Substanzen der pharmazeutischen und chemischen Industrie müssen nach internationalen Richtlinien auf deren Toxizität gegenüber Mensch und Umwelt geprüft werden. Dazu gehören u. a. Prüfungen zur Vorhersage des embryotoxischen Potentials, die am lebenden Organismus durchgeführt werden. Mit dem Ziel die Anzahl der Tierversuche zu verringern, die notwendig sind um das toxikologische Profil einer Prüfsubstanz zu bestimmen, wurde der Embryonale Stammzelltest (EST) entwickelt. Als Grundlage des EST dienen embryonale Stammzellen (ES-Zellen) einer Zelllinie. ES-Zellen sind Zellen, die sich in der frühen embryonalen Entwicklung in die Zellen der Keimblätter entwickeln können. Daraus wiederum differenzieren die vielen verschiedenen, unterschiedlich spezialisierten Zelltypen des komplexen Organismus. Im EST wird die Konzentration einer Prüfsubstanz bestimmt, bei der die Differenzierung von ES-Zellen zu Herzmuskelzellen zu 50 % inhibiert wird. Zusätzlich wird die Konzentration der Prüfsubstanz bestimm&#176;t, bei der 50 % der ES-Zellen (IC50D3) bzw. Fibroblastenzellen (IC503T3) absterben. Die allgemeine Toxizität ist damit von der spezifischen Toxizität der Prüfsubstanz auf die ES-Zellen und deren Differenzierung unterscheidbar. Die Parameter fliessen in ein biostatistisches Modell zur Prädiktion des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanzen ein. <br><br> Es wurde ein Versuchsprotokoll entwickelt, wonach die ES-Zellen sich verstärkt zu Endothelzellen differenzieren. Die Endothelzellen, die im lebenden Organismus die Wand der späteren Blutgefässe, wie Venen und Arterien bilden, wurden mittels molekularbiologischer Methoden auf der RNA- und der Protein-Ebene nachgewiesen und quantifiziert. Verschiedene Zellkulturmethoden, Wachstumsfaktoren, als auch Wachstumsfaktorkonzentrationen wurden auf deren Vermögen die Differenzierung der ES-Zellen zu Endothelzellen zu induzieren, untersucht. Nach der Etablierung des Differenzierungsprotokolls wurden sieben Substanzen auf deren Vermögen geprüft, die Differenzierung von ES-Zellen zu Endothelzellen zu inhibieren. Die Endothelzellen wurden dabei über die Expression der RNA von zwei endothelzellspezifischen Genen quantifiziert. Im Vergleich dazu wurden die IC50D3 und die IC503T3 der Prüfsubstanz bestimmt, um eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der Prüfsubstanz zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine Abschätzung des embryotoxischen Potentials der sieben Prüfsubstanzen in nicht-, schwach- oder stark embryotoxisch vorgenommen werden konnte. Es ist zu schlussfolgern, dass der weiterentwickelte in vitro Embryotoxizitätsassay sensitiv und reproduzierbar ist. Mit der Verwendung von verschiedenen Differenzierungsendpunkten kann die Prädiktionskraft des Assays deutlich verbessert, und die Anzahl von Tierversuchen verringert werden. Durch die Verwendung von molekularbiologischen Markern kann der Assay einem Hochdurchsatzscreening zugängig gemacht werden und damit die Anzahl von Prüfsubstanzen deutlich erhöht werden. / Compounds of the pharmaceutical and chemical industry need to be tested for their toxicological potential with regard to humans and environment following international guidelines. Tests for the prediction of the embryotoxic potential executed on living organisms are examples of these guidelines. In order to reduce the number of animal experiments necessary for the assessment of the toxicological profile of compounds the embryonic stem cell test (EST) was developed. Embryonic stem cells (ES-cells) of a cell line are used as the basis of the EST. ES-cells are cells which develop at the early embryonic development into cells of the germ layers. Out of these the many different specialized cell types of the complex organism can differentiate. With the EST this concentration of a test compound will be determined where a 50 % inhibition of the differentiation of ES-cells into cardiomyocytes can be detected. Additionally, the concentration of a test compound which is cytotoxic to 50 % of the ES-cells (IC50D3) and to 50 % of fibroblasts (IC503T3) will be determined. Therefore, general toxicity caused by the test compound on ES-cells and its differentiation can be distinguished from specific toxicity of the test compound. Determined parameters will be included into a biostatistical model for the subsequent predicition of the embryotoxic potential of test compounds. <br><br> A protocol was developed whereby the differentiation of ES-cells into endothelial cells is induced. Endothelial cells which make up the walls of blood vessels, such as arteries and veins, were detected and quantified at the RNA and the protein level applying molecular biological methods. Different cell culture methods, growth factors and growth factor concentrations were studied for their ability to induce the differentiation of ES-cells into endothelial cells. Applying the developed differentiation protocol seven compounds were tested for their potential to inhibit the differentiation of ES-cells into endothelial cells. Endothelial cells were quantified by the RNA-expression of two endothelial-specific genes. In comparison to the expression levels the IC50D3 and the IC503T3 were determined in order to assess the embryotoxic potential of the test compound. The results showed that an assessment of the embryotoxic potential of the seven test compounds into non-, weakly- and strongly embroytoxic was possible. It can be concluded that the improved in vitro embryotoxicity assay is sensitive and reproducible. With the use of different differentiation endpoints the power of predicitivity of this assay can be significantly increased and the number of animal experiments can be reduced. With the application of molecular biological markers this assay can be applied as a high througput screening and therefore the number of test compounds can be strongly increased.

Hintergrund und Fragestellung: Das NLRP3-Inflammasom ist Teil des angeborenen Immunsystems und spielt eine wichtige Rolle für pro-inflammatorische Prozesse im Rahmen der sterilen Entzündung und der Pathogenese der Atherosklerose. Das NLRP3-Inflammasom wird nicht nur durch molekulare Strukturen von Krankheitserregern, sondern auch durch endogene Gefahrensignale, wie beispielsweise oxidiertes LDL, Cholesterinkristalle, oxidativer Stress oder extrazelluläres ATP, aktiviert. Bei Aktivierung bilden sich hochmolekulare NLRP3-Inflammasomkomplexe, bestehend aus dem NLRP3-Rezeptor, dem Adapterprotein ASC und dem vom Adapterprotein gebundenen Effektorenzym Caspase-1. Im Zuge der Inflammasom-Aktivierung kommt es zur Induktion von Pyroptose, einem programmierten und mit Entzündung assoziierten Zelltod, der mit einer Porenbildung in der Zellmembran einhergeht. Dabei werden pro-inflammatorische Zytokine in ihre bioaktiven Formen gespalten und in den extrazellulären Raum freigesetzt. Neben den Zytokinen können auch ganze Inflammasomkomplexe freigesetzt werden, wodurch diese ebenfalls in die Blutzirkulation gelangen. Die Bedeutung und Wirkung dieser extrazellulären NLRP3-Inflammasome ist noch weitgehend unbekannt. Daher wurde in den beiden wesentlichen Fragestellungen der Arbeit untersucht, ob Endothelzellen extrazelluläre Inflammasomkomplexe internalisieren und dadurch pro-atherogene Effekte ausgelöst werden können und ob zirkulierende Inflammasomkomplexe im menschlichen Blut nachgewiesen werden können. Methoden und Ergebnisse: Extrazelluläre Inflammasomkomplexe konnten aus Zellüberstand von mit Inflammasom-Aktivatoren behandelten humanen Monozyten isoliert werden. Mittels Western-Blot erfolgte der Nachweis des Adapterproteins ASC und des NLRP3-Rezeptors. Durch den NLRP3-Inhibitor MCC950 konnte eine Reduktion der Freisetzung von Inflammasomkomplexen in den Zellüberstand gezeigt werden. Für die Untersuchungen der Wirkung extrazellulärer Inflammasomkomplexe auf Endothelzellen wurde eine Methode zur Isolation von fluoreszenzmarkierten NLRP3-YFP-Inflammasomkomplexen aus einer stabilen NLRP3 (p.D303N)-YFP HEK-Zelllinie etabliert. Histologische Analysen zeigten, dass diese von humanen koronaren Endothelzellen aufgenommen werden können. Die immunhistochemischen Befunde bestätigten sich in der Durchflusszytometrie (Image StreamR). Die Auswertung der immunfluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen ergab, dass im Mittel 9 % ± 2,3 % der humanen umbilikalvenösen Endothelzellen und 26 % ± 9,6 % der humanen koronararteriellen Endothelzellen NLRP3-YFP-Inflammasomkomplexe internalisierten. Expressionsanalysen zeigten, dass durch die Behandlung von humanen Endothelzellen mit NLRP3-Inflammasomkomplexen eine signifikant gesteigerte Produktion des Oberflächenadhäsionsmoleküls ICAM1 induziert wird. Im Vergleich zu unbehandelten Zellen waren die mRNA-Expression 2,5-fach und die Proteinlevel 6,9-fach erhöht. Die funktionelle Relevanz wurde durch den Nachweis einer vermehrten Adhäsion von Monozyten deutlich. Mit Calcein gefärbte Monozyten wurden vier Stunden mit koronararteriellen Endothelzellen inkubiert. Die anschließend photometrisch erhobenen Daten zeigten eine um 49,6% verstärkte Adhäsion von Monozyten an die vorher mit extrazellulären Inflammasomkomplexen behandelten Endothelzellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Die Monozytenadhäsion an das Endothel stellt einen essentiellen Schritt in der Pathogenese der Atherosklerose dar. Diese Zellkultur-Ergebnisse zeigen, dass das extrazelluläre NLRP3-Inflammasom relevanten Einfluss auf das Endothel nehmen kann. Um die klinische Relevanz von extrazellulären NLRP3-Inflammasomen zu eruieren, wurde humanes Serum auf das Adapterprotein ASC hin untersucht. Im Rahmen dieser Dissertationsarbeit wurde die Messung von ASC bei Patienten mit Sepsis als Positivkontrolle im Vergleich zu gesunden Probanden als Negativkontrolle etabliert und validiert. Im Western-Blot konnte gezeigt werden, dass Patienten mit Sepsis mehr ASC-Komplexe aufweisen als gesunde Probanden. Dieser Befund konnte in der quantitativen Auswertung mittels ASC-ELISA bestätigt werden. Es waren signifikant höhere ASC-Konzentrationen in den Serumproben der Patienten mit Sepsis (3,2 ± 0,7 ng/ml) als in gesunden Kontrollen (0,3 ± 0,1 ng/ml) nachweisbar. Diskussion: Diese Ergebnisse zeigen, dass extrazelluläre NLRP3-Inflammasomkomplexe von humanen koronararteriellen Endothelzellen aufgenommen werden und dort pro-atherosklerotische Prozesse induzieren. Die erhobenen Daten weisen damit auf eine neue Domäne der zellulären Signaltransduktion hin, welche für Endothelzellen und im Rahmen der sterilen Entzündung relevant scheint. Die Messung erhöhter ASC-Spiegel im Serum von Sepsis-Patienten lässt ebenfalls eine Assoziation von Inflammasomkomplexen mit im Körper ablaufender systemischer Inflammation annehmen. Auf dem Boden der Befunde müssen weitere Studien beantworten, ob sich die Quantifizierung zirkulierender Inflammasomkomplexe als Biomarker oder zur Risikostratifizierung eignet. Des Weiteren unterstützen die Daten zukünftige Ansätze einer therapeutischen Modulation des intra- und des extrazellulären NLRP3-Inflammasoms.

Das zeitgleiche Auftreten eines ischämischen Schlaganfalls sowie eines Takotsubo-Syndroms (TTS) scheint eine relevante, bisher nicht ausreichend verstandene klinische Konstellation zu sein. Die Pathologien können als über die Hirn-Herz-Achse gekoppelt verstanden werden, in die die Blut-Hirn-Schranke (BHS) als funktionale Komponente integriert ist. Das klinisch-neurologische Outcome dieses Patient:innen-Kollektivs scheint signifikant schlechter zu sein als nach solitärem ischämischen Insult. Es wurde hypothetisiert, dass die BHS in besonderem Maße kompromittiert sein könnte. Das vorwiegend weibliche, postmenopausale Patient:innenkollektiv präsentierte laborchemisch elevierte Katecholaminspiegel sowie Entzündungsparameter. Diese Konditionen wurden unter Sauerstoff-Glucose-Entzug (OGD) in vitro simuliert und resultierende Alterationen eines etablierten BHS-Modells aus murinen cEND-Zellen der cerebralen Mikrozirkulation untersucht. Die Evaluation der BHS-Integrität erfolgte anhand von spezifischen Junktionsproteinen sowie Integrinuntereinheiten. Alle Versuche wurden parallel unter Östrogen-Applikation (E2) durchgeführt, um die mögliche BHS-Protektion durch das weibliche Sexualhormon zu untersuchen. Die getrennte Applikation von Katecholaminen (KAT) sowie Entzündungsmediatoren (INF) führte gegenüber der simultanen Applikation zu einem geringeren BHS-Schaden. Dieser erschien zeitgebunden, wobei sich das Ausmaß gewissermaßen proportional zur Einwirkdauer verhielt. Auswirkungen von OGD sowie einer Reoxygenierung, im Sinne einer simulierten Reperfusion, potenzierten sich mit den Effekten von KAT/INF. Überwiegend kompromittierten OGD und KAT/INF die BHS-Integrität, wobei nach Reoxygenierung eine „Erholung“ oder ein „Reperfusionsschaden“ vorlag. Eine Protektion durch E2 war morphologisch nachweisbar, speziell gegenüber OGD, KAT/INF sowie einem „Reperfusionsschaden“. Auf Ebene der Gen- sowie Proteinexpression konnte dies nicht gezeigt werden. Die Homöostase des ZNS würde in vivo beeinträchtigt, Katecholamine sowie Entzündungsmediatoren könnten ungehindert das bereits durch die Ischämie geschädigte neuronale Gewebe erreichen. Insgesamt trägt diese Arbeit zu einem Verständnis der molekularen BHS-Veränderungen im Kontext des zeitgleichen Auftretens von TTS und einem ischämischem Insult bei. Es wurde eine experimentelle Grundlage geschaffen, um zukünftig pathogenetische Hintergründe weiter erforschen zu können. Darauf aufbauend könnten, nach weiterer in vitro- sowie in vivo-Forschung, klinische Therapiekonzepte optimiert werden. / The simultaneous occurrence of ischemic stroke and Takotsubo syndrome (TTS) seems to be a relevant clinical constellation that is not yet sufficiently understood. The pathologies can be understood as being linked via the brain-heart axis, into which the blood-brain barrier (BBB) is integrated as a functional component. The clinical and neurological outcome of these patients appears to be significantly worse than after a solitary ischemic insult. It has been hypothesized that the BBB may be compromised. The predominantly female, postmenopausal patients presented elevated catecholamine levels and inflammatory markers. These conditions were simulated in vitro under oxygen-glucose deprivation (OGD) condition. Resulting alterations were examined by using an established BBB model: cEND cells of the murine cerebral microcirculation. The BBB integrity was evaluated by investigating specific junction proteins and integrin subunits. All experiments were conducted parallel with estrogen application (E2) in order to investigate a possible BBB protection by the female sexhormone. The separate application of catecholamines (CAT) or inflammatory mediators (INF) led to less BBB damage compared to simultaneous application. This appeared to be time-bound being proportional to the duration of exposure. The effects of OGD and reoxygenation, in the sense of simulated reperfusion therapy, were potentiated by the effects of CAT/INF. Predominantly, OGD and KAT/INF compromised BBB integrity. “Recovery” or “reperfusion injury” occurred after reoxygenation. Protection by E2 was morphologically detectable, especially against OGD, CAT/INF and “reperfusion injury”. This could not be shown at the level of gene or protein expression, respectively. The homeostasis of the CNS would be impaired in vivo, catecholamines and inflammatory mediators would be able to reach the neuronal tissue that had already been damaged by ischemia. Overall, this work contributes to an understanding of the molecular changes in the BBB in the context of the simultaneous occurrence of TTS and ischemia. An experimental basis was created to enable further research into pathogenetic background. Based on this, clinical therapies could be optimized after further in vitro and in vivo research.

The purpose of this study was the investigation of several transport systems expressed at the BBB. The identification and functional characterization of such transport systems is essential to provide a basis for strategies to regulate drug disposition into the brain. Immortalized rat brain endothelial cells (RBE4 cells) have been used in this study as an in vitro model of the BBB. The present study has shown that the RBE4 cells are a suitable model of the BBB for transporter studies. These cells do express the amino acid transport systems L and y+, which are known to be present at the BBB. The uptake of L-tryptophan, a neutral amino acid transported by system L, exhibited a half saturation constant (Kt) of 31 µM and a maximal velocity rate (Vmax) of about 1 nmol/mg/min in RBE4 cells. The kinetic constants of the L-arginine uptake, representing system y+ transport activity, into RBE4 cells were determined with a Kt value of about 55 µM and a Vmax of 0.56 nmol/mg/min. Furthermore the expression of two sodium dependent transporters, the 5-HT transporter (SERT) and the organic cation/carnitine transporter OCTN2, was shown at the RBE4 cells. Uptake studies with radiolabeled 5-HT exhibited a saturable, sodium dependent transport at RBE4 cells with a Kt value of about 0.40 µM and a Vmax of about 52 fmol/mg/min. L-carnitine and TEA (tetraethylammonium) are known to be transported by the OCTN2 transporter. The uptake of L-carnitine into RBE4 cells was shown to be sodium dependent and saturable with a Kt value of 54 µM and a maximal velocity of about 3.6 pmol/mg/min. In contrast, the organic cation TEA follows a sodium independent uptake mechanism at RBE4 cells. Also a sodium independent choline uptake into the cells was discovered but the molecular identity remained unknown. This saturable choline transport exhibited a Kt value of about 22 µM and a maximal velocity of about 52 pmol/mg/min.

The purpose of this study was the investigation of several transport systems expressed at the BBB. The identification and functional characterization of such transport systems is essential to provide a basis for strategies to regulate drug disposition into the brain. Immortalized rat brain endothelial cells (RBE4 cells) have been used in this study as an in vitro model of the BBB. The present study has shown that the RBE4 cells are a suitable model of the BBB for transporter studies. These cells do express the amino acid transport systems L and y+, which are known to be present at the BBB. The uptake of L-tryptophan, a neutral amino acid transported by system L, exhibited a half saturation constant (Kt) of 31 µM and a maximal velocity rate (Vmax) of about 1 nmol/mg/min in RBE4 cells. The kinetic constants of the L-arginine uptake, representing system y+ transport activity, into RBE4 cells were determined with a Kt value of about 55 µM and a Vmax of 0.56 nmol/mg/min. Furthermore the expression of two sodium dependent transporters, the 5-HT transporter (SERT) and the organic cation/carnitine transporter OCTN2, was shown at the RBE4 cells. Uptake studies with radiolabeled 5-HT exhibited a saturable, sodium dependent transport at RBE4 cells with a Kt value of about 0.40 µM and a Vmax of about 52 fmol/mg/min. L-carnitine and TEA (tetraethylammonium) are known to be transported by the OCTN2 transporter. The uptake of L-carnitine into RBE4 cells was shown to be sodium dependent and saturable with a Kt value of 54 µM and a maximal velocity of about 3.6 pmol/mg/min. In contrast, the organic cation TEA follows a sodium independent uptake mechanism at RBE4 cells. Also a sodium independent choline uptake into the cells was discovered but the molecular identity remained unknown. This saturable choline transport exhibited a Kt value of about 22 µM and a maximal velocity of about 52 pmol/mg/min.