patogênicos possa atuar como um fator de virulência. No presente trabalho, demonstrou-se que EF-Tu de Leptospira está localizado na superfície da bactéria e possui funções adicionais, sendo receptor para moléculas presentes no plasma do hospedeiro. Tal proteína interage com vários componentes da matriz extracellular e também com plasminogênio, de maneira dosedependente. Resíduos de lisina são importantes para essa interação. Plasminogênio ligado a EF-Tu é convertido em sua forma ativa, plasmina, que, por sua vez, é capaz de clivar os substratos naturais C3b e fibrinogênio. EF-Tu de Leptospira também se liga a Fator H, principal regulador da via alternativa do sistema complemento, e este mantém sua atividade funcional ao agir como co-fator de Fator I na clivagem de C3b. O potencial imunoprotetor de EF-Tu em modelo animal foi avaliado, tendo em vista o alto grau de conservação da proteína em diferentes espécies de Leptospira. EF-Tu não conferiu proteção significativa e, portanto, não deve ser considerado como um candidato vacinal contra a leptospirose. Em suma, EF-Tu de Leptospira deve contribuir para o processo de invasão e evasão ao sistema imune inato do hospedeiro, inativando o sistema complemento. Tanto quanto é do nosso conhecimento, essa é a primeira descrição de uma proteína \"moonlighting\" em Leptospira. / Leptospirosis is a zoonosis caused by pathogenic bacteria from the genus Leptospira. The disease represents a serious public health problem in underdeveloped tropical countries. More than 500,000 cases of severe leptospirosis are reported each year, with mortality rates exceeding 10% (World Health Organization, 1999). Rodents are the main urban reservoir of the disease, shedding viable leptospires throughout their lives in the environment. Leptospires infect hosts through small abrasions in the skin or mucous membranes and they rapidly disseminate to target organs. The identification of invasion mechanisms and immune evasion strategies employed by pathogenic leptospires is of great relevance. In this context, functional characterization of leptospiral outer membrane proteins, which represent the main targets for interaction with host molecules, is extremely important. The elongation factor Tu (EF-Tu), an abundant bacterial protein involved in protein synthesis, has been shown to display moonlighting activities. Known to perform more than one function at different times or in different places, it is found in several subcellular locations in a single organism, and may serve as a virulence factor in a range of important human pathogens. In this work we demonstrate that Leptospira EF-Tu is surface-exposed and performs additional roles as a cell-surface receptor for host plasma proteins. It interacts with several extracellular matrix components and also binds plasminogen in a dose-dependent manner. Lysine residues are critical for this interaction. Bound plasminogen is converted to active plasmin, which, in turn, is able to cleave the natural substrates C3b and fibrinogen. Leptospira EF-Tu also acquires Factor H (FH), the main soluble regulator of the alternative pathway of the complement system. FH bound to immobilized EF-Tu displays cofactor activity, mediating C3b degradation by Factor I (FI). Given the wide distribution of EF-Tu among Leptospira species, its immunoprotective potential was evaluated in an animal model. EF-Tu was not able to afford significant immunoprotection, and might not be considered a vaccine candidate against leptospirosis. In conclusion, EF-Tu may contribute to leptospiral tissue invasion and complement inactivation. To our knowledge, this is the first description of a leptospiral protein exhibiting moonlighting activities.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In the period May 2008 to March 2009 experiment was conducted in an area of the Federal University of Santa Maria, in order to evaluate the characteristics and structural traits of eight native grasses (Andropogon lateralis, Aristida laevis, Axonopus affinis, Erianthus angustifolius, Paspalum notatum, Paspalum plicatulum, Piptochaetium montevidense and Sorghastrum pellitum) under nitrogen levels (zero and 100 kg /ha of nitrogen). The experimental design was of blocks randomized with three replications in factorial arrangement of 8 x 2 (native grasses x nitrogen). Accumulated thermal time of 350 and 700 degree days determined the interval between cuts to the species of prostrate growth habit and caespitose, respectively. The highest rates of elongation were observed in Aristida laevis, Erianthus angustifolius, Paspalum plicatulum and Sorghastrum pellitum when received nitrogen. For leaf appearance rate, phyllochron, leaf senescence rate, duration of elongation, the lifespan of the leaves, number of green leaves and leaf length difference was found between species. / No período de maio de 2008 a março de 2009 foi desenvolvido experimento em área da Universidade Federal de Santa Maria, com o objetivo de avaliar as características morfogênicas e estruturais de oito gramíneas nativas (Andropogon lateralis, Aristida laevis, Axonopus affinis, Erianthus angustifolius, Paspalum notatum, Paspalum plicatulum, Piptochaetium montevidense e Sorghastrum pellitum) sob níveis de adubação nitrogenada (zero e 100 kg/ha de nitrogênio). O delineamento experimental foi o de blocos inteiramente casualizados com três repetições e em arranjo fatorial 8 x 2 (gramíneas nativas x doses de nitrogênio). A soma térmica acumulada de 350 e 700 graus-dia determinou o intervalo entre cortes para as espécies de hábito de crescimento prostrado e cespitoso, respectivamente. As maiores taxas de elongação foliar foram observadas em Aristida laevis, Erianthus angustifolius, Paspalum plicatulum e Sorghastrum pellitum quando receberam adubação nitrogenada. Para taxa de aparecimento foliar, filocrono, taxa de senescência foliar, duração da elongação foliar, duração de vida das folhas, número de folhas verdes e comprimento de lâminas foliares houve diferença entre as espécies avaliadas.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4350402 bytes, checksum: bd6bf9393be337ef287514591c95188f (MD5) Previous issue date: 2011-07-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The ectomycorrhizal association is a mutualistic interaction between plant roots and soil fungi that causes morphophysiological changes in the plant root system. The nutritional benefits result from the capacity of the fungus to increase the uptake of mineral nutrients by the host plant in exchange for photoassimilates. For the ectomycorrhizal association between Scleroderma laeve and Eucalyptus grandis, there is no information on which genes are decisive for the symbiosis and how they relate to the formation of ectomycorrhizas. Transcripts of the genes ras and ef1α were dentified as differentially expressed in many symbiotic associations and are related to signal transduction pathways and protein synthesis, respectively. Thus, the objectives of this work were to establish the ectomycorrhizal association between S. laeve and E. grandis in vitro, to isolate partial sequences of the genes ras and ef1α of S. laeve, and to evaluate the functional expression of these genes during ectomycorrhizal formation. Our works demonstrates the ectomycorrhizal association between S. laeve and E. grandis in vitro for the first time. The typical structures of ectomycorrhizas, such as the mantle and the Hartig net, were observed. At three days of contact between S. laeve and E. grandis roots the beginning of mantle formation could be observed. At 15 days, the mantle was completely formed, the epidermal cells were elongated, and the Hartig net formation was in progress. At 30 days, the ectomycorrhizas presented all the typical morphological structures fully developed. To evaluate gene expression during the association, partial sequences of ras and ef1α were isolated and the transcripts evaluated at the pre-symbiotic phase and at 3, 15 and 30 days after physical contact of the fungus with the plant roots. The transcripts of the gene ef1α were expressed at all evaluated times. Transcripts of ras were only detected in the ectomycorrhizas after three, 15, and 30 days of contact. These results are fundamental for a better understanding of the ectomycorrhizal association between S. laeve and E. grandis and suggest that ras-mediated signal transduction pathways may be functional during the establishment of the symbiosis between the fungus and the host roots. / A associação ectomicorrízica é uma interação mutualista entre raízes de plantas e fungos do solo, resultando em mudanças morfofisiológicas do sistema radicular das plantas. Os benefícios nutricionais advêm da capacidade do fungo em aumentar a absorção de nutrientes minerais pelas plantas, recebendo em troca os fotoassimilados. Na associação entre Scleroderma laeve e Eucalyptus grandis ainda não se tem informações de quais genes são decisivos e estão relacionados a este processo. Transcritos dos genes ras e ef1α foram identificados durante a formação da simbiose e sendo diferencialmente expressos na associação ectomicorrízica, e estão relacionados a vias de transdução de sinal e atuando na síntese protéica, respectivamente. Assim, os objetivos deste trabalho foram estabelecer a associação ectomicorrízica in vitro entre S. laeve e E. grandis, isolar sequências parciais dos genes ras e ef1α do fungo ectomicorrízico S. laeve, e avaliar a expressão funcional destes genes durante as fases de formação das ectomicorrizas. Este trabalho comprova a associação in vitro entre S. laeve e E. grandis, sendo registrada pela primeira vez. As estruturas típicas das ectomicorrizas, como a formação do manto fúngico e da rede de Hartig foram observadas. Nos tempos avaliados, em três dias de contato já havia a formação do manto fúngico. Aos 15 dias, o manto fúngico estava completamente formado, as células da epiderme alongadas e a rede de Hartig, em formação. Aos 30 dias, as ectomicorrizas apresentavam todas as estruturas típicas desenvolvidas. Para avaliar a expressão dos genes durante a associação, sequências parciais dos genes ras e ef1α foram isolados, e os transcritos destes genes foram avaliados na fase pré-simbiótica e aos três, 15 e 30 dias após o contato físico. Os transcritos do gene ef1α foram expressos durante todos os tempos avaliados. Os transcritos do gene ras foram detectados nas ectomicorrizas após três, 15 e 30 dias. Estes resultados são fundamentais para uma melhor compreensão da associação ectomicorrízica entre S. laeve e E. grandis e sugerem que as vias de transdução de sinais mediada por ras podem ser funcionais durante o estabelecimento da simbiose entre os fungos e as raízes de plantas.

The present work aims to determine the physiological and sanitary quality of Sweet sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) seeds, as well as to identify pathogens associated with seed, their transmission to seedlings and the subsequent pathogenicity of isolates obtained, In addition, molecularly identify the fungal species pathogenic to this crop. The experiments were carried out in the Teaching and Seed Research Laboratory (TSRL), of the Plant Engineering Department; In the Elocy Minussi Phytopathology Laboratory, Department of Plant Protection, and at the Biological Institute of São Paulo. Sweet sorghum seeds were used, all without chemical treatment. Sanitary quality was evaluated by sanity test, and physiological characteristics by germination and vigor tests (seedling length, dry mass, emergence, rate of emergence and accelerated aging). It was performed the test of transmission of the pathogens associated to the seeds and the subsequent pathogenicity of the obtained isolates, culminating with the molecular characterization of the identified pathogens, in which were sequenced the Internal Transcribed Spacer (ITS) genomic regions and the Elongation Factor 1 - alpha (TEF1-α) gene. The design used was the completely randomized design, with four cultivars of Sweet sorghum (BRS 506, F19, BRS 511 and BRS 509); For the evaluation of pathogenicity, the factorial scheme is represented by four cultivars and three isolates of Fusarium spp., besides the witness. The seeds of the BRS 509 cultivar were considered to have lower physiological quality than the other cultivars. The DNA sequencing allowed identifying the Fusarium thapsinum species as a pathogenic agent in the sweet sorghum crop, and proven its transmission via seeds. / O presente trabalho teve como objetivo determinar a qualidade fisiológica e sanitária de sementes de cultivares de sorgo sacarino (Sorghum bicolor (L.) Moench), bem como identificar os patógenos associados à semente, sua transmissão às plântulas e a posterior patogenicidade de isolados obtidos, além disso, identificar molecularmente as espécies fúngicas patogênicas a esta cultura. Os experimentos foram realizados no Laboratório Didático e de Pesquisas em Sementes (LDPS), do Departamento de Fitotecnia; no Laboratório de Fitopatologia Elocy Minussi, do Departamento de Defesa Fitossanitária e, no Instituto Biológico de São Paulo. Foram utilizadas sementes de sorgo sacarino, todas sem tratamento químico. A qualidade sanitária foi avaliada pelo teste de sanidade, e as características fisiológicas por meio dos testes de germinação e de vigor (comprimento de plântulas, massa seca, emergência, índice de velocidade de emergência e envelhecimento acelerado). Foi realizado o teste de transmissão dos patógenos associados à semente e a posterior patogenicidade dos isolados fúngicos obtidos, culminando com a caracterização molecular dos patógenos identificados, na qual foram sequenciadas as regiões genômicas Internal Transcribed Spacer (ITS) e o gene do fator de elongação 1-α (TEF1α). O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado com quatro cultivares de sorgo sacarino (BRS 506, Fepagro 19, BRS 511 e BRS 509); já para a avaliação da patogenicidade, o esquema fatorial foi representado pelas quatro cultivares e três isolados de Fusarium sp., além da testemunha. As sementes da cultivar BRS 509 foram consideradas de qualidade fisiológica inferior as demais cultivares. O sequenciamento de DNA permitiu identificar a espécie Fusarium thapsinum como agente patogênico na cultura do sorgo sacarino, sendo comprovada sua transmissão via sementes.