Produtos de glicação avançada, carbamilação e estresse oxidativo contribuem como fatores de risco não tradicionais para a aterosclerose na doença renal crônica (DRC), em parte, por prejudicarem o metabolismo lipídico e por representarem um mecanismo de injúria memorizado ao longo do desenvolvimento da doença renal. A albumina sérica, isolada de animais com DRC, reduz a remoção de colesterol mediado por apoA-I e subfrações de HDL, prejudicando o fluxo de colesterol de macrófagos arteriais ao fígado por meio do transporte reverso de colesterol. Objetivo: Avaliou-se a influência do tratamento com N-acetilcisteína (NAC) em ratos com DRC sobre a concentração plasmática de produtos de oxidação e glicação avançada e o reflexo sobre os efeitos da albumina sérica sobre o efluxo de colesterol e o estresse de retículo endoplasmático em macrófagos. Métodos: Ratos Wistar com 2 meses de idade, pesando aproximadamente 200-250g foram submetidos à nefrectomia 5/6 e mantidos por 60 dias (grupo DRC) com ou sem tratamento com N-acetilcisteína na água (600mg/L), após o 7° dia de indução da DRC (grupo DRC + NAC). Animais controles foram falso-operados (grupo C) e um subgrupo submetido ao tratamento com NAC (C + NAC). No início e no final do estudo foram determinadas as concentrações plasmáticas de glicose, colesterol (CT), triglicérides (TG), ureia, creatinina e na urina, excreção urinária de proteína de 24 h. AGE totais, pentosidina, TBARS (marcador de peroxidação lipídica) e pressão arterial sistólica (PAS) foram determinados no final do estudo. A albumina sérica foi isolada por cromatografia rápida para separação de proteínas e purificada por extração alcoólica. Macrófagos J774 foram incubados por 18 h com as albuminas dos diferentes grupos experimentais para determinação do conteúdo dos receptores de HDL (ABCA-1 e ABCG-1) e de marcadores de estresse de retículo endoplasmático (chaperonas Grp 78, Grp94 e proteína dissulfeto isomerase, PDI) por imunolbot e efluxo de colesterol, mediado por apo A-I e HDL2. Para isto, as células foram previamente enriquecidas com LDL-acetilada e 14C-colesterol. Macrófagos foram também incubados isoladamente com concentrações crescentes de NAC para avaliação do conteúdo dos receptores de HDL. Resultados: Ao final do estudo, o peso corporal foi 10% menor no grupo DRC em comparação ao C (p=0,006). Esta alteração foi prevenida pelo tratamento com NAC. A PAS (mmHg) foi maior no grupo DRC (130 ± 3) em comparação ao grupo DRC+NAC (109±3; p=0,0004). Ureia, creatinina, CT, TG (mg/dL), proteinúria (mg/24 h), AGE total, pentosidina (unidades arbitrárias de fluorescência) e TBARS (nmol/mL) foram maiores nos grupos DRC em comparação ao grupo C (122 ± 8 vs. 41 ± 0,9 ; 0,9 ± 0,07 vs. 0,4 ± 0,03; 151 ± 6 vs. 76 ± 2,7; 83 ± 4 vs. 51,5 ± 3; 46 ± 2,5 vs. 14 ± 0,9; 32620 ± 673 vs. 21750 ± 960; 16700 ± 1370 vs. 5314 ± 129; 6,6 ± 0,5 vs. 2 ± 0,2, respectivamente) (p < 0,0001) e nos grupos DRC+NAC em comparação ao grupo C+NAC (91,4 ± 5 vs. 40 ± 0,9 ; 0,6 ± 0,02 vs. 0,3 ± 0,02; 126 ± 7,5 vs. 76 ± 2,6; 73 ± 6 vs. 68 ± 4; 51 ± 3,5 vs. 18,4 ± 1,5; 24720 ± 1114 vs. 20040 ± 700; 10080 ± 748 vs. 5050 ± 267; 4,5 ± 0,5 vs. 1,8 ± 0,2, respectivamente) (p < 0,0001). No grupo DRC + NAC, PAS, CT, ureia, creatinina, AGE total, pentosidina e TBARS foram, respectivamente, 17% (p=0,0004), 17% (p=0,02), 25% (p=0,02), 33% (p=0,06), 24% (p < 0,0001), 40% (p=0,0008), 28% (p=0,009) menores do que no grupo DRC. A glicemia foi maior nos grupos C + NAC (107+-4,6) e DRC + NAC (107+-2,6) em comparação ao C (96+-1,8) e DRC (98+-1,6), respectivamente. Macrófagos tratados com albumina-DRC apresentaram maior conteúdo de PDI (5 vezes; p=0,02 e 7 vezes p=0,02) e Grp94 (66 %; p =0,02 e 20 %; p=0,02) quando comparados aos tratados com albumina-C ou albumina-DRC + NAC, respectivamente. O conteúdo do receptor ABCA-1 foi menor 87% e 70% (p < 0,01) nos macrófagos tratados com albumina-C+NAC e albumina-DRC, respectivamente em comparação com albumina-C. O conteúdo de ABCG-1 foi, respectivamente, 4 e 7,5 vezes maior nos macrófagos tratados com albumina-C+NAC e albumina-DRC+NAC em comparação as respectivas situações sem tratamento. O efluxo de colesterol mediado por apo A-I foi 59 % e 70 % (p < 0,0001) menor nos macrófagos tratados com albumina-C+NAC e albumina-DRC, respectivamente em comparação a albumina-C. O efluxo de colesterol mediado pela HDL2 foi 52 % maior nos macrófagos tratados com albumina-C+NAC em comparação as células tratadas com albumina-C. Não houve diferença no conteúdo do receptor ABCA-1 nos macrófagos tratados com concentrações crescentes NAC por 8 h. No entanto, após 18 h, o ABCA-1 diminuiu 50 %, 69 % e 72 % nos macrófagos tratados respectivamente com 10 mM, 20 mM e 30 mM de NAC isoladamente em comparação aos macrófagos controles. O conteúdo de ABCG-1 nos macrófagos tratados com NAC, em 8 h e 18 h não sofreu alteração. Conclusão: A N-acetilcisteína reduz produtos de oxidação e glicação avançada no plasma de animais com DRC e previne o estresse de RE em macrófagos, induzido pela albumina isolada destes animais. Apesar de diminuir o conteúdo de ABCA-1 e o efluxo de colesterol mediado por apo A-I, a NAC aumenta o conteúdo de ABCG-1. Desta forma, a NAC pode contribuir para atenuar os efeitos deletérios da albumina modificada na DRC sobre o acúmulo lipídico em macrófagos, contribuindo para a prevenção da aterosclerose / Advanced glycation, carbamylation and oxidative stress c contribute to atherosclerosis in chronic kidney disease (CKD) as nontraditional risk factors. They impair lipid metabolism and promote a long last injury during the development of CKD. Serum albumin isolated from CKD-animals reduces cholesterol efflux mediated by apoa A-I and HDl subfractions, impairing the cholesterol flux from arterial wall macrophage to the the liver by the reverse cholesterol transport (RCT).Objective: In the present study it was analyzed the influence of N-acetylcysteine treatment in CKD-rats in plasma concentration of lipid peroxides and advanced glycation end products and the effect of serum albumin in macrophage cholesterol efflux and endoplasmic reticulum stress development. Methods: Two months male Wistar weighting 200-250g were submitted to a 5/6 nephrectomized maintained for 60 days (CKD group) treated or not with N-acetylcysteine in water (600 mg/L), after the seventh day of CKD induction (CKD+NAC group). Sham animals were false-operated (SHAM group) and a subgroup was treated with NAC (SHAM+NAC group). In the basal and final periods it was determined plasma concentration of glucose, total cholesterol (TC), triglycerides (TG), urea, creatinine and 24h-urinary protein excretion (UPE). Total AGE, pentosidine, thiobarbituric reactive substances (TBARS) levels and systolic blood pressure (SBP) were measured at the final period only. Serum albumin was isolated by fast protein liquid chromatography and purified by alcoholic extraction. J774 macrophage were incubated for 18 h with albumin isolated from the experimental groups in order to determine the content of HDL receptors and markers of endoplasmic reticulum stress (Grp78, Grp94 and protein dissulfide isomerase, PDI) by immunioblot and cholesterol efflux mediated by apo A-I and HDL2. For this, cells were previously overloaded with acetylated LDL and 14C-cholesterol. Macrophage were also incubated with different concentrations of NAC alone in order to measure HDL-receptors and cholesterole efflux. Results: In the end of the protocol, body weight was 10% lower in CKD group in comparison to SHAM group (p=0.006). This change was preserved by treatment with NAC. SBP (mmHg) was higher in CKD group (130±3) in comparison to CKD+NAC (109±3; p=0.0004). Urea, creatinine, TC, TG (mg/dL), UPE (mg/24 h), total AGE, pentosidine (arbitrary units of fluorescence) and TBARS (nmol/mL) were higher in CKD group in comparison to SHAM (122±8 vs. 41 ± 0.9; 0.9 ± 0.07 vs. 0.4 ± 0.03; 151 ± 6 vs. 76±2.7; 83 ± 4 vs. 51.5 ± 3; 46 ± 2.5 vs. 14 ± 0.9; 32620 ± 673 vs. 21750 ± 960; 16700 ± 1370 vs. 5314 ± 129; 6.6 ± 0.5 vs. 2 ± 0.2, respectively) (p < 0.0001) and in CKD+NAC in comparison to C+NAC (91.4±5 vs. 40±0.9 ; 0.6±0.02 vs. 0.3 ± 0.02; 126±7.5 vs. 76 ± 2.6; 73±6 vs. 68±4; 51 ± 3.5 vs. 18.4±1.5; 24720 ± 1114 vs. 20040±700; 10080±748 vs. 5050 ± 267; 4.5±0.5 vs. 1.8±0.2, respectively) (p < 0.0001). In CKD+NAC group, SBP, TC, urea, creatinine, total AGE, pentosidine and TBARS were, respectively, 17 % (p=0.0004), 17 % (p=0.02), 25 % (p=0.02), 33 % (p=0.06), 24 % (p<0.0001), 40 % (p=0.0008), 28 % (p=0.009) lower than CKD group. Glycemia was higher in SHAM+NAC (107+-4.6) and CKD+NAC (107+-2.6) in comparison to SHAM (96+-1.8) and CKD group (98+-1.6), respectively. Macrophages treat with CKD-albumin presented higher content of PDI (5 times; p=0.02 e 7 times p=0.02) and Grp94 (66 %; p=0.02 e 20 %; p=0.02) when compared to SHAM-albumin and CKD+NAC-albumin- treated cells, respectively. ABCA-1 protein content was 87 % and 70 % (p < 0.01) lower in macrophages treated with SHAM+NAC-albumin and CKD-albumin, respectively compared with SHAM-albumin. ABCG-1 protein level was respectively 4 and 7.5 times higher in macrophages treated with SHAM+NAC-albumin and CKD+NAC-albumin in comparison to their respective controls without treatment. The cholesterol efflux mediated by apo A-I was 59 % and 70 % (p < 0.0001) lower in macrophages treated with SHAM+NAC-albumin and CKD-albumin, respectively, when compared to SHAM-albumin. The HDL2-mediated cholesterol efflux was 52 % higher in macrophages treated with SHAM+NAC-albumin compared to macrophages treated with SHAM-albumin. No difference was observed in the ABCA-1 protein level in macrophages treated with crescent concentrations of NAC alone for 8 h. Nonetheless, after 18 h, ABCA-1 was 50 %, 69 % and 72 % reduced in macrophages treated, respectively, with 10 mM, 20 mM and 30 mM NAC in comparison to control cells. ABCG-1 content in macrophages treated with NAC for 8 h and 18 h was not changed. Conclusion: NAC reduces plasma lipid peroxidation and AGE in CKD animals and prevents the endoplasmic reticulum stress induced by CKD-albumin in macrophages. Despite diminishing ABCA-1 and apo A-I-mediated cholesterol efflux, NAC increases ABCG-1. Then, NAC may contribute to attenuate the deleterious effects of the in vivo modified albumin on lipid accumulation in macrophages helping to prevent atherosclerosis in CKD

O remodelamento vascular é um determinante fundamental do lúmen em doenças vasculares, porém os mecanismos envolvidos não estão completamente elucidados. Nós investigamos o papel da chaperona redox residente do retículo endoplasmático Dissulfeto Isomerase Proteica (PDI) e sua fração localizada na superfície celular (peri/epicelular=pecPDI) no calibre e arquitetura vascular durante reparação à lesão. Em artérias ilíacas de coelho submetidas à lesão in vivo, houve importante aumento do mRNA e expressão proteica (~25x aumento 14 dias pós-lesão vs. controle) da PDI. O silenciamento da PDI por siRNA (cultura de órgãos) acentuou o estresse do retículo e apoptose, diferentemente da inibição da pecPDI com anticorpo neutralizante (PDI Ab). Bloqueio in vivo da pecPDI por aplicação de gel perivascular contendo PDI Ab no 12° dia após lesão, com análise após 48 h, promoveu ca.25% redução no calibre vascular analisado por arteriografia e diminuição similar na área total do vaso detectada por tomografia de coerência óptica. Neste processo, não ocorreu alteração no tamanho da neoíntima, indicando assim, que PDI Ab acentuou remodelamento constrictivo. Neutralização da pecPDI promoveu importantes alterações na arquitetura da matriz de colágeno e citoesqueleto, resultando em fibras com orientação invertida e desorganizadas. Diminuição na produção de espécies reativas de oxigênio e óxidos de nitrogênio também ocorreu. Análise de propriedades viscoelásticas nas artérias indicou redução na ductilidade vascular, evidenciada pela menor distância para ruptura. As alterações subcelulares no citoesqueleto observadas in vivo após PDI Ab foram recapituladas em um modelo de estiramento cíclico em células musculares lisas vasculares, com importante redução na formação das fibras de estresse. Em modelo de migração randômica de células musculares lisas, a exposição a PDI Ab reduziu a resiliência de regulação da polaridade. Embora a neutralização da pecPDI não tenha afetado a atividade global de RhoA, ela promoveu alterações no padrão de marcação em resposta ao estiramento, na redistribuição de RhoA na superfície celular e na associação com regiões contendo caveolina. Além disso, em aterosclerose nativa em humanos, a expressão da PDI correlacionou-se inversamente com remodelamento constrictivo. Dessa forma, PDI é fortemente expressa após a lesão e sua fração peri/epicelular remodela a arquitetura da matriz e citoesqueleto, promovendo um efeito anti-remodelamento constrictivo / Whole-vessel remodeling is a critical lumen caliber determinant in vascular disease, but underlying mechanisms are poorly understood. We investigated the role of endoplasmic reticulum chaperone Protein Disulfide Isomerase(PDI) and cell-surface PDI(peri/epicellular=pecPDI) pool in vascular caliber and architecture during vascular repair after injury(AI). After rabbit iliac artery balloon injury, there was marked increase in PDI mRNA and protein (25-fold vs. basal at day 14AI), with increase in both intracellular and pecPDI. Silencing PDI by siRNA (organ culture) induced ER stress augmentation and apoptosis, contrarily to pecPDI neutralization with PDI-antibody(PDI Ab). PecPDI neutralization in vivo with PDIAb-containing perivascular gel from days 12-14AI promoted ca.25% decrease in vascular caliber at arteriography and similar decreases in total vessel circumference at optical coherence tomography, without changing neointima, indicating increased constrictive remodeling. PecPDI neutralization promoted marked changes in collagen and cytoskeleton architecture, with inverted fiber orientation and disorganization. Decreased ROS and nitrogen oxide production also occurred. Viscoelastic artery properties assessment showed decreased ductility, evidenced by decreased distance to rupture. Subcellular cytoskeletal disruption by PDI Ab was recapitulated in vascular smooth muscle cell stretch model, with marked decrease in stress fiber buildup. Also, PDI Ab incubation promoted decreased regulation resilience of vascular smooth muscle migration properties. While pecPDI neutralization did not affect global RhoA activity, there was altered RhoA redistribution to the cell surface and association with caveolin-containing clusters, which mislocalized after stretch. In human coronary atheromas, PDI expression inversely correlated with constrictive remodeling. Thus, strongly-expressed PDI after injury reshapes matrix and cytoskeleton architecture to support an anticonstrictive remodeling effect

Produtos de glicação avançada, carbamilação e estresse oxidativo contribuem como fatores de risco não tradicionais para a aterosclerose na doença renal crônica (DRC), em parte, por prejudicarem o metabolismo lipídico e por representarem um mecanismo de injúria memorizado ao longo do desenvolvimento da doença renal. A albumina sérica, isolada de animais com DRC, reduz a remoção de colesterol mediado por apoA-I e subfrações de HDL, prejudicando o fluxo de colesterol de macrófagos arteriais ao fígado por meio do transporte reverso de colesterol. Objetivo: Avaliou-se a influência do tratamento com N-acetilcisteína (NAC) em ratos com DRC sobre a concentração plasmática de produtos de oxidação e glicação avançada e o reflexo sobre os efeitos da albumina sérica sobre o efluxo de colesterol e o estresse de retículo endoplasmático em macrófagos. Métodos: Ratos Wistar com 2 meses de idade, pesando aproximadamente 200-250g foram submetidos à nefrectomia 5/6 e mantidos por 60 dias (grupo DRC) com ou sem tratamento com N-acetilcisteína na água (600mg/L), após o 7° dia de indução da DRC (grupo DRC + NAC). Animais controles foram falso-operados (grupo C) e um subgrupo submetido ao tratamento com NAC (C + NAC). No início e no final do estudo foram determinadas as concentrações plasmáticas de glicose, colesterol (CT), triglicérides (TG), ureia, creatinina e na urina, excreção urinária de proteína de 24 h. AGE totais, pentosidina, TBARS (marcador de peroxidação lipídica) e pressão arterial sistólica (PAS) foram determinados no final do estudo. A albumina sérica foi isolada por cromatografia rápida para separação de proteínas e purificada por extração alcoólica. Macrófagos J774 foram incubados por 18 h com as albuminas dos diferentes grupos experimentais para determinação do conteúdo dos receptores de HDL (ABCA-1 e ABCG-1) e de marcadores de estresse de retículo endoplasmático (chaperonas Grp 78, Grp94 e proteína dissulfeto isomerase, PDI) por imunolbot e efluxo de colesterol, mediado por apo A-I e HDL2. Para isto, as células foram previamente enriquecidas com LDL-acetilada e 14C-colesterol. Macrófagos foram também incubados isoladamente com concentrações crescentes de NAC para avaliação do conteúdo dos receptores de HDL. Resultados: Ao final do estudo, o peso corporal foi 10% menor no grupo DRC em comparação ao C (p=0,006). Esta alteração foi prevenida pelo tratamento com NAC. A PAS (mmHg) foi maior no grupo DRC (130 ± 3) em comparação ao grupo DRC+NAC (109±3; p=0,0004). Ureia, creatinina, CT, TG (mg/dL), proteinúria (mg/24 h), AGE total, pentosidina (unidades arbitrárias de fluorescência) e TBARS (nmol/mL) foram maiores nos grupos DRC em comparação ao grupo C (122 ± 8 vs. 41 ± 0,9 ; 0,9 ± 0,07 vs. 0,4 ± 0,03; 151 ± 6 vs. 76 ± 2,7; 83 ± 4 vs. 51,5 ± 3; 46 ± 2,5 vs. 14 ± 0,9; 32620 ± 673 vs. 21750 ± 960; 16700 ± 1370 vs. 5314 ± 129; 6,6 ± 0,5 vs. 2 ± 0,2, respectivamente) (p < 0,0001) e nos grupos DRC+NAC em comparação ao grupo C+NAC (91,4 ± 5 vs. 40 ± 0,9 ; 0,6 ± 0,02 vs. 0,3 ± 0,02; 126 ± 7,5 vs. 76 ± 2,6; 73 ± 6 vs. 68 ± 4; 51 ± 3,5 vs. 18,4 ± 1,5; 24720 ± 1114 vs. 20040 ± 700; 10080 ± 748 vs. 5050 ± 267; 4,5 ± 0,5 vs. 1,8 ± 0,2, respectivamente) (p < 0,0001). No grupo DRC + NAC, PAS, CT, ureia, creatinina, AGE total, pentosidina e TBARS foram, respectivamente, 17% (p=0,0004), 17% (p=0,02), 25% (p=0,02), 33% (p=0,06), 24% (p < 0,0001), 40% (p=0,0008), 28% (p=0,009) menores do que no grupo DRC. A glicemia foi maior nos grupos C + NAC (107+-4,6) e DRC + NAC (107+-2,6) em comparação ao C (96+-1,8) e DRC (98+-1,6), respectivamente. Macrófagos tratados com albumina-DRC apresentaram maior conteúdo de PDI (5 vezes; p=0,02 e 7 vezes p=0,02) e Grp94 (66 %; p =0,02 e 20 %; p=0,02) quando comparados aos tratados com albumina-C ou albumina-DRC + NAC, respectivamente. O conteúdo do receptor ABCA-1 foi menor 87% e 70% (p < 0,01) nos macrófagos tratados com albumina-C+NAC e albumina-DRC, respectivamente em comparação com albumina-C. O conteúdo de ABCG-1 foi, respectivamente, 4 e 7,5 vezes maior nos macrófagos tratados com albumina-C+NAC e albumina-DRC+NAC em comparação as respectivas situações sem tratamento. O efluxo de colesterol mediado por apo A-I foi 59 % e 70 % (p < 0,0001) menor nos macrófagos tratados com albumina-C+NAC e albumina-DRC, respectivamente em comparação a albumina-C. O efluxo de colesterol mediado pela HDL2 foi 52 % maior nos macrófagos tratados com albumina-C+NAC em comparação as células tratadas com albumina-C. Não houve diferença no conteúdo do receptor ABCA-1 nos macrófagos tratados com concentrações crescentes NAC por 8 h. No entanto, após 18 h, o ABCA-1 diminuiu 50 %, 69 % e 72 % nos macrófagos tratados respectivamente com 10 mM, 20 mM e 30 mM de NAC isoladamente em comparação aos macrófagos controles. O conteúdo de ABCG-1 nos macrófagos tratados com NAC, em 8 h e 18 h não sofreu alteração. Conclusão: A N-acetilcisteína reduz produtos de oxidação e glicação avançada no plasma de animais com DRC e previne o estresse de RE em macrófagos, induzido pela albumina isolada destes animais. Apesar de diminuir o conteúdo de ABCA-1 e o efluxo de colesterol mediado por apo A-I, a NAC aumenta o conteúdo de ABCG-1. Desta forma, a NAC pode contribuir para atenuar os efeitos deletérios da albumina modificada na DRC sobre o acúmulo lipídico em macrófagos, contribuindo para a prevenção da aterosclerose / Advanced glycation, carbamylation and oxidative stress c contribute to atherosclerosis in chronic kidney disease (CKD) as nontraditional risk factors. They impair lipid metabolism and promote a long last injury during the development of CKD. Serum albumin isolated from CKD-animals reduces cholesterol efflux mediated by apoa A-I and HDl subfractions, impairing the cholesterol flux from arterial wall macrophage to the the liver by the reverse cholesterol transport (RCT).Objective: In the present study it was analyzed the influence of N-acetylcysteine treatment in CKD-rats in plasma concentration of lipid peroxides and advanced glycation end products and the effect of serum albumin in macrophage cholesterol efflux and endoplasmic reticulum stress development. Methods: Two months male Wistar weighting 200-250g were submitted to a 5/6 nephrectomized maintained for 60 days (CKD group) treated or not with N-acetylcysteine in water (600 mg/L), after the seventh day of CKD induction (CKD+NAC group). Sham animals were false-operated (SHAM group) and a subgroup was treated with NAC (SHAM+NAC group). In the basal and final periods it was determined plasma concentration of glucose, total cholesterol (TC), triglycerides (TG), urea, creatinine and 24h-urinary protein excretion (UPE). Total AGE, pentosidine, thiobarbituric reactive substances (TBARS) levels and systolic blood pressure (SBP) were measured at the final period only. Serum albumin was isolated by fast protein liquid chromatography and purified by alcoholic extraction. J774 macrophage were incubated for 18 h with albumin isolated from the experimental groups in order to determine the content of HDL receptors and markers of endoplasmic reticulum stress (Grp78, Grp94 and protein dissulfide isomerase, PDI) by immunioblot and cholesterol efflux mediated by apo A-I and HDL2. For this, cells were previously overloaded with acetylated LDL and 14C-cholesterol. Macrophage were also incubated with different concentrations of NAC alone in order to measure HDL-receptors and cholesterole efflux. Results: In the end of the protocol, body weight was 10% lower in CKD group in comparison to SHAM group (p=0.006). This change was preserved by treatment with NAC. SBP (mmHg) was higher in CKD group (130±3) in comparison to CKD+NAC (109±3; p=0.0004). Urea, creatinine, TC, TG (mg/dL), UPE (mg/24 h), total AGE, pentosidine (arbitrary units of fluorescence) and TBARS (nmol/mL) were higher in CKD group in comparison to SHAM (122±8 vs. 41 ± 0.9; 0.9 ± 0.07 vs. 0.4 ± 0.03; 151 ± 6 vs. 76±2.7; 83 ± 4 vs. 51.5 ± 3; 46 ± 2.5 vs. 14 ± 0.9; 32620 ± 673 vs. 21750 ± 960; 16700 ± 1370 vs. 5314 ± 129; 6.6 ± 0.5 vs. 2 ± 0.2, respectively) (p < 0.0001) and in CKD+NAC in comparison to C+NAC (91.4±5 vs. 40±0.9 ; 0.6±0.02 vs. 0.3 ± 0.02; 126±7.5 vs. 76 ± 2.6; 73±6 vs. 68±4; 51 ± 3.5 vs. 18.4±1.5; 24720 ± 1114 vs. 20040±700; 10080±748 vs. 5050 ± 267; 4.5±0.5 vs. 1.8±0.2, respectively) (p < 0.0001). In CKD+NAC group, SBP, TC, urea, creatinine, total AGE, pentosidine and TBARS were, respectively, 17 % (p=0.0004), 17 % (p=0.02), 25 % (p=0.02), 33 % (p=0.06), 24 % (p<0.0001), 40 % (p=0.0008), 28 % (p=0.009) lower than CKD group. Glycemia was higher in SHAM+NAC (107+-4.6) and CKD+NAC (107+-2.6) in comparison to SHAM (96+-1.8) and CKD group (98+-1.6), respectively. Macrophages treat with CKD-albumin presented higher content of PDI (5 times; p=0.02 e 7 times p=0.02) and Grp94 (66 %; p=0.02 e 20 %; p=0.02) when compared to SHAM-albumin and CKD+NAC-albumin- treated cells, respectively. ABCA-1 protein content was 87 % and 70 % (p < 0.01) lower in macrophages treated with SHAM+NAC-albumin and CKD-albumin, respectively compared with SHAM-albumin. ABCG-1 protein level was respectively 4 and 7.5 times higher in macrophages treated with SHAM+NAC-albumin and CKD+NAC-albumin in comparison to their respective controls without treatment. The cholesterol efflux mediated by apo A-I was 59 % and 70 % (p < 0.0001) lower in macrophages treated with SHAM+NAC-albumin and CKD-albumin, respectively, when compared to SHAM-albumin. The HDL2-mediated cholesterol efflux was 52 % higher in macrophages treated with SHAM+NAC-albumin compared to macrophages treated with SHAM-albumin. No difference was observed in the ABCA-1 protein level in macrophages treated with crescent concentrations of NAC alone for 8 h. Nonetheless, after 18 h, ABCA-1 was 50 %, 69 % and 72 % reduced in macrophages treated, respectively, with 10 mM, 20 mM and 30 mM NAC in comparison to control cells. ABCG-1 content in macrophages treated with NAC for 8 h and 18 h was not changed. Conclusion: NAC reduces plasma lipid peroxidation and AGE in CKD animals and prevents the endoplasmic reticulum stress induced by CKD-albumin in macrophages. Despite diminishing ABCA-1 and apo A-I-mediated cholesterol efflux, NAC increases ABCG-1. Then, NAC may contribute to attenuate the deleterious effects of the in vivo modified albumin on lipid accumulation in macrophages helping to prevent atherosclerosis in CKD

O remodelamento vascular é um determinante fundamental do lúmen em doenças vasculares, porém os mecanismos envolvidos não estão completamente elucidados. Nós investigamos o papel da chaperona redox residente do retículo endoplasmático Dissulfeto Isomerase Proteica (PDI) e sua fração localizada na superfície celular (peri/epicelular=pecPDI) no calibre e arquitetura vascular durante reparação à lesão. Em artérias ilíacas de coelho submetidas à lesão in vivo, houve importante aumento do mRNA e expressão proteica (~25x aumento 14 dias pós-lesão vs. controle) da PDI. O silenciamento da PDI por siRNA (cultura de órgãos) acentuou o estresse do retículo e apoptose, diferentemente da inibição da pecPDI com anticorpo neutralizante (PDI Ab). Bloqueio in vivo da pecPDI por aplicação de gel perivascular contendo PDI Ab no 12° dia após lesão, com análise após 48 h, promoveu ca.25% redução no calibre vascular analisado por arteriografia e diminuição similar na área total do vaso detectada por tomografia de coerência óptica. Neste processo, não ocorreu alteração no tamanho da neoíntima, indicando assim, que PDI Ab acentuou remodelamento constrictivo. Neutralização da pecPDI promoveu importantes alterações na arquitetura da matriz de colágeno e citoesqueleto, resultando em fibras com orientação invertida e desorganizadas. Diminuição na produção de espécies reativas de oxigênio e óxidos de nitrogênio também ocorreu. Análise de propriedades viscoelásticas nas artérias indicou redução na ductilidade vascular, evidenciada pela menor distância para ruptura. As alterações subcelulares no citoesqueleto observadas in vivo após PDI Ab foram recapituladas em um modelo de estiramento cíclico em células musculares lisas vasculares, com importante redução na formação das fibras de estresse. Em modelo de migração randômica de células musculares lisas, a exposição a PDI Ab reduziu a resiliência de regulação da polaridade. Embora a neutralização da pecPDI não tenha afetado a atividade global de RhoA, ela promoveu alterações no padrão de marcação em resposta ao estiramento, na redistribuição de RhoA na superfície celular e na associação com regiões contendo caveolina. Além disso, em aterosclerose nativa em humanos, a expressão da PDI correlacionou-se inversamente com remodelamento constrictivo. Dessa forma, PDI é fortemente expressa após a lesão e sua fração peri/epicelular remodela a arquitetura da matriz e citoesqueleto, promovendo um efeito anti-remodelamento constrictivo / Whole-vessel remodeling is a critical lumen caliber determinant in vascular disease, but underlying mechanisms are poorly understood. We investigated the role of endoplasmic reticulum chaperone Protein Disulfide Isomerase(PDI) and cell-surface PDI(peri/epicellular=pecPDI) pool in vascular caliber and architecture during vascular repair after injury(AI). After rabbit iliac artery balloon injury, there was marked increase in PDI mRNA and protein (25-fold vs. basal at day 14AI), with increase in both intracellular and pecPDI. Silencing PDI by siRNA (organ culture) induced ER stress augmentation and apoptosis, contrarily to pecPDI neutralization with PDI-antibody(PDI Ab). PecPDI neutralization in vivo with PDIAb-containing perivascular gel from days 12-14AI promoted ca.25% decrease in vascular caliber at arteriography and similar decreases in total vessel circumference at optical coherence tomography, without changing neointima, indicating increased constrictive remodeling. PecPDI neutralization promoted marked changes in collagen and cytoskeleton architecture, with inverted fiber orientation and disorganization. Decreased ROS and nitrogen oxide production also occurred. Viscoelastic artery properties assessment showed decreased ductility, evidenced by decreased distance to rupture. Subcellular cytoskeletal disruption by PDI Ab was recapitulated in vascular smooth muscle cell stretch model, with marked decrease in stress fiber buildup. Also, PDI Ab incubation promoted decreased regulation resilience of vascular smooth muscle migration properties. While pecPDI neutralization did not affect global RhoA activity, there was altered RhoA redistribution to the cell surface and association with caveolin-containing clusters, which mislocalized after stretch. In human coronary atheromas, PDI expression inversely correlated with constrictive remodeling. Thus, strongly-expressed PDI after injury reshapes matrix and cytoskeleton architecture to support an anticonstrictive remodeling effect

A migração de células musculares lisas (VSMC) da camada média do vaso para a íntima é essencial para vasculogênese e contribui para o processo de aterosclerose e estenose após lesão por cateter-balão, caracterizando-se como um importante alvo terapêutico. Diversos trabalhos já demonstraram que fatores de crescimento (como PDGF e FGF) estimulam a migração de VSMC, inclusive, muitos desses fatores de crescimento induzem sinalização redox associadas à geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) (ex. Nox1 NADPH oxidase). Nosso grupo já descreveu interações físicas e regulação funcional da NADPH oxidase por uma chaperona redox do retículo endoplasmático, a Dissulfeto Isomerase Protéica (PDI). Contudo, tanto a relevância fisiológica como os mecanismos desta interação ainda não estão claros. O objetivo geral do presente trabalho é investigar por meio de experimentos de perda e ganho de função da PDI, a importância da PDI na migração celular associada à ativação do complexo NADPH oxidase, bem como possíveis mecanismos envolvidos na interação entre a PDI e esse complexo enzimático durante a migração celular. Os objetivos específicos são: i) avaliar o efeito do silenciamento da PDI, bem como da expressão forçada de PDI wild type na migração de VSMC in vitro; ii) analisar o efeito da transfecção de siRNA da PDI atividade e expressão de distintas isoformas da NADPH oxidase vascular e produção de ROS induzida por PDGF; iii) investigar o envolvimento de RhoGTPases na regulação do complexo NADPH oxidase pela PDI. No presente trabalho, mostramos que o PDGF induz redistribuição da PDI e aumento da produção de ROS. O silenciamento da PDI inibe a produção de ROS e a expressão do mRNA da Nox1, sem alterar a expressão do mRNA da Nox4. Mais ainda, o silenciamento da PDI reduz a migração celular induzida por PDGF, em diferentes modelos de migração, enquanto a super-expressão da PDI induz aumento espontâneo da migração na condição basal. Análise utilizando métodos de Biologia de Sistemas de redes de interação física proteína-proteína em bancos de dados e técnicas de análise de centralidade, topologia e ontologia gênica indicou forte convergência entre PDI e proteínas da família das pequenas RhoGTPases e seus reguladores. Em VSMC com silenciamento da PDI, a presença do PDGF induziu uma redução na atividade de Rac1 e RhoA, sem alterar a expressão total destas proteínas. Estudos mostraram que a PDI colocaliza com Rac1 na região perinuclear e co-imunoprecipita com Rac1 e RhoA, tanto na presença como na ausência de PDGF. Além disso, ocorreu a interação entre PDI e o regulador de GTPases RhoGDI (inibidor da dissociação da guanina) na condição basal (por microscopia confocal e co-imunoprecipitação), diminuída após estimulo com PDGF. O silenciamento da PDI induziu ainda alterações em estrutura de citoesqueleto: desorganização das fibras de estresse, e redução no número e tamanho de adesões focais e vesículas de adesão marcadas por RhoGDI e Rac1. Assim, os dados apresentados no presente trabalho sugerem que a PDI sustenta a migração de VSMC dependente de sinalização redox e RhoGTPases. Além disso, RhoGTPases podem ser um alvo proximal importante mediando a convergência entre PDI e o complexo NADPH oxidase / Vascular Smooth Muscle Cell (VSMC) migration into vessel neointima is a therapeutic target for atherosclerosis and post-injury restenosis. NADPH oxidase-derived oxidants synergize with growth factors to support VSMC migration. We described interaction between NADPH oxidases and the endoplasmic reticulum redox chaperone Protein Disulfide Isomerase (PDI) in many cell types. However, physiological implications as well as mechanisms of such association are yet unclear. The aim of the present work was to investigate, througth experiments of gain or loss of PDI function, the importance of PDI in VSMC migration associated to NADPH oxidase. The specific aims were: i) to evaluate effects of PDI silencing or PDI overexpression in VSMC migration in vitro; ii) to evaluate effects of PDI silencing on PDGF-induced NADPH oxidase isoform expression and ROS production; iii) to evaluate the involvement of RhoGTPases on NADPH oxidase regulation by PDI. We show here that PDGF promoted subcellular redistribution of PDI concomitant to ROS production and that siRNA-mediated PDI silencing inhibited such ROS production, while near-totally suppressing the increase in Nox1 expression, with no change in Nox4. Furthermore, PDI silencing inhibited PDGF-induced VSMC migration assessed by distinct methods, while PDI overexpression increased spontaneous basal VSMC migration. To address possible mechanisms of PDI effects, we searched for PDI interactome by PPPI networks, which indicated convergence with small GTPases and their regulator RhoGDI. PDI silencing decreased PDGF-induced Rac1 and RhoA activities, without change in their expression. PDI displayed small detectable points of perinuclear co-localization with Rac1 and co-immunoprecipitated with Rac1 and RhoA in a PDGF-independent way. Moreover, there was PDI association with RhoGDI at baseline (confocal and co-immunoprecipitation), decreased after PDGF. Of note, PDI silencing promoted strong cytoskeletal changes: branched stress fiber disorganization, markedly decreased number of focal adhesions and reduced number of RhoGDI-containing vesicular recycling adhesion structures. Overall, these data suggest that PDI is required to support redox and GTPase-dependent VSMC migration. Moreover, RhoGTPases are a potential upstream target mediating the convergence between PDI and NADPH oxidase

INTRODUÇÃO: A esteato-hepatite não alcóolica (NASH) é considerada problema de saúde pública, dada sua crescente incidência e seu possível papel na carcinogênese hepato-celular. Terapias atuais envolvem alterações de dieta e estilo de vida, mas têm seu resultado prejudicado pela baixa aderência dos pacientes. Abordagens farmacológicas ainda são precárias. Uma grande dificuldade no manejo de NASH reside no limitado entendimento de sua fisiopatologia, que parece envolver complexas alterações metabólicas e inflamatórias. Ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 (AGPIs n-3) são reconhecidos por suas propriedades moduladoras do metabolismo lipídico e da inflamação, e estão diminuídos em pacientes com NASH. O uso clínico de AGPIs n-3 tem mostrado benefício no controle da esteatose e na produção de marcadores da resposta metabólica e inflamatória em NASH, embora com algumas observações contraditórias. A compreensão de mecanismos moleculares modulados por AGPIs n-3 em NASH podem ser úteis para identificar alvos moleculares que auxiliem no desenho de intervenção farmacológica efetiva. Nesse sentido, ciências ômicas são particularmente úteis para a compreensão de mecanismos moleculares com alto valor translacional para a prática clínica e podem contribuir para a identificação desses alvos. OBJETIVO: O presente estudo avaliou a resposta proteômica hepática e lipidômica plasmática de pacientes com NASH perante o tratamento com AGPIs n-3. MÉTODO: As avaliações proteômicas e lipidômicas foram desenvolvidas por espectometria de massas e/ou cromatografia gasosa em amostras de biópsias hepáticas e plasma coletadas de pacientes envolvidos em estudo preliminar, realizado no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O referido estudo envolveu pacientes adultos, de ambos os sexos e com diagnóstico de NASH tratados diariamente, durante 6 meses, com 3 cápsulas contendo mistura de óleo de linhaça e óleo de peixe [0,315 g AGPIs: sendo 0,065 g de ácido eicosapentaenoico (EPA), 0,050 g de docosahexaenoico (DHA) e 0,2 g alfa linolênico (ALA) por cápsula]. Pacientes, após o tratamento com AGPIs n-3, que apresentaram altas concentrações plasmáticas de ALA e/ou DHA e/ou baixas de ácido araquidônico (AA) mostraram melhora parcial das alterações de histologia hepática. No presente estudo, avaliamos as vias proteômicas e marcadores lipidômicos resultantes do tratamento com AGPIs n-3. Isto foi feito por meio da comparação, antes (grupo AT) e depois do tratamento (grupo DT), de pools de tecido hepático (análise por interactoma) e amostras de plasma (OPLS-DA). RESULTADOS: Foram identificadas proteínas hepáticas, exclusivamente e/ou alteradamente expressas, no grupo DT, relacionadas com vias de matriz celular, metabolismo lipídico, de estresse oxidativo, e de retículo endoplasmático e respiração celular. Com excessão da via de matriz celular, a análise do interactoma revelou alteração funcional significativa das vias moduladas por essas proteínas. Em conjunto, essas alterações foram sugestivas de diminuição de lipotoxicidade, estresse oxidativo e respiração anaeróbia, e aumento de respiração aeróbia após tratamento com AGPIs n-3. Estas modificações são marcadores potenciais de melhora de função de retículo endoplasmático e mitocondrial. Em adição, após o tratamento com AGPIs n-3, o perfil lipidômico plasmático mostrou-se alterado com significativo aumento de glicerofosfolípides, ALA e EPA, e diminuição de ácido araquidônico (n-6) e da razão AGPIs n-6/n-3. Estes dados são concordantes com potencial melhora das funções de retículo endoplasmático e mitocondriais. CONCLUSÃO: O tratamento com AGPIs n-3 em pacientes com NASH influenciou favoravelmente o perfil proteômico hepático e lipidômico sistêmico. Em conjunto, essas alterações sugerem melhora da função de retículo endoplasmático e mitocondrial, com potencial impacto na homeostase celular, por meio da modulação de diferentes vias biológicas / INTRODUCTION: Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is considered a public health problem, given its increasing incidence and its possible role in hepatocellular carcinogenesis. Current therapies involve diet and lifestyle changes, but its applicability suffers from low patients adherence. Pharmacological approaches are still missing. A main difficulty in the NASH management lies in the limited understanding of its pathophysiology, which seems to involve complex metabolic and inflammatory disturbances. Omega-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFAs) are recognized for its modulatory properties on lipid metabolism and inflammation and are decreased in patients with NASH. The clinical use of these PUFAs has shown benefit in controlling steatosis and the production of metabolic and inflammatory response markers in NASH, despite some conflicting reports. Understanding mechanisms modulated by n-3 PUFAs in NASH may be useful for identifying molecular targets that could assist in the design of effective pharmacologic interventions. In this sense, omics sciences are particularly useful for understanding molecular mechanisms with high translational value to clinical practice and may contribute to the identification of these targets. AIM: This study evaluated the liver proteomic and plasma lipidomics responses of patients with NASH towards treatment with n-3 PUFAs. METHODS: The proteomic and lipidomic evaluations were studied by mass spectrometry and / or gas chromatography in samples from liver biopsies and plasma collected from patients enrolled in a preliminary clinical trial of the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. This study involved adult patients of both sexes diagnosed with NASH treated daily for 6 months, with 3 capsules containing a mixture of linseed and fish oils [0.315 g PUFAs: 0.065 g eicosapentaenoic acid (EPA) , 0.050 g docosahexaenoic (DHA) and 0.2 g alpha linolenic acid (ALA) per capsule]. Patients, after treatment with n-3 PUFAs, with higher concentrations of ALA and DHA and lower arachidonic acid (AA) showed improvement of liver histology alterations. In the present study we evaluated the proteomics pathways and lipidomics markers resulted from treatment with PUFAs n-3. This was performed by comparing, before (BT group) and after (AT group) treatment, liver tissue pools (analysis interactome) and plasma samples (OPLS-DA). RESULTS: It was identified, in a way exclusive and altered, the expressed liver proteins in AT group, related to pathways of cellular matrix, lipid metabolism, oxidative and endoplasmic reticulum stress and cellular respiration. With the exception of cell matrix, the analysis of the interactome revealed substantial functional alterations of the pathways modulated by these proteins. Together, these changes were suggestive of decreased lipotoxicity, oxidative stress and anaerobic respiration and increased aerobic respiration following treatment with PUFAs n-3. These modifications are potential markers of endoplasmic reticulum and mitochondrial functions improvement. In addition, after treatment with n-3 PUFAs, the lipidomics profile was modified, with significant increase in glycerophospholipids, ALA and EPA and decrease of arachidonic acid (AA) and n-6/n-3 AGPIs ratio. These findings are concordant with potential improvement of reticulum endoplasmic and mitochondrial functions. CONCLUSION: In patients with NASH the treatment with n-3 PUFAs favorably influenced hepatic proteomic and systemic lipidomics profiles. Together, these changes suggest improved endoplasmic reticulum and mitochondrial functions, with potential impact on cellular homeostasis through the modulation of different biological pathways

INTRODUÇÃO: A esteato-hepatite não alcóolica (NASH) é considerada problema de saúde pública, dada sua crescente incidência e seu possível papel na carcinogênese hepato-celular. Terapias atuais envolvem alterações de dieta e estilo de vida, mas têm seu resultado prejudicado pela baixa aderência dos pacientes. Abordagens farmacológicas ainda são precárias. Uma grande dificuldade no manejo de NASH reside no limitado entendimento de sua fisiopatologia, que parece envolver complexas alterações metabólicas e inflamatórias. Ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 (AGPIs n-3) são reconhecidos por suas propriedades moduladoras do metabolismo lipídico e da inflamação, e estão diminuídos em pacientes com NASH. O uso clínico de AGPIs n-3 tem mostrado benefício no controle da esteatose e na produção de marcadores da resposta metabólica e inflamatória em NASH, embora com algumas observações contraditórias. A compreensão de mecanismos moleculares modulados por AGPIs n-3 em NASH podem ser úteis para identificar alvos moleculares que auxiliem no desenho de intervenção farmacológica efetiva. Nesse sentido, ciências ômicas são particularmente úteis para a compreensão de mecanismos moleculares com alto valor translacional para a prática clínica e podem contribuir para a identificação desses alvos. OBJETIVO: O presente estudo avaliou a resposta proteômica hepática e lipidômica plasmática de pacientes com NASH perante o tratamento com AGPIs n-3. MÉTODO: As avaliações proteômicas e lipidômicas foram desenvolvidas por espectometria de massas e/ou cromatografia gasosa em amostras de biópsias hepáticas e plasma coletadas de pacientes envolvidos em estudo preliminar, realizado no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O referido estudo envolveu pacientes adultos, de ambos os sexos e com diagnóstico de NASH tratados diariamente, durante 6 meses, com 3 cápsulas contendo mistura de óleo de linhaça e óleo de peixe [0,315 g AGPIs: sendo 0,065 g de ácido eicosapentaenoico (EPA), 0,050 g de docosahexaenoico (DHA) e 0,2 g alfa linolênico (ALA) por cápsula]. Pacientes, após o tratamento com AGPIs n-3, que apresentaram altas concentrações plasmáticas de ALA e/ou DHA e/ou baixas de ácido araquidônico (AA) mostraram melhora parcial das alterações de histologia hepática. No presente estudo, avaliamos as vias proteômicas e marcadores lipidômicos resultantes do tratamento com AGPIs n-3. Isto foi feito por meio da comparação, antes (grupo AT) e depois do tratamento (grupo DT), de pools de tecido hepático (análise por interactoma) e amostras de plasma (OPLS-DA). RESULTADOS: Foram identificadas proteínas hepáticas, exclusivamente e/ou alteradamente expressas, no grupo DT, relacionadas com vias de matriz celular, metabolismo lipídico, de estresse oxidativo, e de retículo endoplasmático e respiração celular. Com excessão da via de matriz celular, a análise do interactoma revelou alteração funcional significativa das vias moduladas por essas proteínas. Em conjunto, essas alterações foram sugestivas de diminuição de lipotoxicidade, estresse oxidativo e respiração anaeróbia, e aumento de respiração aeróbia após tratamento com AGPIs n-3. Estas modificações são marcadores potenciais de melhora de função de retículo endoplasmático e mitocondrial. Em adição, após o tratamento com AGPIs n-3, o perfil lipidômico plasmático mostrou-se alterado com significativo aumento de glicerofosfolípides, ALA e EPA, e diminuição de ácido araquidônico (n-6) e da razão AGPIs n-6/n-3. Estes dados são concordantes com potencial melhora das funções de retículo endoplasmático e mitocondriais. CONCLUSÃO: O tratamento com AGPIs n-3 em pacientes com NASH influenciou favoravelmente o perfil proteômico hepático e lipidômico sistêmico. Em conjunto, essas alterações sugerem melhora da função de retículo endoplasmático e mitocondrial, com potencial impacto na homeostase celular, por meio da modulação de diferentes vias biológicas / INTRODUCTION: Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is considered a public health problem, given its increasing incidence and its possible role in hepatocellular carcinogenesis. Current therapies involve diet and lifestyle changes, but its applicability suffers from low patients adherence. Pharmacological approaches are still missing. A main difficulty in the NASH management lies in the limited understanding of its pathophysiology, which seems to involve complex metabolic and inflammatory disturbances. Omega-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFAs) are recognized for its modulatory properties on lipid metabolism and inflammation and are decreased in patients with NASH. The clinical use of these PUFAs has shown benefit in controlling steatosis and the production of metabolic and inflammatory response markers in NASH, despite some conflicting reports. Understanding mechanisms modulated by n-3 PUFAs in NASH may be useful for identifying molecular targets that could assist in the design of effective pharmacologic interventions. In this sense, omics sciences are particularly useful for understanding molecular mechanisms with high translational value to clinical practice and may contribute to the identification of these targets. AIM: This study evaluated the liver proteomic and plasma lipidomics responses of patients with NASH towards treatment with n-3 PUFAs. METHODS: The proteomic and lipidomic evaluations were studied by mass spectrometry and / or gas chromatography in samples from liver biopsies and plasma collected from patients enrolled in a preliminary clinical trial of the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. This study involved adult patients of both sexes diagnosed with NASH treated daily for 6 months, with 3 capsules containing a mixture of linseed and fish oils [0.315 g PUFAs: 0.065 g eicosapentaenoic acid (EPA) , 0.050 g docosahexaenoic (DHA) and 0.2 g alpha linolenic acid (ALA) per capsule]. Patients, after treatment with n-3 PUFAs, with higher concentrations of ALA and DHA and lower arachidonic acid (AA) showed improvement of liver histology alterations. In the present study we evaluated the proteomics pathways and lipidomics markers resulted from treatment with PUFAs n-3. This was performed by comparing, before (BT group) and after (AT group) treatment, liver tissue pools (analysis interactome) and plasma samples (OPLS-DA). RESULTS: It was identified, in a way exclusive and altered, the expressed liver proteins in AT group, related to pathways of cellular matrix, lipid metabolism, oxidative and endoplasmic reticulum stress and cellular respiration. With the exception of cell matrix, the analysis of the interactome revealed substantial functional alterations of the pathways modulated by these proteins. Together, these changes were suggestive of decreased lipotoxicity, oxidative stress and anaerobic respiration and increased aerobic respiration following treatment with PUFAs n-3. These modifications are potential markers of endoplasmic reticulum and mitochondrial functions improvement. In addition, after treatment with n-3 PUFAs, the lipidomics profile was modified, with significant increase in glycerophospholipids, ALA and EPA and decrease of arachidonic acid (AA) and n-6/n-3 AGPIs ratio. These findings are concordant with potential improvement of reticulum endoplasmic and mitochondrial functions. CONCLUSION: In patients with NASH the treatment with n-3 PUFAs favorably influenced hepatic proteomic and systemic lipidomics profiles. Together, these changes suggest improved endoplasmic reticulum and mitochondrial functions, with potential impact on cellular homeostasis through the modulation of different biological pathways