Austropuccinia psidii, the causal agent of myrtle rust, is a biotrophic pathogen, and therefore its growth and development depend on the host tissues. The uredospores of A. psidii infect Eucalyptus by engaging in close contact with the host surface and interacting with the leaf cuticle that provides important chemical and physical signals to trigger the infection process. Due to the inherent characteristics of the Eucalyptus cuticle, it was hypothesized that the preformed mechanism, comprised mostly by cuticular waxes, plays a crucial role in Eucalyptus resistance against A. psidii and its ability to modulate the expression of genes associated to the pathogenicity of A. psidii during the early stage of infection. In chapter 2, the cuticular waxes of Eucalyptus spp. were analyzed to determine their composition or structure and then correlated to susceptibility/resistance to Austropuccinia psidii. Twenty-one Eucalyptus spp. in the field were classified as resistant or susceptible. From these, the resistance/susceptibility level of six Eucalyptus spp. was evaluated in controlled conditions using qPCR, revealing that the pathogen can germinate on the eucalyptus surface of some species without multiplying in the host. CG-TOF-MS analysis detected 26 compounds in the Eucalyptus spp. cuticle and led to the discovery of the role of hexadecanoic acid in the susceptibility of E. grandis and E. phaeotricha to A. psidii. The scanning electron microscopy check revealed differences in A. psidii germination during host infection. It was found a correlation between epicuticular morphology and the resistance to A. psidii. In chapter 3, we investigated gene expression of A. psidii through bioassays in vitro containing cuticular waxes from E. grandis (E. g), E. urograndis (E. ug) and E. urophylla (E. u). Mineral oil (MO) treatment was used to all comparative analysis (negative control). The presence of cuticular waxes from E. g induced the expression of genes encoding proteins related to growth and colonization of A. psidii such as binding proteins (peptidylprolyl isomerase and ribosomal) and cell wall degrading proteins (beta-xylanase). However, other pathogenic proteins were repressed in presence of cuticular wax of E. g, for instance, triosephosphate isomerase, family 18 glycoside hydrolase, mitochondrial ATP carrier, and glutamine-dependent NAD synthetase. The E. ug x MO analysis resulted in DEGs associated with proteins related to membrane transporters and receptors, DNA repair and glycine dehydrogenase. As to the cuticular wax of E. u, it up-regulated the expression of genes encoding proteins associated with pheromone, cutinases, and prefoldin. Thus, for the first time, it was demonstrated a considerable interspecific variation in Eucalyptus species on the susceptibility to A. psidii and its correlation with cuticular waxes chemical compounds that seem to play a synergistic role as a preformed defense mechanism. We also demonstrated that Eucalyptus spp. cuticular waxes may modulate the A. psidii gene expression, suggesting the importance of early plant-pathogen molecular interaction to the development of myrtle rust. / Austropuccinia psidii é o agente causal da ferrugem das mirtáceas com crescimento biotrófico, ou seja, o patógeno depende dos tecidos do hospedeiro para crescer e se desenvolver. Os uredósporos de A. psidii infectam Eucalyptus por meio do contato inicial com a superfície do hospedeiro e também pela interação com a cutícula da folha que por sua vez fornece importantes sinais químicos e físicos capaz de desencadear o processo de infecção. Devido às características inerentes à cutícula de Eucalyptus, consideramos as hipóteses de que o mecanismo pré-formado, composto principalmente pelas ceras cuticulares, desempenha um papel crucial na resistência de Eucalyptus spp. contra A. psidii, e, também, é capaz de modular a expressão fúngica de genes associados a patogenicidade durante o estágio inicial de infecção de A. psidii. No capítulo 2, as ceras cuticulares de Eucalyptus spp. foram analisadas para determinar a composição/estrutura e sua correlação com suscetibilidade/resistência de A. psidii. Vinte e uma espécies de Eucalyptus foram classificadas em campo como resistentes ou suscetíveis. A análise de qPCR de seis Eucalyptus spp. revelou que o patógeno pode germinar na superfície de algumas espécies de eucaliptos sem se multiplicar no tecido hospedeiro. Foram identificados 26 compostos presentes na cutícula de Eucalyptus spp. e descobrimos o papel do ácido hexadecanóico na suscetibilidade de E. grandis e E. phaeotricha à ferrugem. Por meio da microscopia eletrônica de varredura encontramos uma correlação entre a morfologia epicuticular e a resistência contra A. psidii. No capítulo 3 para compreender a expressão gênica de A. psidii realizamos bioensaios (in vitro) contendo as ceras cuticulares de E. grandis (E. g), E. urograndis (E. ug) e E. urophylla (E. u). O tratamento com óleo mineral (MO) foi utilizado em todas as análises comparativas como controle negativo. A presença de ceras cuticulares de E. g induziu a expressão de genes que codificam proteínas relacionadas ao crescimento e colonização de A. psidii, como proteínas de ligação (peptidylprolyl isomerase e ribosomal) e proteínas de degradação da parede celular (beta xilanase). No entanto, outras proteínas patogênicas foram reprimidas na presença da cera cuticular de E. g, por exemplo, triosephosphate isomerase, family 18 glycoside hydrolase, mitochondrial ATP carrier e glutamine-dependent NAD synthetase. A análise de E. ug x MO resultou na ativação de proteínas associadas a transportadores e receptores de membrana, reparo de DNA e glycine dehydrogenase. Já a cera cuticular de E. u induziu a expressão de genes que codificam proteínas associadas a feromônios, cutinases e prefoldin. Pela primeira vez, está sendo apresentado a considerável variação interespecífica em espécies de Eucalyptus quanto à suscetibilidade a ferrugem, e, sua correlação com os compostos químicos de ceras cuticulares, os quais parecem ser um importante mecanismo de defesa pré-formado. Também foi revelado que as ceras cuticulares de Eucalyptus spp. são capazes de modular a expressão gênica de A. psidii, evidenciando o papel da interação molecular planta-patógeno precoce no desenvolvimento da ferrugem das mirtáceas.

Atualmente, os estudos Ômicos, principalmente no campo da metabolômica, têm tido grandes avanços contribuindo para a descoberta de novos biomarcadores e consequentemente aumentando a eficiência do tratamento do câncer. A lipidômica é um novo ramo da metabolômica que visa o estudo abrangente dos lipídeos presentes em um determinado organismo dando ênfase ao metabolismo dos lipídeos e como estão relacionados à progressão da doença. A utilização da espectrometria de massas aliada a abordagens bionalíticas tem progredido rapidamente nos últimos anos, possibilitando a análise e compreensão de pequenas moléculas no contexto biológico e de desenvolvimento do câncer. Dessa forma, para a obtenção de uma boa cobertura lipídica, o preparo de amostra, os parâmetros cromatográficos e o processamento de dados são de suma importância. Nesse trabalho foi avaliado o perfil lipídico de amostras de plasma advindas do modelo animal de Ehrlich, um adenocarcinoma mamário em camundongos fêmeas. Na primeira parte do estudo foi utilizado o método de extração de lipídeos por Bligh-Dyer e realizadas comparações entre plasma de camundongo com tumor de Ehrlich induzido e plasma de camundongo controle, além da comparação entre plasma de camundongo com tumor de Ehrlich e fluido tumoral ascítico de Ehrlich. Através dos modelos obtidos foi observado que no modo negativo de ionização foram obtidos ácidos graxos significativamente diferentes entre os grupos, através do modelo de PLS-DA, dando ênfase ao perfil de ácidos graxos saturados, que mostraram-se em maior quantidade no plasma de Ehrlich. No modo positivo, alterações nos níveis de fosfatidilcolinas (PCs) foram obtidos, indicando a fosfocolina como potencial biomarcador para o câncer de mama, destacando-se as vias metabólicas mais afetadas: metabolismo do ácido linoléico e dos glicerofosfolipídeos. Já a comparação entre fluido tumoral e plasma de Ehrlich foi obtido, através dos dados no modo negativo de ionização e pelo modelo de PLS-DA, que informações lipídicas do tumor podem ser refletidas no plasma, em especial para o conteúdo de ácidos graxos, fosfotidilcolinas e fosfatidiletanolaminas (PEs). Uma segunda abordagem utilizada nessa tese foi a utilização da amostragem in vivo por microextração em fase sólida (SPME) para avaliação metabólica. Os principais parâmetros de SPME que podem afetar a eficiência da extração foram avaliados: tempo de extração e tempo de dessorção. Por meio de um planejamento experimental foram obtidos 10 min e 20 min, respectivamente, para cada variável. Após processamento dos dados foram obtidos 142 e 78 features no modo positivo e negativo, respectivamente. Através dos dados obtidos no modo negativo, e do modelo de PLS-DA construído foi possível avaliar possíveis biomarcadores responsáveis pela diferenciação do fluido tumoral e do fluido presente no camundongo controle, destacando ácidos graxos saturados, o ácido lisofosfatídico (LPA 18:0), fosfatidilinositol (PI 36:0) e derivados de colesterol. O presente estudo apresentou resultados que devem ser melhor explorados e correlacionados com dados a partir de amostras de humanos, podendo ser um indicador para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para câncer de mama. / Currently, the \"omics\" studies mainly in the field of metabolomics, have increasinly contributed to the discovery of new biomarkers and consequently increasing the efficiency of cancer therapy. Lipidomics is a new approach of the metabolomics that aims the comprehensive study of the lipids present in a given organism, emphasizing the metabolism of lipids and how they are associated to the progression of the disease. Mass spectrometry coupled to bionalytical tools has progressed rapidly in recent years, making it possible to analyze and to understand small molecules in the biological context in the development of cancer. Thus, to obtain a good lipid coverage, sample preparation, chromatographic parameters, and the data processing are important. In this work, the lipid profile of plasma samples from the Ehrlich animal model, a mammary adenocarcinoma in female mice, was evaluated. In the first part of the study the method of lipid extraction by Bligh-Dyer was used and comparisons were performed between mouse plasma with induced Ehrlich tumor and control mouse plasma. In addition, comparison between mouse plasma with Ehrlich tumor and Ehrlich ascitic tumor fluid was performed. Through multivariate models PLS-DA was observed that in the negative ionization mode fatty acids were significantly different between the groups, emphasizing the profile of saturated fatty acids in higher levels in the plasma of Ehrlich. In the positive mode of ionization changes in phosphatidylcholine (PCs) levels were obtained, indicating the phosphocholine group as potential biomarker for breast cancer, with metabolic pathways of the linoleic acid and glycerophospholipids metabolism the most affected. The comparison between tumor fluid and Ehrlich plasma was obtained through the negative mode dataset using the PLS-DA model, showing that the lipid information of tumor can be reflected in the plasma, especially for the fatty acid, phosphotidylcholine and phosphatidylethanolamine (PE). A second approach used in this thesis was the using of the in vivo sampling by solid phase microextraction (SPME). Times of extraction and desorption were the main parameters of SPME assessed using experimental design since they can affect the efficiency of extraction, where 10 and 20 min were the better times of extraction and desorption obtained, respectively. After processing the dataset, 142 and 78 features were obtained in the positive and negative modes of ionization, respectively. Through the data obtained in the negative mode, PLS-DA model was able to evaluate possible biomarkers responsible for the differentiation between tumor fluid and that fluid present in the control mouses, highlighting saturated fatty acids, lysophosphatidic acid (LPA 18:0), phosphatidylinositol (PI 36:0) and cholesterol derivatives. The present study showed results that should be better explored and correlated with data from human samples, and may be an indicator for the development of new therapeutic agents for breast cancer.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-09-29T17:19:20Z No. of bitstreams: 1 IaraNogueira.pdf: 92869 bytes, checksum: 5e68638ca4fbe0f7a83413724c91dec2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-29T17:19:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 IaraNogueira.pdf: 92869 bytes, checksum: 5e68638ca4fbe0f7a83413724c91dec2 (MD5) Previous issue date: 2017-05-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Menopause is a physiological process that affects women during their late 40s or early 50s, but it has substantial health consequences, varying from disturbances in the lipid and glucose metabolism to changes in sleep, increasing exposure to cardiovascular disease. The aim of this study was to analyze the lipid profile and cardiovascular risk in pre and post menopause, in order to better understand the possible mechanisms that increase cardiovascular risks after menopause. It was a cross-sectional analytical study, including evaluated 184 women aged to 40 to 65 years. Socio-demographic, clinical, anthropometric and laboratory data were obtained as well as comorbidities, such as diabetes, dyslipidemia, hypertension and metabolic syndrome. The stratification of cardiovascular risk in 10 years was performed using the Framingham equation and the overall risk score. A total of 40 participants blood samples of this total were randomly selected for serum lipidic analysis, using mass spectrometry. Participants mean aged of 50 (SD 6.8) years and 54.8% were defined as postmenopausal. From the Framingham score, most women were classified as low risk, with 95.1% frequency for cardiovascular disease in 10 years in premenopausal women and 74.5% in those postmenopausal, despite the high percentage of risk factors, such dyslipidemia (72.6%), metabolic syndrome (50%), insulin resistance (50.9%) and diabetes (16.7%) in postmenopausal. Stratification by the global risk score was more adequate, that is, 64.6% of premenopausal women and 29.4% of postmenopausal women were classified as low risk, whereas 22% and 62.8% were in the high risk category, respectively. In lipidic analysis, lipid species were found to have increased concentrations in postmenopausal women, with the most notable being ceramides (N.C23: 0.Cer; N.C23:0(OH).Cer and N.C24:0(OH).Cer) with Fold Change of 1.68, 1.59 and 1.58, respectively. It was also observed that 14 metabolites showed a significant difference between pre and post menopause, mainly ceramide species. Strong and positive correlations were identified between several metabolites with fasting glucose, glycated hemoglobin, total cholesterol, LDL and triglycerides. Highlight the associations between the species ceramides (N.C10:0.Cer) and lysophosphatidylethanolamine (LPE.a.C18:0) with fasting glucose (r = 0.83 and r = 0.73, p< 0.05 , respectively) and with glycated hemoglobin (r = 0.81 and r = 0.75, p <0.05, respectively). The data obtained allowed us to conclude that postmenopausal women h, ad a CVD risk that was approximately three times higher than in premenopausal women, and that the Framingham score seemed to underestimate cardiovascular risk in the climacteric, whereas the overall score stratified more adequately once which was consistent with the CVD risk factors observed in this population. However, the main findings of this study were the important lipid changes detected in postmenopausal women, especially in the class ceramides, as well as correlations with classical glycolic and lipid markers that may be useful to investigate diseases associated with this phase. / A menopausa constitui um processo fisiológico que acomete as mulheres entre 40 e 50 anos, porém traz consequências substanciais para a saúde, que variam de distúrbios no metabolismo lipídico e glicídico a alterações no sono, aumentando a exposição para as doenças cardiovasculares. Esta pesquisa teve como objetivo analisar o perfil lipidômico e o risco cardiovascular na pré e pós menopausa, para melhor entender os possíveis mecanismos que aumentam os riscos cardiovasculares após a menopausa. Foi uma pesquisa transversal analítica, que foram avaliadas 184 mulheres, com idade entre 40 e 65 anos. Dados sociodemográficos, clínicos, antropométricos e exames laboratoriais foram obtidos, bem como informações sobre comorbidades, como diabetes, dislipidemia, hipertensão e síndrome metabólica. A estratificação do risco cardiovascular em 10 anos foi realizada utilizando a equação de Framingham e o escore global de risco. Do total das participantes, foram selecionadas aleatoriamente, 40 amostras sanguíneas, para a análise lipidômica, utilizando a técnica de espectrometria de massa. As participantes tinham uma média de idade de 50 anos (DP 6,8), na qual 55% delas estavam na pós-menopausa. Pelo escore de Framingham, a maioria das mulheres foram classificadas em baixo risco, sendo que na pré menopausa a frequência foi de 95,1% e na pós menopausa de 74,5% para doença cardiovascular em 10 anos, apesar do percentual elevado dos fatores de risco, como dislipidemia (72,6%), síndrome metabólica (50%), resistência insulínica (50,9%) e diabetes (16,7%), na pós menopausa. Já a estratificação pelo escore global de risco mostrou que 64,6% das mulheres na pré-menopausa e 29,4% na pós-menopausa foram classificadas como baixo risco, enquanto que 22% e 62,8% estavam na categoria de alto risco, respectivamente. Na análise lipidômica, verificou-se que espécies lipídicas apresentavam concentrações aumentadas na pós menopausa, destacando-se as ceramidas (N.C23:0.Cer; N.C23:0(OH).Cer e N.C24:0(OH).Cer) com Fold Change de 1,68, 1,59 e 1,58, respectivamente. Observou-se também que 14 metabólitos apresentaram diferença significativa entre pré e pós menopausa, principalmente espécies de ceramidas. Foram identificadas correlações fortes e positivas entre vários metabólitos com glicemia em jejum, hemoglobina glicada, colesterol total, LDL e triglicerídeos. Destacamse as associações entre as espécies de ceramidas (N.C10:0.Cer) e lisofosfatidiletanolamina (LPE.a.C18:0) com a glicemia em jejum (r=0,83 e r=0,73; p< 0,05, respectivamente) e com a hemoglobina glicada (r=0,81 e r=0,75; p< 0,05, respectivamente). Os dados obtidos nos permitiram concluir que as mulheres na pós menopausa apresentavam um risco para DCV aproximadamente três vezes maior que na pré menopausa e que o escore de Framingham parece subestimar o risco cardiovascular no climatério, enquanto que o escore global estratifica mais adequadamente, uma vez que foi condizente com os fatores de risco para DCV observados nesta população. Mas, o principal achado deste estudo foram as importantes alterações nos lipídeos detectadas na pós menopausa, especialmente na classe das ceramidas, além das correlações com marcadores glicídicos e lipídicos clássicos que poderão ser úteis para investigar doenças associadas a esta fase.

Atualmente, os estudos Ômicos, principalmente no campo da metabolômica, têm tido grandes avanços contribuindo para a descoberta de novos biomarcadores e consequentemente aumentando a eficiência do tratamento do câncer. A lipidômica é um novo ramo da metabolômica que visa o estudo abrangente dos lipídeos presentes em um determinado organismo dando ênfase ao metabolismo dos lipídeos e como estão relacionados à progressão da doença. A utilização da espectrometria de massas aliada a abordagens bionalíticas tem progredido rapidamente nos últimos anos, possibilitando a análise e compreensão de pequenas moléculas no contexto biológico e de desenvolvimento do câncer. Dessa forma, para a obtenção de uma boa cobertura lipídica, o preparo de amostra, os parâmetros cromatográficos e o processamento de dados são de suma importância. Nesse trabalho foi avaliado o perfil lipídico de amostras de plasma advindas do modelo animal de Ehrlich, um adenocarcinoma mamário em camundongos fêmeas. Na primeira parte do estudo foi utilizado o método de extração de lipídeos por Bligh-Dyer e realizadas comparações entre plasma de camundongo com tumor de Ehrlich induzido e plasma de camundongo controle, além da comparação entre plasma de camundongo com tumor de Ehrlich e fluido tumoral ascítico de Ehrlich. Através dos modelos obtidos foi observado que no modo negativo de ionização foram obtidos ácidos graxos significativamente diferentes entre os grupos, através do modelo de PLS-DA, dando ênfase ao perfil de ácidos graxos saturados, que mostraram-se em maior quantidade no plasma de Ehrlich. No modo positivo, alterações nos níveis de fosfatidilcolinas (PCs) foram obtidos, indicando a fosfocolina como potencial biomarcador para o câncer de mama, destacando-se as vias metabólicas mais afetadas: metabolismo do ácido linoléico e dos glicerofosfolipídeos. Já a comparação entre fluido tumoral e plasma de Ehrlich foi obtido, através dos dados no modo negativo de ionização e pelo modelo de PLS-DA, que informações lipídicas do tumor podem ser refletidas no plasma, em especial para o conteúdo de ácidos graxos, fosfotidilcolinas e fosfatidiletanolaminas (PEs). Uma segunda abordagem utilizada nessa tese foi a utilização da amostragem in vivo por microextração em fase sólida (SPME) para avaliação metabólica. Os principais parâmetros de SPME que podem afetar a eficiência da extração foram avaliados: tempo de extração e tempo de dessorção. Por meio de um planejamento experimental foram obtidos 10 min e 20 min, respectivamente, para cada variável. Após processamento dos dados foram obtidos 142 e 78 features no modo positivo e negativo, respectivamente. Através dos dados obtidos no modo negativo, e do modelo de PLS-DA construído foi possível avaliar possíveis biomarcadores responsáveis pela diferenciação do fluido tumoral e do fluido presente no camundongo controle, destacando ácidos graxos saturados, o ácido lisofosfatídico (LPA 18:0), fosfatidilinositol (PI 36:0) e derivados de colesterol. O presente estudo apresentou resultados que devem ser melhor explorados e correlacionados com dados a partir de amostras de humanos, podendo ser um indicador para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para câncer de mama. / Currently, the \"omics\" studies mainly in the field of metabolomics, have increasinly contributed to the discovery of new biomarkers and consequently increasing the efficiency of cancer therapy. Lipidomics is a new approach of the metabolomics that aims the comprehensive study of the lipids present in a given organism, emphasizing the metabolism of lipids and how they are associated to the progression of the disease. Mass spectrometry coupled to bionalytical tools has progressed rapidly in recent years, making it possible to analyze and to understand small molecules in the biological context in the development of cancer. Thus, to obtain a good lipid coverage, sample preparation, chromatographic parameters, and the data processing are important. In this work, the lipid profile of plasma samples from the Ehrlich animal model, a mammary adenocarcinoma in female mice, was evaluated. In the first part of the study the method of lipid extraction by Bligh-Dyer was used and comparisons were performed between mouse plasma with induced Ehrlich tumor and control mouse plasma. In addition, comparison between mouse plasma with Ehrlich tumor and Ehrlich ascitic tumor fluid was performed. Through multivariate models PLS-DA was observed that in the negative ionization mode fatty acids were significantly different between the groups, emphasizing the profile of saturated fatty acids in higher levels in the plasma of Ehrlich. In the positive mode of ionization changes in phosphatidylcholine (PCs) levels were obtained, indicating the phosphocholine group as potential biomarker for breast cancer, with metabolic pathways of the linoleic acid and glycerophospholipids metabolism the most affected. The comparison between tumor fluid and Ehrlich plasma was obtained through the negative mode dataset using the PLS-DA model, showing that the lipid information of tumor can be reflected in the plasma, especially for the fatty acid, phosphotidylcholine and phosphatidylethanolamine (PE). A second approach used in this thesis was the using of the in vivo sampling by solid phase microextraction (SPME). Times of extraction and desorption were the main parameters of SPME assessed using experimental design since they can affect the efficiency of extraction, where 10 and 20 min were the better times of extraction and desorption obtained, respectively. After processing the dataset, 142 and 78 features were obtained in the positive and negative modes of ionization, respectively. Through the data obtained in the negative mode, PLS-DA model was able to evaluate possible biomarkers responsible for the differentiation between tumor fluid and that fluid present in the control mouses, highlighting saturated fatty acids, lysophosphatidic acid (LPA 18:0), phosphatidylinositol (PI 36:0) and cholesterol derivatives. The present study showed results that should be better explored and correlated with data from human samples, and may be an indicator for the development of new therapeutic agents for breast cancer.

O objetivo deste estudo foi analisar o plasma sanguíneo correspondente ao período de transição, de vacas Holandesas de alta produção e sua relação com o desempenho reprodutivo. Para isso, este plasma foi analisado com emprego do equipamento de espectrômetro de massas híbrido triplo quadrupolo/tempo-de-vôo, para identificação dos Lipídios. As alterações metabólicas e hormonais ocorridas durante esta fase, nas vacas leiteiras, afetam diretamente a saúde e o desempenho produtivo e reprodutivo das mesmas. Nesse período, ocorre o balanço energético negativo, caracterizado pelo aumento da mobilização de reservas energéticas, normalmente do tecido adiposo, para atender às demandas voltadas à produção de leite. Neste projeto, propõe-se o estudo da condição metabólica, principalmente sob um contexto lipidômico, durante o período de transição e início de lactação de vacas leiteiras em dois grupos de produção (Alta: &ge; 45,9 kg leite/dia e Média: 30-45,8kg leite/dia), nos períodos de Inverno e Verão que se tornaram prenhes ou não aos 150 dias de experimento (após 3 IATF), em um contexto multidisciplinar, visando o melhor entendimento, tanto do desempenho produtivo, como do reprodutivo e na elaboração de estratégias de manejo, para aplicação nos rebanhos leiteiros no Brasil. Foram utilizadas 31 vacas da raça Holandesa, multíparas e gestantes, com parto previsto para 21 dias após o início do período de avaliação experimental. Os animais foram avaliados durante o período pré-parto até 150 dias de lactação. Nas amostras foram analisadas variáveis plasmáticas, conhecidamente ligadas às condições metabólicas (energética, proteica e enzímica). Estes valores serão utilizados como guias na utilização da abordagen ômica (lipidômica), com finalidade de identificar biomarcadores lipídicos descritivos do metabolismo destes animais. Todos os dados obtidos foram analisados por métodos estatísticos convencionais e por estatística multivariada, utilizando técnicas como PCA (Principal Component Analisis) e OPLS (Orthogonal Projection on Latent Structures) e ferramentas de bioinformática, a fim de identificar quais metabólitos são mais descritivos do metabolismo destes animais, bem como a interação das diferentes vias metabólicas. Concluí-se que ao final do período de transição, o plasma de vacas pós-parto que contenham maiores quantidades de fosfatifilcolinas, principalmente 36:2 e 36:4, podem obter melhores chances de se tornarem prenhes à 1IATF. Estas fosfatidilcolinas podem ser consideradas como bons biomarcadores lipídicos devido à sua interferência com a maior síntese de lipoproteínas VLDL, evitando assim, a ocorrência de fígado gorduroso, característico desse período. Além disso, estas moléculas podem auxiliar no processo de monitoramento de alguns parâmetros metabólicos alterados, normalmente observados durante o balanço energético negativo / The aim of this study was to analyze the corresponding blood plasma in transitional period of Holstein cows with high production and its relation to the reproductive performance. Therefore, this plasma was analyzed with the use of a triple quadrupole mass spectrometer time-of-flight, for identification of lipids. In dairy cows, the metabolic and hormonal changes during this phase, directly affect the health and productive and reproductive performance. In this period, the negative energy balance is characterized by increased mobilization of energy reserves, usually by fat, due the demands on milk production. In this project, we proposed the study of metabolic condition, especially under a lipidomic context, during the transition period and early lactation dairy cows on two milk productions (High: &ge; 45.9 kg milk/day and Medium: 30 -45,8kg milk/day) during the periods, winter and summer, of cows that became pregnant or not in the 150 days of the experiment (after 3 IATF), in a multidisciplinary context, for get better understand the both productions performances, the reproductive and developing management strategies for application in dairy herds in Brazil. They used 31 Holstein cows, multiparous and pregnants, with calving expected to 21 days after the beginning of the experimental evaluation period. The animals were evaluated during ante partum period to 150 days of lactation. Samples were analyzed by parameters, known to be linked to metabolic conditions (energy, protein and enzyme). These values will be used as guides in a ohmic approach (lipidomics), with the purpose of identifying biomarkers describe lipid metabolism of these animals. All data were analyzed by conventional statistical methods and multivariate statistics, using techniques such as PCA (Principal Component Analysis) and OPLS (Orthogonal Projection on Latent Structures) and bioinformatics tools to identify which metabolites are more descriptive of the metabolism of these animals as well as the interaction of different metabolic pathways. It can be concluded that the end of the transition period, the plasma post-partum cows containing larger amounts of phosphatidylcholines, especially 36:2 and 36:4, may best chance of becoming pregnant in 1IATF. These phosphatidylcholines may be considered a good lipid biomarkers interfering with the highest synthesis of VLDL, thereby avoiding the occurrence of fatty liver characteristic of that period. Therefore, these molecules can be used for monitoring the process of change of some metabolic parameters normally observed during negative energy balance

O objetivo deste estudo foi analisar o plasma sanguíneo correspondente ao período de transição, de vacas Holandesas de alta produção e sua relação com o desempenho reprodutivo. Para isso, este plasma foi analisado com emprego do equipamento de espectrômetro de massas híbrido triplo quadrupolo/tempo-de-vôo, para identificação dos Lipídios. As alterações metabólicas e hormonais ocorridas durante esta fase, nas vacas leiteiras, afetam diretamente a saúde e o desempenho produtivo e reprodutivo das mesmas. Nesse período, ocorre o balanço energético negativo, caracterizado pelo aumento da mobilização de reservas energéticas, normalmente do tecido adiposo, para atender às demandas voltadas à produção de leite. Neste projeto, propõe-se o estudo da condição metabólica, principalmente sob um contexto lipidômico, durante o período de transição e início de lactação de vacas leiteiras em dois grupos de produção (Alta: &ge; 45,9 kg leite/dia e Média: 30-45,8kg leite/dia), nos períodos de Inverno e Verão que se tornaram prenhes ou não aos 150 dias de experimento (após 3 IATF), em um contexto multidisciplinar, visando o melhor entendimento, tanto do desempenho produtivo, como do reprodutivo e na elaboração de estratégias de manejo, para aplicação nos rebanhos leiteiros no Brasil. Foram utilizadas 31 vacas da raça Holandesa, multíparas e gestantes, com parto previsto para 21 dias após o início do período de avaliação experimental. Os animais foram avaliados durante o período pré-parto até 150 dias de lactação. Nas amostras foram analisadas variáveis plasmáticas, conhecidamente ligadas às condições metabólicas (energética, proteica e enzímica). Estes valores serão utilizados como guias na utilização da abordagen ômica (lipidômica), com finalidade de identificar biomarcadores lipídicos descritivos do metabolismo destes animais. Todos os dados obtidos foram analisados por métodos estatísticos convencionais e por estatística multivariada, utilizando técnicas como PCA (Principal Component Analisis) e OPLS (Orthogonal Projection on Latent Structures) e ferramentas de bioinformática, a fim de identificar quais metabólitos são mais descritivos do metabolismo destes animais, bem como a interação das diferentes vias metabólicas. Concluí-se que ao final do período de transição, o plasma de vacas pós-parto que contenham maiores quantidades de fosfatifilcolinas, principalmente 36:2 e 36:4, podem obter melhores chances de se tornarem prenhes à 1IATF. Estas fosfatidilcolinas podem ser consideradas como bons biomarcadores lipídicos devido à sua interferência com a maior síntese de lipoproteínas VLDL, evitando assim, a ocorrência de fígado gorduroso, característico desse período. Além disso, estas moléculas podem auxiliar no processo de monitoramento de alguns parâmetros metabólicos alterados, normalmente observados durante o balanço energético negativo / The aim of this study was to analyze the corresponding blood plasma in transitional period of Holstein cows with high production and its relation to the reproductive performance. Therefore, this plasma was analyzed with the use of a triple quadrupole mass spectrometer time-of-flight, for identification of lipids. In dairy cows, the metabolic and hormonal changes during this phase, directly affect the health and productive and reproductive performance. In this period, the negative energy balance is characterized by increased mobilization of energy reserves, usually by fat, due the demands on milk production. In this project, we proposed the study of metabolic condition, especially under a lipidomic context, during the transition period and early lactation dairy cows on two milk productions (High: &ge; 45.9 kg milk/day and Medium: 30 -45,8kg milk/day) during the periods, winter and summer, of cows that became pregnant or not in the 150 days of the experiment (after 3 IATF), in a multidisciplinary context, for get better understand the both productions performances, the reproductive and developing management strategies for application in dairy herds in Brazil. They used 31 Holstein cows, multiparous and pregnants, with calving expected to 21 days after the beginning of the experimental evaluation period. The animals were evaluated during ante partum period to 150 days of lactation. Samples were analyzed by parameters, known to be linked to metabolic conditions (energy, protein and enzyme). These values will be used as guides in a ohmic approach (lipidomics), with the purpose of identifying biomarkers describe lipid metabolism of these animals. All data were analyzed by conventional statistical methods and multivariate statistics, using techniques such as PCA (Principal Component Analysis) and OPLS (Orthogonal Projection on Latent Structures) and bioinformatics tools to identify which metabolites are more descriptive of the metabolism of these animals as well as the interaction of different metabolic pathways. It can be concluded that the end of the transition period, the plasma post-partum cows containing larger amounts of phosphatidylcholines, especially 36:2 and 36:4, may best chance of becoming pregnant in 1IATF. These phosphatidylcholines may be considered a good lipid biomarkers interfering with the highest synthesis of VLDL, thereby avoiding the occurrence of fatty liver characteristic of that period. Therefore, these molecules can be used for monitoring the process of change of some metabolic parameters normally observed during negative energy balance

Orientador: Fabio Augusto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T10:51:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hantao_LeandroWang_M.pdf: 3862279 bytes, checksum: 7d8b474b736814564a1145814b69d5e9 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Neste trabalho foram desenvolvidas metodologias para a análise de lipídios na forma de seus ésteres metílicos de ácido graxo (FAME) em diversas matrizes. Para isso foram empregadas e otimizadas de forma multivariada técnicas de derivatização dos lipídios por transesterificação por catálise básica, seu isolamento e concentração por Microextração em Fase Sólida (SPME) e análise por Cromatografia Gasosa Bidimensional Abrangente (GCxGC). A partir do perfil de extração foi escolhida a fibra comercial com revestimento de poli(dimetilsiloxano) (PDMS) com espessura de filme de 7 mm. O tempo de extração escolhido foi de 10 min pois atingiu a condição de sistema estacionário. Os parâmetros cromatográficos, tais como a programação de temperatura do forno, período de modulação e tipo de fase estacionária das colunas utilizadas no protótipo GCxGC, foram também otimizados. Além disso, durante o progresso deste trabalho, foi desenvolvido o primeiro protótipo brasileiro de GCxGC acoplado a um Espectrômetro de Massas com Analizador Quadrupolar rápido (GCxGCxqMS). Dentre os parâmetros operacionais do qMS, foram otimizados o intervalo de varredura do analizador quadrupolar e sua frequencia de aquisição. O sistema GCxGCxqMS foi empregado para a identificação dos FAME presentes nas amostras empregadas neste estudo, através do uso das informações obtidas pelos espectros de massas obtidos das amostras, com padrões analíticos e combinando o uso de índices de retenção (LTPRI) e da estrutura cromatográfica. Neste trabalho, devido ao incremento em detectabilidade e sensibilidade, foi possível observar diversos FAME comumente não detectados por Cromatografia Gasosa Convencional (GC), como FAME de comprimento ímpar de cadeia e a presença de agrupamento metila no carbono 2 (-br2). Além disso, em virtude da baixa abrangência do banco de dados disponíveis, foi possível, e necessário, criar um banco de dados com índices de retenção para análise de lipídios. Espera-se que estas metodologias desenvolvidas e os resultados apresentados possam ser empregados como ferramenta em estudos de lipidômica e aplicações correlatas / Abstract: The aim of this project was to develop alternative methodologies for lipidomic studies and related applications. A method for the analysis of lipids in different samples such as waxes, edible oils and cheek cells was developed. The isolation and concentration of the analytes was performed by Solid Phase Microextraction (SPME) combined with Comprehensive Two-dimensional Gas Chromatography (GCxGC). Firstly, the base-catalysed transesterification of the lipids into their respective fatty acid methyl esters (FAME) was optimized according to a multivariate model. Thus, the sample prepation was optimized considering the thickness of the coating and their respective extraction profiles. The choosen commercial coating was a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) with 7 mm film thickness, the extraction time was 10 min where stationary state conditions were achieved. Secondly, chromatographic parameters were also optimized, such as the temperature programming, modulation period, the identity of the first and second dimensional columns used in GCxGC prototype. During the current study, the first brazillian prototype of a GCxGC coupled to a mass spectrometer with a rapid quadrupolar analyzer was developed (GCxGCxqMS). Also, the scan interval and acquisition frequency of the qMS were optimized. For the identification of the analytes similarity searches for mass spectra, analytical standards and the combination retention indexes with chromatographic structuration were used. Additionally it was possible to detected and identify FAME which couldn't be detected by conventional GC such as odd numbered chain length and branched FAME. Moreover, elution pattern of a branched FAME was reported, specifically the FAME with a methyl group in the carbon 2 (-br2). Because of the restricted content of the retention indexes and mass spectra database, the construction of a database with retention indexes for lipid analysis was built. Hence the ultimate goal of the current study is to present the potencial and applicability of SPME for lipidomic studies and related applications / Mestrado / Quimica Analitica / Mestre em Química

Estudos realizados em nosso laboratório encontraram que o aumento do conteúdo corporal de ácidos graxos N3, pela produção endógena via modificação genética, protege camundongos do ganho de peso corporal e obesidade induzida por dieta hiperlipídica. Objetivo: Investigar os mecanismos pelos quais o óleo de peixecontrola o balanço energético de camundongos C57BL6/J e UCP1selvagens e Knockout (KO) protegendo do desenvolvimento da obesidade induzida por dieta, com ênfase nos processos termogênicos dependentes e independentes da UCP1. Materiais e Métodos: Protocolo 1- Camundongos C57BL6/J alimentados por 8 semanas com dieta normal (DN) contendo 10% de lipídeos oriundos do óleo de soja e banha de porco, dieta normal N3 (DNN3) contendo 10% de lipídeos oriundos do óleo de soja e óleo de peixe, dieta hiperlipídica (HFD) contendo 60% de lipídeos oriundos do óleo de soja e banha de porco e dieta hiperlipídica (HFDN3) contendo 60% de lipídeos oriundos do óleo de soja e óleo de peixe foram avaliados para o peso corporal, a eficiência energética, a ingestão alimentar, a calorimetria indireta, a adiposidade, a tolerância à glicose e à insulina, o consumo de oxigênio tecidual e a análise lipidômica do tecido adiposo inguinal (TAI) e marrom (TAM). Protocolo 2- Camundongos selvagens e Knockout para a UCP1 alimentados por 8 semanas com dieta (HFD) e (HFDN3) foram avaliados para o peso corporal, a eficiência energética, a ingestão alimentar, a calorimetria indireta, a adiposidade, a tolerância à glicose, e o consumo de oxigênio tecidual. Resultados: Protocolo 1- Não houve diferenças significativas no ganho de peso, adiposidade, ingestão alimentar, consumo de oxigênio e tolerância à glicose entre camundongos C57BL6/J alimentados com as dietas DN e DNN3. Entretanto, aqueles alimentados com dieta HFDN3, apresentaram reduzido ganho de peso corporal, massa dos tecidos adiposos e eficiência energética quando comparados a camundongos alimentados com dieta HFD. Esses efeitos aconteceram na ausência de alterações significativas na ingestão alimentar medida tanto em gramas quanto em Kcal entre esses grupos. Corroborando a menor eficiência energética, camundongos C57BL6/J alimentados com dieta HFDN3 apresentaram maior consumo de oxigênio e similar atividade locomotora espontânea que camundongos alimentados com dieta HFD. Demonstramos que o consumo de oxigênio do TAI foi maior no grupo HFDN3 quando comparado ao grupo HFD. Por fim, a análise lipidômica do TAI e TAM revelou que a principal modificação ocorreu no enriquecimento dos triacilgliceróis (TAG) desses tecidos, sobretudo um aumento de ácidos graxos altamente insaturados (HUFA) nos TAG de camundongos alimentados com dieta HFDN3. Protocolo 2- Demonstramos que a dieta HFDN3 protege os camundongos UCP1 KO contra o ganho de peso corporal, aumenta o gasto energético e melhora à tolerância à glicose de maneira independente da UCP1. Além disso, observamos que o grupo UCP1 KO HFD aumentou a massa do TAM quando comparado aos outros grupos. Conclusão: A substituição da banha de porco pelo óleo de peixe na dieta aumenta o gasto energético de camundongos reduzindo o ganho de peso corporal e a adiposidade de maneira independente da UCP1. Digno de nota, o enriquecimento dos TAG com HUFA, pode ser um importante fenótipo para respostas observadas no balanço energético do grupo HFDN3 de ambos os protocolos. Acreditamos, em parte, que uma alta mobilização dos HUFA para a beta-oxidação possa estar acontecendo em paralelo com a ativação de vias alternativas de gasto energético. Os mecanismos responsáveis por estas ações serão investigados futuramente. / We have previously shown that diet-induced obesity is prevented by increasing N3 fatty acids content in the body of mice through genetic modification. Aim: In the present study, we investigated the mechanisms by which the fish oil control the energy balance protecting mice from diet-induced obesity, with emphasis at shivering and non-shivering thermogenesis. Materials and Methods: Protocol 1- C57BL6/J mice were fed during 8 weeks with normal diet (DN) containing 10% of lipids from soy oil and lard, normal diet N3 (DNN3) containing 10% of lipids from soy and fish oils, high fat diet (HFD) 60% of lipids from soy oil and lard and high fat diet (HFDN3) containing 60% of lipids from soy and fish oils. The evaluated parameters were body weight, energy efficiency, food intake, indirect calorimetry, adiposity, glucose and insulin tolerance, tissue oxygen consumption and lipidomic analysis of the white adipose tissue (WAT) and brown adipose tissue (BAT). Protocol 2- Wild type (WT) and UCP1 knockout (KO) mice were fed during 8 weeks with HFD and HFDN3. In Protocol 2, body weight, energy efficiency, food intake, indirect calorimetry, adiposity, glucose tolerance and tissue oxygen consumption were evaluated. Results: Protocol 1- No significant differences were observed in body weight, adiposity, food intake, oxygen consumption and glucose tolerance between mice fed with DN and DNN3. Mice fed with HFDN3, however, displayed reduced body weight gain, epididimal, inguinal and retroperitoneal adipose tissue masses, and energy efficiency when compared to mice fed with HFD. These effects occurred in the absence of significant alterations in food intake measured in grams and Kcal. Corroborating the decrease in energy efficiency, C57BL6/J mice fed with HFDN3 have increased oxygen consumption, but similar spontaneous locomotor activity when compared to mice fed with HFD. We show that oxygen consumption in the WAT in mice fed with HFDN3 was higher than in mice fed with HFD. Finally, the lipidomics analysis in both WAT and BAT revealed an enrichment of the triacylglycerol (TAG) linked to highly unsaturated fatty acids (HUFA, 46 double bonds) in mice fed with HFDN3. Protocol 2- The HFDN3 protects both WT and UCP1 KO groups from body weight gain, increases energy expenditure, and improves glucose tolerance. Moreover, we observe that UCP1 KO HFD group increased the weight of the TAM relative to the other groups. Conclusion: Our results indicate that replacement of lard by fish oil in the diet of mice increases energy expenditure independently of UCP1, decreasing the gain in body weight and adiposity in both protocols. To account for these findings, a model based on the higher mobilization of TAG linked to HUFA for beta-oxidation (relative to less unsaturated moieties) and activation of alternative mechanisms of energy expenditure are proposed to explain the lean phenotype of mice fed with HFDN3. This and other mechanisms of energy expenditure, however, require further investigations.

INTRODUÇÃO: A esteato-hepatite não alcóolica (NASH) é considerada problema de saúde pública, dada sua crescente incidência e seu possível papel na carcinogênese hepato-celular. Terapias atuais envolvem alterações de dieta e estilo de vida, mas têm seu resultado prejudicado pela baixa aderência dos pacientes. Abordagens farmacológicas ainda são precárias. Uma grande dificuldade no manejo de NASH reside no limitado entendimento de sua fisiopatologia, que parece envolver complexas alterações metabólicas e inflamatórias. Ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 (AGPIs n-3) são reconhecidos por suas propriedades moduladoras do metabolismo lipídico e da inflamação, e estão diminuídos em pacientes com NASH. O uso clínico de AGPIs n-3 tem mostrado benefício no controle da esteatose e na produção de marcadores da resposta metabólica e inflamatória em NASH, embora com algumas observações contraditórias. A compreensão de mecanismos moleculares modulados por AGPIs n-3 em NASH podem ser úteis para identificar alvos moleculares que auxiliem no desenho de intervenção farmacológica efetiva. Nesse sentido, ciências ômicas são particularmente úteis para a compreensão de mecanismos moleculares com alto valor translacional para a prática clínica e podem contribuir para a identificação desses alvos. OBJETIVO: O presente estudo avaliou a resposta proteômica hepática e lipidômica plasmática de pacientes com NASH perante o tratamento com AGPIs n-3. MÉTODO: As avaliações proteômicas e lipidômicas foram desenvolvidas por espectometria de massas e/ou cromatografia gasosa em amostras de biópsias hepáticas e plasma coletadas de pacientes envolvidos em estudo preliminar, realizado no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O referido estudo envolveu pacientes adultos, de ambos os sexos e com diagnóstico de NASH tratados diariamente, durante 6 meses, com 3 cápsulas contendo mistura de óleo de linhaça e óleo de peixe [0,315 g AGPIs: sendo 0,065 g de ácido eicosapentaenoico (EPA), 0,050 g de docosahexaenoico (DHA) e 0,2 g alfa linolênico (ALA) por cápsula]. Pacientes, após o tratamento com AGPIs n-3, que apresentaram altas concentrações plasmáticas de ALA e/ou DHA e/ou baixas de ácido araquidônico (AA) mostraram melhora parcial das alterações de histologia hepática. No presente estudo, avaliamos as vias proteômicas e marcadores lipidômicos resultantes do tratamento com AGPIs n-3. Isto foi feito por meio da comparação, antes (grupo AT) e depois do tratamento (grupo DT), de pools de tecido hepático (análise por interactoma) e amostras de plasma (OPLS-DA). RESULTADOS: Foram identificadas proteínas hepáticas, exclusivamente e/ou alteradamente expressas, no grupo DT, relacionadas com vias de matriz celular, metabolismo lipídico, de estresse oxidativo, e de retículo endoplasmático e respiração celular. Com excessão da via de matriz celular, a análise do interactoma revelou alteração funcional significativa das vias moduladas por essas proteínas. Em conjunto, essas alterações foram sugestivas de diminuição de lipotoxicidade, estresse oxidativo e respiração anaeróbia, e aumento de respiração aeróbia após tratamento com AGPIs n-3. Estas modificações são marcadores potenciais de melhora de função de retículo endoplasmático e mitocondrial. Em adição, após o tratamento com AGPIs n-3, o perfil lipidômico plasmático mostrou-se alterado com significativo aumento de glicerofosfolípides, ALA e EPA, e diminuição de ácido araquidônico (n-6) e da razão AGPIs n-6/n-3. Estes dados são concordantes com potencial melhora das funções de retículo endoplasmático e mitocondriais. CONCLUSÃO: O tratamento com AGPIs n-3 em pacientes com NASH influenciou favoravelmente o perfil proteômico hepático e lipidômico sistêmico. Em conjunto, essas alterações sugerem melhora da função de retículo endoplasmático e mitocondrial, com potencial impacto na homeostase celular, por meio da modulação de diferentes vias biológicas / INTRODUCTION: Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is considered a public health problem, given its increasing incidence and its possible role in hepatocellular carcinogenesis. Current therapies involve diet and lifestyle changes, but its applicability suffers from low patients adherence. Pharmacological approaches are still missing. A main difficulty in the NASH management lies in the limited understanding of its pathophysiology, which seems to involve complex metabolic and inflammatory disturbances. Omega-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFAs) are recognized for its modulatory properties on lipid metabolism and inflammation and are decreased in patients with NASH. The clinical use of these PUFAs has shown benefit in controlling steatosis and the production of metabolic and inflammatory response markers in NASH, despite some conflicting reports. Understanding mechanisms modulated by n-3 PUFAs in NASH may be useful for identifying molecular targets that could assist in the design of effective pharmacologic interventions. In this sense, omics sciences are particularly useful for understanding molecular mechanisms with high translational value to clinical practice and may contribute to the identification of these targets. AIM: This study evaluated the liver proteomic and plasma lipidomics responses of patients with NASH towards treatment with n-3 PUFAs. METHODS: The proteomic and lipidomic evaluations were studied by mass spectrometry and / or gas chromatography in samples from liver biopsies and plasma collected from patients enrolled in a preliminary clinical trial of the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. This study involved adult patients of both sexes diagnosed with NASH treated daily for 6 months, with 3 capsules containing a mixture of linseed and fish oils [0.315 g PUFAs: 0.065 g eicosapentaenoic acid (EPA) , 0.050 g docosahexaenoic (DHA) and 0.2 g alpha linolenic acid (ALA) per capsule]. Patients, after treatment with n-3 PUFAs, with higher concentrations of ALA and DHA and lower arachidonic acid (AA) showed improvement of liver histology alterations. In the present study we evaluated the proteomics pathways and lipidomics markers resulted from treatment with PUFAs n-3. This was performed by comparing, before (BT group) and after (AT group) treatment, liver tissue pools (analysis interactome) and plasma samples (OPLS-DA). RESULTS: It was identified, in a way exclusive and altered, the expressed liver proteins in AT group, related to pathways of cellular matrix, lipid metabolism, oxidative and endoplasmic reticulum stress and cellular respiration. With the exception of cell matrix, the analysis of the interactome revealed substantial functional alterations of the pathways modulated by these proteins. Together, these changes were suggestive of decreased lipotoxicity, oxidative stress and anaerobic respiration and increased aerobic respiration following treatment with PUFAs n-3. These modifications are potential markers of endoplasmic reticulum and mitochondrial functions improvement. In addition, after treatment with n-3 PUFAs, the lipidomics profile was modified, with significant increase in glycerophospholipids, ALA and EPA and decrease of arachidonic acid (AA) and n-6/n-3 AGPIs ratio. These findings are concordant with potential improvement of reticulum endoplasmic and mitochondrial functions. CONCLUSION: In patients with NASH the treatment with n-3 PUFAs favorably influenced hepatic proteomic and systemic lipidomics profiles. Together, these changes suggest improved endoplasmic reticulum and mitochondrial functions, with potential impact on cellular homeostasis through the modulation of different biological pathways

INTRODUÇÃO: A esteato-hepatite não alcóolica (NASH) é considerada problema de saúde pública, dada sua crescente incidência e seu possível papel na carcinogênese hepato-celular. Terapias atuais envolvem alterações de dieta e estilo de vida, mas têm seu resultado prejudicado pela baixa aderência dos pacientes. Abordagens farmacológicas ainda são precárias. Uma grande dificuldade no manejo de NASH reside no limitado entendimento de sua fisiopatologia, que parece envolver complexas alterações metabólicas e inflamatórias. Ácidos graxos poli-insaturados ômega-3 (AGPIs n-3) são reconhecidos por suas propriedades moduladoras do metabolismo lipídico e da inflamação, e estão diminuídos em pacientes com NASH. O uso clínico de AGPIs n-3 tem mostrado benefício no controle da esteatose e na produção de marcadores da resposta metabólica e inflamatória em NASH, embora com algumas observações contraditórias. A compreensão de mecanismos moleculares modulados por AGPIs n-3 em NASH podem ser úteis para identificar alvos moleculares que auxiliem no desenho de intervenção farmacológica efetiva. Nesse sentido, ciências ômicas são particularmente úteis para a compreensão de mecanismos moleculares com alto valor translacional para a prática clínica e podem contribuir para a identificação desses alvos. OBJETIVO: O presente estudo avaliou a resposta proteômica hepática e lipidômica plasmática de pacientes com NASH perante o tratamento com AGPIs n-3. MÉTODO: As avaliações proteômicas e lipidômicas foram desenvolvidas por espectometria de massas e/ou cromatografia gasosa em amostras de biópsias hepáticas e plasma coletadas de pacientes envolvidos em estudo preliminar, realizado no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. O referido estudo envolveu pacientes adultos, de ambos os sexos e com diagnóstico de NASH tratados diariamente, durante 6 meses, com 3 cápsulas contendo mistura de óleo de linhaça e óleo de peixe [0,315 g AGPIs: sendo 0,065 g de ácido eicosapentaenoico (EPA), 0,050 g de docosahexaenoico (DHA) e 0,2 g alfa linolênico (ALA) por cápsula]. Pacientes, após o tratamento com AGPIs n-3, que apresentaram altas concentrações plasmáticas de ALA e/ou DHA e/ou baixas de ácido araquidônico (AA) mostraram melhora parcial das alterações de histologia hepática. No presente estudo, avaliamos as vias proteômicas e marcadores lipidômicos resultantes do tratamento com AGPIs n-3. Isto foi feito por meio da comparação, antes (grupo AT) e depois do tratamento (grupo DT), de pools de tecido hepático (análise por interactoma) e amostras de plasma (OPLS-DA). RESULTADOS: Foram identificadas proteínas hepáticas, exclusivamente e/ou alteradamente expressas, no grupo DT, relacionadas com vias de matriz celular, metabolismo lipídico, de estresse oxidativo, e de retículo endoplasmático e respiração celular. Com excessão da via de matriz celular, a análise do interactoma revelou alteração funcional significativa das vias moduladas por essas proteínas. Em conjunto, essas alterações foram sugestivas de diminuição de lipotoxicidade, estresse oxidativo e respiração anaeróbia, e aumento de respiração aeróbia após tratamento com AGPIs n-3. Estas modificações são marcadores potenciais de melhora de função de retículo endoplasmático e mitocondrial. Em adição, após o tratamento com AGPIs n-3, o perfil lipidômico plasmático mostrou-se alterado com significativo aumento de glicerofosfolípides, ALA e EPA, e diminuição de ácido araquidônico (n-6) e da razão AGPIs n-6/n-3. Estes dados são concordantes com potencial melhora das funções de retículo endoplasmático e mitocondriais. CONCLUSÃO: O tratamento com AGPIs n-3 em pacientes com NASH influenciou favoravelmente o perfil proteômico hepático e lipidômico sistêmico. Em conjunto, essas alterações sugerem melhora da função de retículo endoplasmático e mitocondrial, com potencial impacto na homeostase celular, por meio da modulação de diferentes vias biológicas / INTRODUCTION: Non-alcoholic steatohepatitis (NASH) is considered a public health problem, given its increasing incidence and its possible role in hepatocellular carcinogenesis. Current therapies involve diet and lifestyle changes, but its applicability suffers from low patients adherence. Pharmacological approaches are still missing. A main difficulty in the NASH management lies in the limited understanding of its pathophysiology, which seems to involve complex metabolic and inflammatory disturbances. Omega-3 polyunsaturated fatty acids (n-3 PUFAs) are recognized for its modulatory properties on lipid metabolism and inflammation and are decreased in patients with NASH. The clinical use of these PUFAs has shown benefit in controlling steatosis and the production of metabolic and inflammatory response markers in NASH, despite some conflicting reports. Understanding mechanisms modulated by n-3 PUFAs in NASH may be useful for identifying molecular targets that could assist in the design of effective pharmacologic interventions. In this sense, omics sciences are particularly useful for understanding molecular mechanisms with high translational value to clinical practice and may contribute to the identification of these targets. AIM: This study evaluated the liver proteomic and plasma lipidomics responses of patients with NASH towards treatment with n-3 PUFAs. METHODS: The proteomic and lipidomic evaluations were studied by mass spectrometry and / or gas chromatography in samples from liver biopsies and plasma collected from patients enrolled in a preliminary clinical trial of the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. This study involved adult patients of both sexes diagnosed with NASH treated daily for 6 months, with 3 capsules containing a mixture of linseed and fish oils [0.315 g PUFAs: 0.065 g eicosapentaenoic acid (EPA) , 0.050 g docosahexaenoic (DHA) and 0.2 g alpha linolenic acid (ALA) per capsule]. Patients, after treatment with n-3 PUFAs, with higher concentrations of ALA and DHA and lower arachidonic acid (AA) showed improvement of liver histology alterations. In the present study we evaluated the proteomics pathways and lipidomics markers resulted from treatment with PUFAs n-3. This was performed by comparing, before (BT group) and after (AT group) treatment, liver tissue pools (analysis interactome) and plasma samples (OPLS-DA). RESULTS: It was identified, in a way exclusive and altered, the expressed liver proteins in AT group, related to pathways of cellular matrix, lipid metabolism, oxidative and endoplasmic reticulum stress and cellular respiration. With the exception of cell matrix, the analysis of the interactome revealed substantial functional alterations of the pathways modulated by these proteins. Together, these changes were suggestive of decreased lipotoxicity, oxidative stress and anaerobic respiration and increased aerobic respiration following treatment with PUFAs n-3. These modifications are potential markers of endoplasmic reticulum and mitochondrial functions improvement. In addition, after treatment with n-3 PUFAs, the lipidomics profile was modified, with significant increase in glycerophospholipids, ALA and EPA and decrease of arachidonic acid (AA) and n-6/n-3 AGPIs ratio. These findings are concordant with potential improvement of reticulum endoplasmic and mitochondrial functions. CONCLUSION: In patients with NASH the treatment with n-3 PUFAs favorably influenced hepatic proteomic and systemic lipidomics profiles. Together, these changes suggest improved endoplasmic reticulum and mitochondrial functions, with potential impact on cellular homeostasis through the modulation of different biological pathways