München, Techn. Univ., Diss., 2004.

Techn. Hochsch., Diss., 2005--Aachen.

Due to the current rise of exposure to natural and synthetic compounds in our daily life, the debate concerning the safety of many substances is becoming increasingly relevant. The estrogenic activity of various compounds, described as xenoestrogens, is the major part of this debate. Humans beings are exposed to these substances from different environmental contaminations ranging from conscious intake of estrogenic substances, as in contraception or in hormone replace therapy (HRT), to unconscious exposure, from food, the use of synthetic material in daily life and air and water pollution. At this point the need for methods to investigate the activity and the safety of these substances is becoming increasingly important. Classical methods for the analysis of the estrogenic activity of substances, like batteries of in vivo test systems on the rat uterotrophic assay are not able to describe the different pathways of action of recently discovered estrogenic substances. This evidence was already shown by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), introducing new test guidelines for the investigation of effects of endocrine disruptors (according to enhanced Test Guideline 407). As reviewed by Nilsson (Nilsson et al., 2001), after the interaction of the estrogens with the Estrogen Receptor (ER) in the cells, the mechanism of activation possible is not only via direct binding of the ER to the Estrogen Responsive Elements (EREs) present in the promoter region of the target gene, very well described for many target genes, but that also other mechanisms are used: the interaction of the ER with the AP 1, Sp 1 and NFkB modes, that are discovered but not yet comprehensively described. The aim of my work is to produce a microarray DNA chip for the investigation of the estrogenic activity of different compounds present in the environment. The chip will consist of a selection of 100 genes that are estrogen responsive and it will cover the spectrum of activities of estrogenic compounds in various organs of the body. In the gene selection, genes were chosen that are estrogen responsive in the classical target tissues of estrogens, linked to reproduction, like uterus and mammary gland, and also in tissues not related to reproduction like liver, bones and capillars. In addition, other genes are included to monitor different pathways that are related to disease states; control of cell proliferation, apoptosis or cancer related genes. Currently these kinds of investigations are already in process, but by other methods which are more time consuming and with a lower throughput e.g. the gene expression profiling using the real time RT-PCR. The use of microarray’s satisfies the need for a less time consuming, high throughput method, to obtain a fast characterization of the gene expression finger print of the candidate substances and their mechanism of action in the organism. In my work I investigated the estrogenic potency of different Xenoestrogens that commonly occur in our daily life, in rat cells and tissue using well known estrogen sensitive genes like C3, Clu, IGFBP1 and CaBP9k. I focused on their effect on cell proliferation, studying PCNA expression. For the first time sensitivity of the gene CA2 was proofed in liver and uterus. A new identified mRNA sequence, r52, was characterized for its sensitivity to estrogenic exposure. This sequence was investigated at the molecular level expanding the known nucleic sequence. I produce a microarray chip with 16 genes to investigate the estrogenic potency of different compounds. As proof of principle of the microarray method completely produced in house I compared the result of gene expression obtained by the chip to that obtained by real time RT PCR finding a similarity of results. This new established method is less sensitive than the real-time RT PCR but allows a high throughput of gene expression analysis producing at the end a more complete picture of the expression signature of a compound.

In cultured medaka testis fragments, cells remained viable for the entire culture period (17h), and spermatids that developed from spermatocytes were viable and motile. Primary cultures were characterized over a period of two days with respect to cell viability and the distribution of adherent and suspended cells. These two cell populations were maintained in dynamic equilibrium in vitro for several days. Proliferating cells were predominant among clusters of suspended cells, as determined by BrdU labeling, and CFSE and propidium iodide PI labeling. Based on cytological criteria, the proliferating cells were mostly spermatogonia and possibly also preleptotene spermatocytes. Differentiation of spermatocytes into spermatids or spermatozoa was also observed, mainly among the suspended cells. These results suggest that the organ and primary culture systems are suitable systems for studying the effects of substances that interfere with spermatogenesis in the medaka, a model vertebrate. The organ and primary culture systems were used to analyze the effects of a synthetic estrogen, EE2, on cell proliferation in medaka testis. Both organ and primary culture were suitable for this purpose consistently small concentrations (0.01 and 1 nM) of EE2 stimulated cell proliferation slightly, while higher concentrations (100 nM) had an inhibitory effect. To investigate the effect of phytoestrogens on cell proliferation in spermatogenesis, selected flavonoids [genistein (1, 10, 100 µg/ml), quercetin (0.01, 1, 100 µM), and 8-prenylnarigenin (0.001, 0.1, 1, 10 µM)] were added to medaka testis primary cultures. Genistein and quercetin inhibited cell proliferation in the cultures while 8-prenylnarigenin had no effect. In a second series of experiments the addition of genistein (10 µg/ml) to primary cultures significantly inhibited both cell proliferation and cell differentiation as determined by flow cytometry using CFSE/PI labeling.

Due to the current rise of exposure to natural and synthetic compounds in our daily life, the debate concerning the safety of many substances is becoming increasingly relevant. The estrogenic activity of various compounds, described as xenoestrogens, is the major part of this debate. Humans beings are exposed to these substances from different environmental contaminations ranging from conscious intake of estrogenic substances, as in contraception or in hormone replace therapy (HRT), to unconscious exposure, from food, the use of synthetic material in daily life and air and water pollution. At this point the need for methods to investigate the activity and the safety of these substances is becoming increasingly important. Classical methods for the analysis of the estrogenic activity of substances, like batteries of in vivo test systems on the rat uterotrophic assay are not able to describe the different pathways of action of recently discovered estrogenic substances. This evidence was already shown by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), introducing new test guidelines for the investigation of effects of endocrine disruptors (according to enhanced Test Guideline 407). As reviewed by Nilsson (Nilsson et al., 2001), after the interaction of the estrogens with the Estrogen Receptor (ER) in the cells, the mechanism of activation possible is not only via direct binding of the ER to the Estrogen Responsive Elements (EREs) present in the promoter region of the target gene, very well described for many target genes, but that also other mechanisms are used: the interaction of the ER with the AP 1, Sp 1 and NFkB modes, that are discovered but not yet comprehensively described. The aim of my work is to produce a microarray DNA chip for the investigation of the estrogenic activity of different compounds present in the environment. The chip will consist of a selection of 100 genes that are estrogen responsive and it will cover the spectrum of activities of estrogenic compounds in various organs of the body. In the gene selection, genes were chosen that are estrogen responsive in the classical target tissues of estrogens, linked to reproduction, like uterus and mammary gland, and also in tissues not related to reproduction like liver, bones and capillars. In addition, other genes are included to monitor different pathways that are related to disease states; control of cell proliferation, apoptosis or cancer related genes. Currently these kinds of investigations are already in process, but by other methods which are more time consuming and with a lower throughput e.g. the gene expression profiling using the real time RT-PCR. The use of microarray’s satisfies the need for a less time consuming, high throughput method, to obtain a fast characterization of the gene expression finger print of the candidate substances and their mechanism of action in the organism. In my work I investigated the estrogenic potency of different Xenoestrogens that commonly occur in our daily life, in rat cells and tissue using well known estrogen sensitive genes like C3, Clu, IGFBP1 and CaBP9k. I focused on their effect on cell proliferation, studying PCNA expression. For the first time sensitivity of the gene CA2 was proofed in liver and uterus. A new identified mRNA sequence, r52, was characterized for its sensitivity to estrogenic exposure. This sequence was investigated at the molecular level expanding the known nucleic sequence. I produce a microarray chip with 16 genes to investigate the estrogenic potency of different compounds. As proof of principle of the microarray method completely produced in house I compared the result of gene expression obtained by the chip to that obtained by real time RT PCR finding a similarity of results. This new established method is less sensitive than the real-time RT PCR but allows a high throughput of gene expression analysis producing at the end a more complete picture of the expression signature of a compound.

This thesis explores the application of passive sampling as a novel monitoring technique capable of quantifying aquatic pollutants at low environmental concentrations, and in a form that is directly applicable to risk assessment. Two passive samplers, namely polyethersulfone (PES) and silicone rubber (SR), were used to monitor some endocrine disruptors (EDCs) and hydrophobic organic chemicals (HOCs) in freshwater and sediments of a tropical river in Kenya. PES was applied for the first time for time-integrative sampling of these compound classes and was able to quantify the target compounds at low concentrations that were not significantly different to those obtained using the well-established SR, despite differences in uptake mechanisms with both sampler materials. This study demonstrated that passive samplers are versatile tools that can be applied in remote locations, and with proper storage, they can be transported and analyzed far afield.

In cultured medaka testis fragments, cells remained viable for the entire culture period (17h), and spermatids that developed from spermatocytes were viable and motile. Primary cultures were characterized over a period of two days with respect to cell viability and the distribution of adherent and suspended cells. These two cell populations were maintained in dynamic equilibrium in vitro for several days. Proliferating cells were predominant among clusters of suspended cells, as determined by BrdU labeling, and CFSE and propidium iodide PI labeling. Based on cytological criteria, the proliferating cells were mostly spermatogonia and possibly also preleptotene spermatocytes. Differentiation of spermatocytes into spermatids or spermatozoa was also observed, mainly among the suspended cells. These results suggest that the organ and primary culture systems are suitable systems for studying the effects of substances that interfere with spermatogenesis in the medaka, a model vertebrate. The organ and primary culture systems were used to analyze the effects of a synthetic estrogen, EE2, on cell proliferation in medaka testis. Both organ and primary culture were suitable for this purpose consistently small concentrations (0.01 and 1 nM) of EE2 stimulated cell proliferation slightly, while higher concentrations (100 nM) had an inhibitory effect. To investigate the effect of phytoestrogens on cell proliferation in spermatogenesis, selected flavonoids [genistein (1, 10, 100 µg/ml), quercetin (0.01, 1, 100 µM), and 8-prenylnarigenin (0.001, 0.1, 1, 10 µM)] were added to medaka testis primary cultures. Genistein and quercetin inhibited cell proliferation in the cultures while 8-prenylnarigenin had no effect. In a second series of experiments the addition of genistein (10 µg/ml) to primary cultures significantly inhibited both cell proliferation and cell differentiation as determined by flow cytometry using CFSE/PI labeling.

Bei zwei Fließgewässern (Lockwitzbach und Körsch) wurde ein Expositions- und Effektmonitoring an Probenahmestellen jeweils ober- und unterhalb des Einleiters eines kommunalen Klärwerks über einen Zeitraum von zwei Jahren durchgeführt. Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren dabei die Untersuchungen zur Populationsstruktur und -dynamik von Gammarus fossarum (Amphipoda, Crustacea). Folgende Populationsvariablen wurden erfasst: Abundanz, Geschlechterverhältnis, Anteil von Juvenilen, Anteil brütender Weibchen, Fekundität, Körperlängen und Infektion mit Acanthocephalen. Erstmalig wurde Intersexualität bei G. fossarum festgestellt. Im Lockwitzbach war der Anteil an Intersexen bei den adulten Gammariden mit etwa 5 - 15 % höher als in der Körsch mit < 1 %. Intersexualität wurde nicht durch die Einleiter induziert. Bei den Intersexen handelt es sich um funktionelle Weibchen. Wodurch dieses Phänomen ausgelöst wird und welche Bedeutung es für die Population hat, ist unbekannt. In den Freilanduntersuchungen wurden im Projekt Xehogamm (Umweltbundesamt Berlin, FKZ 299 65 221/05), in dessen Rahmen diese Dissertation entstand, verschiedene Umweltchemikalien im Bachwasser analysiert. Bei Vertebraten ist eine östrogene Wirksamkeit dieser Substanzen bekannt oder wird vermutet. In den Gammaridenpopulationen unterhalb der Klärwerkseinleiter waren wichtige populationsrelevante Variablen im Vergleich zu oberhalb verändert. An der unteren Probenahmestelle bei der Körsch war der Anteil der Juvenilen mit der kleinsten Körperlänge sowie der Anteil brütender Weibchen erniedrigt. Tendenziell traf dies auch für die untere Probenahmestelle beim Lockwitzbach zu. Bei der Körsch ist außerdem der frühere Beginn der herbstlichen Reproduktionspause und die geringere Körperlänge adulter Gammariden möglicherweise auf endokrine Umweltchemikalien im Wasser des Einleiters zurückzuführen. Von den nachgewiesenen Substanzen wurde eine Einzelsubstanz, Bisphenol A, für ein Fließrinnenexperiment ausgewählt. In künstlichen Fließrinnen im Gewächshaus wurde G. fossarum paarweise, in Gruppen sowie als größenstrukturierte Population in der Fließrinne selbst über 103 Tage exponiert, und verschiedene Populationsvariablen wurden erfasst. Die Nominalkonzentrationen von Bisphenol A in drei Fließrinnen betrugen 5, 50 und 500 µg/L. In den ersten drei aufeinanderfolgenden Bruten zeigte sich in der höchsten Bisphenol A-Konzentration die größte Brutgröße. Im weiteren Verlauf des Experiments übte Bisphenol A einen hemmenden Einfluss auf die Reproduktion der Gammariden aus. Basierend auf den Nominalkonzentrationen wurden folgende EC10-Werte berechnet: Anteil reproduzierender Weibchen für die 4. Brut (bei Gammaridenpaaren): 22 µg/L, Brutgröße der 4. Brut (bei Gammaridenpaaren): 11 µg/L, Anteil brütender Weibchen (Population): 212 µg/L und Anteil Juveniler (Population): 153 µg/L Bisphenol A. Die EC10-Werte basierend auf Effektivkonzentrationen für dieselben Endpunkte betragen: bei den Paaren 1,1 µg/L (reproduzierende Weibchen) und 0,5 µg/L (Brutgröße), in der Population 10 µg/L (Anteil brütender Weibchen und Anteil Juveniler). Im Fließrinnenexperiment wurde Bisphenol A zwar in höheren Konzentrationen als im Freiland vorhanden eingesetzt, die beobachteten Effekte weisen jedoch in dieselbe Richtung wie die Effekte im Freiland. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch die Effekte im Freiland auf einer endokrinen Wirkung von Umweltchemikalien beruhen könnten. Zusätzlich wurde der Einfluss von Bisphenol A auf die Osmoregulation bei G. lacustris untersucht, wobei unterschiedliche Effekte auf die Natrium- und Calciumkonzentration, nicht jedoch auf die Osmolalität, in der Hämolymphe nachgewiesen wurden. Anlage: Rohdaten (3,87 MB)- Nutzung: Referat Informationsvermittlung der SLUB

Bei zwei Fließgewässern (Lockwitzbach und Körsch) wurde ein Expositions- und Effektmonitoring an Probenahmestellen jeweils ober- und unterhalb des Einleiters eines kommunalen Klärwerks über einen Zeitraum von zwei Jahren durchgeführt. Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren dabei die Untersuchungen zur Populationsstruktur und -dynamik von Gammarus fossarum (Amphipoda, Crustacea). Folgende Populationsvariablen wurden erfasst: Abundanz, Geschlechterverhältnis, Anteil von Juvenilen, Anteil brütender Weibchen, Fekundität, Körperlängen und Infektion mit Acanthocephalen. Erstmalig wurde Intersexualität bei G. fossarum festgestellt. Im Lockwitzbach war der Anteil an Intersexen bei den adulten Gammariden mit etwa 5 - 15 % höher als in der Körsch mit < 1 %. Intersexualität wurde nicht durch die Einleiter induziert. Bei den Intersexen handelt es sich um funktionelle Weibchen. Wodurch dieses Phänomen ausgelöst wird und welche Bedeutung es für die Population hat, ist unbekannt. In den Freilanduntersuchungen wurden im Projekt Xehogamm (Umweltbundesamt Berlin, FKZ 299 65 221/05), in dessen Rahmen diese Dissertation entstand, verschiedene Umweltchemikalien im Bachwasser analysiert. Bei Vertebraten ist eine östrogene Wirksamkeit dieser Substanzen bekannt oder wird vermutet. In den Gammaridenpopulationen unterhalb der Klärwerkseinleiter waren wichtige populationsrelevante Variablen im Vergleich zu oberhalb verändert. An der unteren Probenahmestelle bei der Körsch war der Anteil der Juvenilen mit der kleinsten Körperlänge sowie der Anteil brütender Weibchen erniedrigt. Tendenziell traf dies auch für die untere Probenahmestelle beim Lockwitzbach zu. Bei der Körsch ist außerdem der frühere Beginn der herbstlichen Reproduktionspause und die geringere Körperlänge adulter Gammariden möglicherweise auf endokrine Umweltchemikalien im Wasser des Einleiters zurückzuführen. Von den nachgewiesenen Substanzen wurde eine Einzelsubstanz, Bisphenol A, für ein Fließrinnenexperiment ausgewählt. In künstlichen Fließrinnen im Gewächshaus wurde G. fossarum paarweise, in Gruppen sowie als größenstrukturierte Population in der Fließrinne selbst über 103 Tage exponiert, und verschiedene Populationsvariablen wurden erfasst. Die Nominalkonzentrationen von Bisphenol A in drei Fließrinnen betrugen 5, 50 und 500 µg/L. In den ersten drei aufeinanderfolgenden Bruten zeigte sich in der höchsten Bisphenol A-Konzentration die größte Brutgröße. Im weiteren Verlauf des Experiments übte Bisphenol A einen hemmenden Einfluss auf die Reproduktion der Gammariden aus. Basierend auf den Nominalkonzentrationen wurden folgende EC10-Werte berechnet: Anteil reproduzierender Weibchen für die 4. Brut (bei Gammaridenpaaren): 22 µg/L, Brutgröße der 4. Brut (bei Gammaridenpaaren): 11 µg/L, Anteil brütender Weibchen (Population): 212 µg/L und Anteil Juveniler (Population): 153 µg/L Bisphenol A. Die EC10-Werte basierend auf Effektivkonzentrationen für dieselben Endpunkte betragen: bei den Paaren 1,1 µg/L (reproduzierende Weibchen) und 0,5 µg/L (Brutgröße), in der Population 10 µg/L (Anteil brütender Weibchen und Anteil Juveniler). Im Fließrinnenexperiment wurde Bisphenol A zwar in höheren Konzentrationen als im Freiland vorhanden eingesetzt, die beobachteten Effekte weisen jedoch in dieselbe Richtung wie die Effekte im Freiland. Daher kann nicht ausgeschlossen werden, dass auch die Effekte im Freiland auf einer endokrinen Wirkung von Umweltchemikalien beruhen könnten. Zusätzlich wurde der Einfluss von Bisphenol A auf die Osmoregulation bei G. lacustris untersucht, wobei unterschiedliche Effekte auf die Natrium- und Calciumkonzentration, nicht jedoch auf die Osmolalität, in der Hämolymphe nachgewiesen wurden. Anlage: Rohdaten (3,87 MB)- Nutzung: Referat Informationsvermittlung der SLUB