Made available in DSpace on 2018-08-01T23:26:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10705_77 - Esequiel Santos.pdf: 4699017 bytes, checksum: 5fc00aa9ef34cb4c3df7b834203d08c2 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Diversos fatores podem interferir no desempenho da fitorremediação de herbicidas no solo, em particular a mineralogia e a atividade microbiana. Com o objetivo de realizar investigações em condições edáficas, utilizando as espécies Canavalia ensiformis e Crotalaria juncea, foi avaliado o efeito da mineralogia e da rizosfera na fitorremediação do herbicida sulfentrazone. Na primeira etapa, os tratamentos foram compostos pela combinação entre três tipos de solos, com texturas diferentes, variando quanto à mineralogia da fração argila dominada por um tipo de mineral (caulinita, hematita e gibbsita) e duas doses de sulfentrazone (0 e 400 g ha-1), dispostos em esquema fatorial 3 x 3 x 2, em DBC, com três repetições. Para o bioensaio, foi semeada uma espécie bioindicadora de resíduo de sulfentrazone no solo, o milheto (Pennisetum glaucum). Os resultados demonstraram que a movimentação do herbicida foi maior no solo caulinítico e a retenção do herbicida foi maior no solo hematítico. A fitorremediação foi mais eficiente no pré-cultivo da C. ensiformis no solo gibbsítico, reduzindo em 28% a carga de sulfentrazone aplicada. Não houve resultado para o solo hematítico. No solo caulinítico, a C. ensiformis reduziu a massa total de sulfentrazone em aproximadamente 11% e a C. juncea em 19%. Na segunda etapa, avaliou-se também a contribuição microbiana rizosférica dessas mesmas espécies na fitorremediação do sulfentrazone. Os tratamentos foram compostos pela combinação de dois solos rizosféricos (feijão de porco e crotalária) e um não-rizosférico com quatro níveis de contaminação pelo herbicida sulfentrazone (0, 200, 400 e 800 g ha-1), dispostos em esquema fatorial 3 x 4. Foram avaliados evolução de CO2, carbono da biomassa microbiana (CBM), quociente metabólico (qCO2), componentes biométricos e fitotoxidade no P. glaucum, em bioensaio e cromatografia líquida do solo. Os resultados indicaram que o cultivo das espécies fitorremediadoras promoveu incremento da atividade microbiana e foi verificado que os perfis genéticos bacterianos foram formados de acordo com a planta e a característica de solo (rizosférico e não rizosférico), ampliando os conhecimentos a respeito das associações entre as plantas e microrganismos.

Ureases são enzimas que realizam hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono e são isoladas de plantas, fungos e bactérias. A urease de C. ensiformis (JBU) tem algumas atividades biológicas independentes da sua atividade enzimática, como por exemplo: agregação plaquetária e efeito inseticida. O efeito inseticida é devido à liberação de um peptídeo interno por enzimas digestivas específicas dos insetos. Este peptídeo foi isolado, caracterizado e um análogo recombinante foi obtido e denominado Jaburetox-2Ec. Somente insetos com enzimas digestivas acídicas, como catepsinas, são capazes de liberar o peptídeo tóxico a partir da hidrólise de JBU. Insetos com enzimas básicas do tipo tripsina não são suscetíveis pois não há formação do peptídeo tóxico. Ninfas de D. peruvianus são sensíveis aos efeitos da JBU enquanto adultos não são. Este trabalho teve como objetivo estudar as diferenças enzimáticas entre os dois estágios do inseto para elucidar o processamento diferencial da JBU. Realizando a hidrólise in vitro da JBU com o homogeneizado de intestino de ninfas e adultos foi visto que tanto adultos como ninfas hidrolisam a JBU, mas somente ninfas liberam o peptídeo tóxico identificado pelo anticorpo específico anti-Jaburetox-2Ec. Ainda, através de ensaios enzimáticos utilizando substratos fluorogênicos e inibidores específicos, foi observada uma diferença no pH ótimo de atividade e na susceptibilidade a inibidores das enzimas digestivas presentes nos dois estágios. Substratos fluorogênicos correspondentes às regiões flanqueadoras do peptídeo dentro da JBU intacta foram desenhados e testados com os dois homogeneizados, o que também revelou que os homogeneizados dos dois estágios têm ação diferencial sobre estes substratos, sendo que ninfas liberariam mais eficientemente a extremidade Nterminal do peptídeo quando comparado aos adultos. Verificamos ainda que, em estudos eletrofisiológicos utilizando a técnica de “Planar Lipid Bilayer”, tanto a JBU como o Jaburetox-2Ec são capazes de se inserir em membrana lipídica planar, formando canais iônicos. Os canais formados pela JBU apresentaram quatro níveis de condutância majoritárias e seletividade para íons cloreto. / Ureases are enzymes that hydrolyze urea in ammonium and carbon dioxide and they have been isolated from plants, fungi and bacteria. Jackbean urease, from Canavalia ensiformis (JBU) displays biological activities unrelated from its enzymatic activity, as platelet aggregation and insecticide effect. This insecticide effect is due to the release of an internal peptide by insect specific digestive enzymes. This peptide was isolated, characterized and the recombinant peptide obtained was called Jaburetox- 2Ec. Only insects that rely on cathepsin-like digestive enzymes are able to hydrolyze JBU and release the toxic peptide. Insects with alkaline enzymes like tripsins are not susceptible because they don’t release the toxic peptide. Nymphs of D. peruvianus are susceptible to JBU effects while adults are not. The goal of this work was to study the enzymatic differences between both insect stages to elucidate JBU’s differential processing. In vitro hydrolysis were performed with nymphs and adults midgut homogenates and we observed that both adults and nymphs hydrolyze JBU but only nymphs are able to release the toxic peptide identified by Jaburetox-2Ec antibodies. Furthermore, in enzymatic assays using different fluorogenic substrates and specific inhibitors a difference in optimum pH and susceptibility to inhibitors of the digestive enzymes in both stages was observed. Fluorogenic substrates corresponding to the flanking regions of the peptide inside the intact JBU were produced and tested with both homogenates. Homogenates from both stages have differential action upon these substrates, considering that nymphs hydrolyses more efficiently the N-terminal of the peptide compared to adults. In electrophysiological studies using the Planar Lipid Bilayer technique we verify that JBU and Jaburetox-2Ec are able to insert in planar lipid membrane forming ionic channels. JBU’s channels display four major conductance levels and selectivity for chloride íons.

Ureases são enzimas níquel-dependentes que catalisam a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono. Além disso, apresentam diversas propriedades independentes da catálise, sendo consideradas proteínas moonlighting. São amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas em bactérias, arqueas, plantas e fungos, podendo se organizar em unidades funcionais compostas por uma, duas ou três subunidades. Sua ativação, que envolve a passagem da enzima de sua forma apo-urease a sua forma holourease, requer pelo menos três proteínas acessórias. Parte de suas propriedades não-catalíticas é associada à liberação de peptídeos internos da proteína nativa. Nesse contexto, a presente tese se dedicou ao estudo de diferentes aspectos da biologia estrutural de ureases. Ao elaborar uma narrativa filogenética, envolvendo varredura de bancos de dados em larga escala e diferentes algoritmos de reconstrução de árvores, foi possível propor uma rota evolutiva indicando a transição de três subunidades para uma única unidade funcional, sem passar por intermediários de duas cadeias. Quanto ao seu processo de ativação, por meio de múltiplos cálculos de atracamento baseados em dados experimentais prévios (especialmente SAXS), foram propostas estruturas para suas diferentes etapas, em resolução atomística. Finalmente, o comportamento dinâmico de diferentes peptídeos derivados de urease foram analisados computacionalmente por meio de simulações de longa duração (500 ns) e associados a outros dados obtidos in vitro, permitindo justificar efeitos diferenciais obtidos na aplicação destes peptídeos. De maneira geral, o trabalho empregou técnicas computacionais à análise de ureases, fornecendo bases para futuros estudos de suas propriedades, sejam catalíticas ou não, incluindo sua aplicação biotecnológica. / Ureases are nickel-dependent enzymes that catalyze the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide. They have many catalysis-independent properties, being considered moonlighting proteins. Ureases are found in bacteria, archaea, plants, and fungi, and may be organized in functional units composed by one, two, or three subunits. Their activation, involving the transition from apo to holourease, requires at least three accessory proteins. Some of their non-catalytic properties are related to the release of internal peptides from the native protein. In this context, this thesis was developed upon the study of different aspects of urease structural biology. By phylogenetical reconstruction, employing large-scale databank scans and different tree-building algorithms, we were able to propose an evolutionary route by which the transition from three to one functional subunits was possible, with no need for a two-chained intermediate. Regarding the activation mechanism, we have proposed structural models for the oligomeric intermediates of the process by multiple docking calculations, at atomistic resolution, based on previous experimental data (especially SAXS). Additionally, the dynamical behavior of different ureasederived peptides was analyzed by computational simulations at large time scales (500 ns) and correlated to in vitro results, allowing us to explain the variable effects observed after their application on test systems. In short, in this work we have employed computational techniques to the analysis of urease, providing working grounds for further studies of this enzyme and its properties (catalytical or not), including its biotechnological applicability.

A ampla distribuição das ureases na natureza é um indício da grande importância desta enzima para os mais diferentes organismos, fato que levou diversos pesquisadores ao redor do globo a dedicarem-se exclusivamente à caracterização destas enzimas. Apesar de ser uma proteína estudada ha quase um século, até o início deste trabalho apenas três ureases possuíam suas estruturas cristalográficas elucidadas e todas de origem bacteriana. A urease de Canavalia ensiformis (JBU) foi a primeira enzima desta família a ser descrita, em 1926 e ainda assim, apesar dos incansáveis esforços de diferentes grupos na caracterização estrutural e biológica desta proteína, sua estrutura cristalográfica só foi obtida no primeiro semestre de 2010. Tentativas anteriores de obtenção da estrutura cristalográfica de JBU falharam devido a baixa qualidade dos cristais formados por esta proteína através de técnicas convencionais de cristalização. Desta forma, na primeira parte deste trabalho relatamos o uso de técnicas alternativas de cristalização como o uso de ligantes ou aditivos, proteólise in situ e modificação química de resíduos de amino ácidos na obtenção de cristais de JBU com qualidade superior aos anteriormente obtidos, validando o uso destas metodologias na cristalização de proteínas recalcitrantes. Os cristais aqui obtidos, apesar de apresentarem qualidade superior aos previamente descritos na literatura, não foram otimizados ao ponto de obtenção da estrutura cristalográfica da enzima A atividade enzimática das ureases é dependente da presença de dois íons de níquel precisamente incorporados em seus sítios ativos. A biossíntese deste sítio ativo, bem como a incorporação de níquel na enzima consiste de um processo altamente regulado, cuja ocorrência depende da participação de diversas chaperonas (proteínas acessórias) agindo como reguladores pós traducionais. Apesar dos esforços já realizados, o mecanismo de ativação de ureases ainda permanece obscuro. Até hoje, os estudos concentraram-se em ureases de origem microbiana, sendo a informação disponível ainda extremamente limitada. Menos ainda é conhecido para o sistema de ativação de ureases de origem vegetal. Na segunda parte deste trabalho relatamos pioneiramente as primeiras tentativas de produção e caracterização de proteínas acessórias de origem vegetal. As proteínas UreD, UreF e UreG de soja (Glycine max) foram clonadas e expressas em sistema bacteriano. A proteína UreG de soja, purificada diretamente da planta e também produzida de forma recombinante em E.coli, foi caracterizada quanto a sua estrutura, capacidade de ligação a metais e atividade GTPásica, descrevendo algumas características nunca antes observadas para outras proteínas da mesma família. Também descrevemos o primeiro sucesso na obtenção da proteína acessória UreF tipo 5 selvagem na sua forma solúvel e a caracterização estrutural desta proteína foi realizada. As proteínas acessórias de soja também foram caracterizadas em relação ao seu perfil de expressão em diferentes tecidos, ao longo do desenvolvimento da planta, utilizando PCR em tempo real. Observamos uma grande variação dos níveis de expressão dos diferentes mRNAs nos tecidos avaliados. Uma possível relação entre estes níveis de expressão e a atividade ureásica de cada tecido foi investigada, visando uma melhor compreensão da dinâmica entre a expressão e atividade das proteínas responsáveis pela ativação das ureases vegetais. / The wide distribution of ureases in nature is an indication of the importance of this enzyme for the most different organisms, fact that lead researchers all over the world to dedicate their careers exclusively to the study of these enzymes. Despite of being studied for almost a century, until last year only three crystallographic structures of ureases had been solved, all from bacterial source. The urease from Canavalia ensiformis (JBU) was the first member of this family to be described, in 1926 and still, despite the restless efforts from different research groups on the structural and biological characterization of this protein, its structure was not solved until the beginning of 2010. Early trials to obtain the crystallographic structure of JBU have failed due to the poor quality crystals formed by this protein using conventional crystallization techniques. In this panorama, the first part of this work describes the use of alternative crystallization techniques, such as the use of ligands, in situ proteolisis and chemical modification of amino acid residues, for the obtention of JBU crystals with superior quality than the ones previously described in the literature, validating the use of such techniques on the crystallization of recalcitrant proteins. The crystals obtained here, despite of their superior characteristics, were not refined to the point of generating the crystallographic structure of JBU. The enzymatic activity of ureases is dependent of the presence of nickel ions precisely incorporated in their active sites. The bioassembly of these active sites, including the nickel incorporation, consist of a tightly regulated process, whose occurence depends on the participation of several chaperones (accessory proteins) that work as post-translational regulators. A great deal of effort has already been done on the study of the urease’s activation process; however its details remain unclear. To date, all work done concentrates on the study of microbial ureases, but the available information is very limited and even less information is available for the plant ureases activation process. The second part this work presents the first trials on the production and characterization of plant urease accessory proteins. The proteins UreD, UreF and UreG from soybean (Glycine max) were cloned and expressed in bacterial system. The soybean UreG protein, purified directly from the plant seeds and also produced in recombinant fashion in Escherichia coli, was characterized regarding its structure, metal biding capacity and GTPasic activity, describing a few characteristics never before observed for other proteins of the same family. It is also described the first success on the obtention of the wild type ureF accessory protein in its soluble form and a structural characterization was performed. All accessory proteins from soybean were also characterized for its expression profile in several tissues during its development utilizing real-time PCR and a correlation with the levels of urease activity were investigated. Altogether, these data improve the understanding of multiple factors involved on the urease activation process.

Ureases (EC 3.5.1.5) são metaloenzimas que hidrolisam uréia para produzir amônia e dióxido de carbono. Essas proteínas têm atividade inseticida e fungicida, efeitos independentes da sua atividade ureolítica. A atividade inseticida de ureases depende, em parte, da liberação de peptídeos internos através da hidrólise por catepsinas digestivas do inseto. Um desses peptídeos foi isolado e um recombinante chamado Jaburetox –V5 foi produzido em E. coli a partir da sequência da urease. Outra propriedade relevante de ureases é sua atividade antifúngica, que ocorre em concentrações de 10-7 M para certos fungos filamentosos, causando danos à membrana celular, visualizados por microscopia eletrônica de varredura. Moléculas antifúngicas de origem vegetal representam uma alternativa estratégica para o surgimento de espécies resistentes de fungos. Sabendo que a atividade antifúngica das ureases é cerca de 3-4 de magnitude mais ativa do que a maioria das proteínas antifúngicas já descritas, neste trabalho, avaliamos o efeito tóxico da urease de C. ensiformis (JBU) sobre diferentes espécies de leveduras. Além disso, buscamos identificar as regiões responsáveis por essa atividade através da fragmentação da JBU por hidrólise enzimática. Os efeitos tóxicos da JBU também ocorrem em espécies de leveduras, indicando que atividade antifúngica não afeta somente fungos filamentosos. Os efeitos da JBU nas leveduras variam conforme o gênero e a espécie, tanto em termos qualitativos como quantitativos, indicando seletividade espécie-específica. Os efeitos fungitóxicos consistem de inibição da multiplicação, indução de alterações morfológicas com formação de pseudo-hifas, alterações do transporte de H+ e no metabolismo energético, permeabilização de membranas, podendo ocorrer morte celular. Nas condições testadas, não houve produção de espécies reativas de oxigênio associada ao efeito fungitóxico da JBU. A hidrólise da JBU com papaína produziu fragmentos tóxicos com massa molecular ~10 kD. Esses hidrolisados foram analisados por espectrometria de massas e um fragmento contendo parte da sequência N-terminal do peptídeo entomotóxico Jaburetox foi encontrado. A atividade fungitóxica do peptídeo recombinante Jaburetox – V5 foi testada, sendo observada atividade tóxica sobre leveduras e fungos filamentosos. A atividade antifúngica do Jaburetox-V5 requer concentrações 2-3 vezes maiores do que aquela observada para a holoproteína JBU, indicando a possibilidade de que outros domínios da proteína estejam envolvidos nessa atividade. A descoberta de novos agentes antifúngicos é urgente e imperativa, devido ao crescente número de casos de micoses invasivas. Ureases de plantas, como a JBU, e peptídeos derivados, podem representar uma nova alternativa para controle de fungos de importância clínica e fitopatogênicos, principalmente em se considerando a potente atividade, na faixa de 10-6 a 10-7 M . Estudos estrutura versus atividade adicionais, aprofundando a identificação de domínios antifúngicos, e a construção de recombinantes contendo esses domínios, são etapas futuras para avaliar o real potencial fungicida/fungistático das ureases e peptídeos derivados. / Ureases (EC 3.5.1.5) are metalloenzymes that hydrolyze urea to produce ammonia and carbon dioxide. These proteins have insecticidal and fungicidal effects not related to their enzyme activity. The insecticidal activity of urease is mostly dependent on the release of internal peptides consequent to hydrolysis of the ingested protein by insect digestive cathepsins. One of these peptides was isolated and its recombinant version, named Jaburetox-V5, was produced in E. coli. Another important property of ureases is their antifungal activity, which occurs at concentrations of 10-7 M for certain filamentous fungi, causing damage to the cell membranes, as visualized by scanning electron microscopy. Antifungal molecules from plants represent an alternative strategy to the emergence of resistant fungal species. Considering that the antifungal activity of urease is about 3-4 orders of magnitude more potent than most of the antifungal proteins already described, in this study, we evaluated the toxic effect of Canavalia ensiformis urease (JBU) on different species of yeast. Furthermore, studies aiming to identify antifungal domain(s) of JBU by enzymatic hydrolysis were carried out. The results showed that JBU exerts toxic effects on yeast species, indicating that antifungal activity is not restricted to filamentous fungi. The effects of JBU in yeast varied according to the genus and species of yeasts, both in qualitative and quantitative terms, indicating a species-specific selectivity. The fungitoxic effects consisted in inhibition of proliferation, induction of morphological alterations with formation of pseudo hyphae, changes in the transport of H+ and carbohydrate metabolism, permeabilization of membranes, eventually leading to cell death. Under the conditions tested, there was no production of reactive oxygen species associated with the antifungal effect of JBU. Hydrolysis of JBU with papain resulted in fungitoxic fragments with molecular mass ~ 10 kD. These peptides were analyzed by mass spectrometry, revealing the presence of a fragment containing the Nterminal sequence of the entomotoxic peptide Jaburetox. We tested the recombinant peptide Jaburetox-V5 for antifungal effects and observed fungitoxic activity on yeast and filamentous fungi. The antifungal activity of Jaburetox-V5 requires 2-3 times larger concentrations than those observed for the holoprotein JBU, indicating the possibility that other protein domains are involved in this activity. The discovery of new antifungal agents is imperative to face the increasing number of cases of invasive mycoses. Plant ureases, such as JBU, and its derived peptides, may represent a new alternative to control medically important and phytopathogenic fungi, especially considering their potent activity in the range of 10-6 to 10-7 M. More studies are necessary to clarify the structure versus activity relationships of ureases. Construction of mutants containing ureasederived antifungal domains is one of the necessary steps to assess the real fungicidal/ fungistatic potential of ureases and derived peptides.

Endopeptidases de diversas classes da semente quiescente e plântulas de Canavalia ensiformis foram investigadas neste trabalho. Aplicando técnicas de purificação e caracterização de proteínas identificamos e isolamos endopeptidases representantes de aspártico endopeptidases, serino endopeptidases, e uma enzima forte candidata à ser uma sedolisina, uma família de endopeptidases serínicas ainda não descrita em plantas. Também investigamos a mobilização da urease/canatoxina, isoformas de proteínas inseticidas presentes nas sementes da Canavalia ensiformis. Por estudos de auto-digestão e análise por técnicas imunoquímicas, foi possível observar a ação de enzimas atuantes em pH 4 sobre a urease/ canatoxina.Os fragmentos derivados da urease formados pelas enzimas da própria planta são diferentes do fragmento liberado pela hidrólise da canatoxina por catepsinas digestivas nos insetos suscetíveis alimentados com a proteina. Duas enzimas atuantes em pH ácido forma caracterizadas, sendo que o nterminal e fragmentos oriundos por hidrólise tríptica da enzima de C. ensiformis sensível à tirostatina revelaram similaridade com metaloproteínas e metaloproteases. Também foi possível a caracterização de uma atividade serino endopeptidásica presente ao longo de todo o processo germinativo e de desenvolvimento inicial da planta. Concluímos que a Canavalia ensiformis possui diversos sistemas enzimáticos atuando durante a germinação, e que a urease foi hidrolisada por enzimas endógenas da planta em pH ácido, da mesma forma que acontece nos insetos suceptíveis ao efeito tóxico da proteína, mas liberando fragmentos diferentes. Entre as endopeptidases da planta caracterizadas neste trabalho, identificamos uma enzima com características de uma sedolisina, uma família de proteínas ainda não descrita em vegetais. / Endopeptidases from the quiescent seed and early stages of developing Canavalia ensiformis plants were studied in this work. Using raw protein extract purification and separation approaches, we were able to characterize aspartic and serine endopeptidases. An enzyme with characteristics to be a candidate of sedolisin family, which belongs to serine endopeptidase class, was also characterized. This enzyme family was not described in plants yet. The mobilization of urease/canatoxin, isoforms of an entomot oxic protein, present in Canavalia seeds, was also investigated. Using immunological techniques, we demonstrated that urease/ canatoxin is hydrolyzed by endogenous acidic enzymes which release peptides different from those formed by cathepsins B and D in susceptible insects fed with the insecticidal protein. Two acidic enzymes were purified and characterized. The N-terminal sequence and MS-analysis of trypsin peptides of a tyrostatin sensitive enzyme indicate its similarity with metaloproteins and metalloproteinases. Serine endopeptidase activities found in the quiescent seed and during early stages of germination and in developing plants were also described. In summary, different enzymatic mechanisms participate in germination and early development of Canavalia ensiformis plants. Urease /canatoxin was hydrolyzed by acidic endopeptidases present in the seed but the released fragments are different from those formed by insect digestive enzymes. Among the endopeptidases described in this work we found evidences of the presence of a sedolisin, a type of enzyme so far reported in plants.

As sementes de Canavalia ensiformis são fonte de várias proteínas de interesse bioquímico e biotecnológico, como urease (JBU) e a canatoxina (CNTX). Ureases são enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise de uréia em amônia e carbamato encontradas em plantas, fungos e bactérias. A canatoxina, uma proteína tóxica isolada a partir da mesma semente em 1981 por Carlini & Guimarães é uma isoforma de urease. A CNTX e a urease possuem atividade inseticida, sendo que o efeito entomotóxico se deve à produção de fragmentos das proteínas, gerados pela ação das enzimas digestivas dos insetos. Apenas grupos de insetos com digestão baseada em enzimas acídicas são suscetíveis à toxina. O mecanismo de ação da CNTX e peptídeos gerados a partir da sua hidrólise não está claramente elucidado. Considerando o potencial das isoformas de ureases de C. ensiformis e peptídeos derivados para desenvolvimento de inseticidas, é importante investigar os mecanismos de ação e os órgãos ou tecidos–alvos de sua toxicidade nos insetos. Esse trabalho teve como objetivo testar diferentes protocolos visando a imunolocalização da toxina e/ou seus fragmentos em diferentes tecidos do inseto modelo Dysdercus peruvianus, um percevejo praga da cultura do algodão. Mesmo testando diferentes condições experimentais, observamos reação cruzada dos anticorpos anti-urease com os tecidos do inseto D. peruvianus, inviabilizando os estudos de imunolocalização. Considerando que a semente de algodão apresenta uma urease endógena ainda pouco caracterizada, e o alto grau de homologia existente entre ureases de diferentes fontes vegetais, a reação cruzada observada nos tecidos dos insetos pode ser devido à presença da urease do algodão e de seus fragmentos, provenientes do alimento consumido. Outras tentativas de identificação de alvos moleculares do inseto que interagem in vitro com a urease foram feitas, como ensaios de ligand blot e cromatografia de afinidade, mas estes não apresentaram resultados conclusivos. A produção de anticorpos monoclonais contra as diferentes isoformas de ureases de C. ensiformis está entre as alternativas possíveis para atingir nosso objetivo. Numa primeira tentativa, camundongos foram imunizados com uma mistura de isoformas da urease de C. ensiformis, que apresentam cerca de 85% de identidade, resultando na produção de anticorpos com especificidades diferenciadas para JBU e para a CNTX. Obtivemos 22 clones positivos: dois apresentaram maior especificidade pela CNTX (cerca de 4 vezes); dois clones foram mais específicos para urease (cerca de 2 vezes) e um foi capaz de reconhecer um peptídeo inseticida recombinante derivado da urease, com maior especificidade (resposta 1,5 maior do que CNTX ou JBU). Os resultados demonstraram que é possível produzir anticorpos monoclonais que diferenciam as diferentes ureases de C. ensiformis, para uso futuro em imunohistoquímica.

Ureases (EC 3.5.1.5) são enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise da uréia para formar amônia e dióxido de carbono. Elas têm sido isoladas de uma ampla variedade de organismos incluindo plantas, fungos e bactérias, porém não são sintetizadas por animais. As sementes de Canavalia ensiformis são ricas em isoformas de urease, tal como a Canatoxina (CNTX) e JBU (jackbean urease, do inglês). A CNTX é uma proteína neurotóxica, causando diversos efeitos biológicos após injeção por via intraperitoneal em ratos e camundongos, entre eles, atividades pró- inflamatórias e indutora de agregação plaquetária, convulsões, e finalmente, morte dos animais. A CNTX também apresenta efeitos inseticida e antifúngico, potencialmente relevantes para a defesa da planta de origem. Após anos de estudos com a CNTX, verificou-se que JBU também compartilha essas atividades biológicas, como efeitos inseticida e fungitóxico, ativação de plaquetas e de células inflamatórias, incluindo letalidade em ratos e camundongos (por via intravenosa). Na busca pelo mecanismo de ação inseticida, identificou-se um fragmento da urease com efeito letal em insetos, denominado Jaburetox (Jbtx). Indícios da interação desses polipeptídeos com membranas lipídicas nos levou a estudar de que forma esse fenômeno ocorre. Fragmentos do Jbtx originados de mutações sítio-dirigidas foram testados a fim de investigar a relação estrutura X função. Foram usados neste estudo, além de JBU e Jbtx, a porção amino-terminal do Jbtx isolada, chamada de Jbtx N-ter, a sua região carboxi-terminal, ou Jbtx C-ter, e ainda o peptídeo com a região do grampo beta removida, ou Jbtx Δ-β. Por meio de ensaios com lipossomos, foi possível certificar-se que todas as proteínas ligam-se e interagem com as vesículas de maneira muito similar. A capacidade das moléculas de inserção em bicamadas lipídicas foi confirmada através da técnica de planar lipid bilayer, determinando-se as propriedades biofísicas dos canais formados, e sugerindo que o peptídeo Jbtx representa a principal região da JBU capaz de interagir com membranas biológica. Os resultados contribuem para a compreensão mais aprofundada dos mecanismos de ação de ureases e peptídeos derivados, assim como das relações estrutura x função implicadas nesses mecanismos. / Ureases (EC 3.5.1.5) are niquel dependent enzymes that hydrolyse urea into ammonium and carbon dioxide. They have been isolated from many organisms, including plants, fungi and bacteria, but are not synthesized by animals. Canavalia ensiformis seeds are source of urease isoforms, like Canatoxin (CNTX) and jackbean urease (JBU). CNTX is a neurotoxic protein, displaying several biological effects after intraperitoneal injection in rats or mice, including proinflammatory and platelet aggregation activity, and convulsions followed by death of the animals. CNTX also presents insecticidal and fungitoxic effects, which are probably relevant for defense mechanisms of the source plant. After some years of studies, it was found that JBU also share these biological activities, such as entomotoxic and antifungal effects, activation of platelets and inflammatory cells, including lethality in rats and mice (intravenously). In the search for the insecticidal mode of action, an urease fragment lethal to insects was identified and named Jaburetox (Jbtx). Evidence of the interaction of these polypeptides with lipid membranes led us to investigate how this phenomenom takes place. Site-directed mutagenesis to obtain Jbtx fragments was applied in the search for structure X function relationships. Besides JBU and Jbtx, a peptide corresponding to Jbtx’s amino-terminal half (Jbtx N-ter), a peptide corresponding to Jbtx’s carboxi-terminal half (Jbtx C-ter) and a mutant with deletion of a beta hairpin motif (Jbtx Δ-β) were used in the present study. Working with liposomes it was possible to verify that all proteins bind and interact with vesicles, in a similar way. The ability of these molecules to insert into lipid bilayers was confirmed through the planar lipid bilayer technique. The biophysical properties of the ion channels formed by each polypeptide were characterized, suggesting that Jbtx is the main region from JBU able to interact with lipid membranes. The results contribute to deepen our understanding of the modes of action of JBU and derived peptides, as well as of the structure X function relationships involved in these mechanisms.

A ampla distribuição das ureases na natureza é um indício da grande importância desta enzima para os mais diferentes organismos, fato que levou diversos pesquisadores ao redor do globo a dedicarem-se exclusivamente à caracterização destas enzimas. Apesar de ser uma proteína estudada ha quase um século, até o início deste trabalho apenas três ureases possuíam suas estruturas cristalográficas elucidadas e todas de origem bacteriana. A urease de Canavalia ensiformis (JBU) foi a primeira enzima desta família a ser descrita, em 1926 e ainda assim, apesar dos incansáveis esforços de diferentes grupos na caracterização estrutural e biológica desta proteína, sua estrutura cristalográfica só foi obtida no primeiro semestre de 2010. Tentativas anteriores de obtenção da estrutura cristalográfica de JBU falharam devido a baixa qualidade dos cristais formados por esta proteína através de técnicas convencionais de cristalização. Desta forma, na primeira parte deste trabalho relatamos o uso de técnicas alternativas de cristalização como o uso de ligantes ou aditivos, proteólise in situ e modificação química de resíduos de amino ácidos na obtenção de cristais de JBU com qualidade superior aos anteriormente obtidos, validando o uso destas metodologias na cristalização de proteínas recalcitrantes. Os cristais aqui obtidos, apesar de apresentarem qualidade superior aos previamente descritos na literatura, não foram otimizados ao ponto de obtenção da estrutura cristalográfica da enzima A atividade enzimática das ureases é dependente da presença de dois íons de níquel precisamente incorporados em seus sítios ativos. A biossíntese deste sítio ativo, bem como a incorporação de níquel na enzima consiste de um processo altamente regulado, cuja ocorrência depende da participação de diversas chaperonas (proteínas acessórias) agindo como reguladores pós traducionais. Apesar dos esforços já realizados, o mecanismo de ativação de ureases ainda permanece obscuro. Até hoje, os estudos concentraram-se em ureases de origem microbiana, sendo a informação disponível ainda extremamente limitada. Menos ainda é conhecido para o sistema de ativação de ureases de origem vegetal. Na segunda parte deste trabalho relatamos pioneiramente as primeiras tentativas de produção e caracterização de proteínas acessórias de origem vegetal. As proteínas UreD, UreF e UreG de soja (Glycine max) foram clonadas e expressas em sistema bacteriano. A proteína UreG de soja, purificada diretamente da planta e também produzida de forma recombinante em E.coli, foi caracterizada quanto a sua estrutura, capacidade de ligação a metais e atividade GTPásica, descrevendo algumas características nunca antes observadas para outras proteínas da mesma família. Também descrevemos o primeiro sucesso na obtenção da proteína acessória UreF tipo 5 selvagem na sua forma solúvel e a caracterização estrutural desta proteína foi realizada. As proteínas acessórias de soja também foram caracterizadas em relação ao seu perfil de expressão em diferentes tecidos, ao longo do desenvolvimento da planta, utilizando PCR em tempo real. Observamos uma grande variação dos níveis de expressão dos diferentes mRNAs nos tecidos avaliados. Uma possível relação entre estes níveis de expressão e a atividade ureásica de cada tecido foi investigada, visando uma melhor compreensão da dinâmica entre a expressão e atividade das proteínas responsáveis pela ativação das ureases vegetais. / The wide distribution of ureases in nature is an indication of the importance of this enzyme for the most different organisms, fact that lead researchers all over the world to dedicate their careers exclusively to the study of these enzymes. Despite of being studied for almost a century, until last year only three crystallographic structures of ureases had been solved, all from bacterial source. The urease from Canavalia ensiformis (JBU) was the first member of this family to be described, in 1926 and still, despite the restless efforts from different research groups on the structural and biological characterization of this protein, its structure was not solved until the beginning of 2010. Early trials to obtain the crystallographic structure of JBU have failed due to the poor quality crystals formed by this protein using conventional crystallization techniques. In this panorama, the first part of this work describes the use of alternative crystallization techniques, such as the use of ligands, in situ proteolisis and chemical modification of amino acid residues, for the obtention of JBU crystals with superior quality than the ones previously described in the literature, validating the use of such techniques on the crystallization of recalcitrant proteins. The crystals obtained here, despite of their superior characteristics, were not refined to the point of generating the crystallographic structure of JBU. The enzymatic activity of ureases is dependent of the presence of nickel ions precisely incorporated in their active sites. The bioassembly of these active sites, including the nickel incorporation, consist of a tightly regulated process, whose occurence depends on the participation of several chaperones (accessory proteins) that work as post-translational regulators. A great deal of effort has already been done on the study of the urease’s activation process; however its details remain unclear. To date, all work done concentrates on the study of microbial ureases, but the available information is very limited and even less information is available for the plant ureases activation process. The second part this work presents the first trials on the production and characterization of plant urease accessory proteins. The proteins UreD, UreF and UreG from soybean (Glycine max) were cloned and expressed in bacterial system. The soybean UreG protein, purified directly from the plant seeds and also produced in recombinant fashion in Escherichia coli, was characterized regarding its structure, metal biding capacity and GTPasic activity, describing a few characteristics never before observed for other proteins of the same family. It is also described the first success on the obtention of the wild type ureF accessory protein in its soluble form and a structural characterization was performed. All accessory proteins from soybean were also characterized for its expression profile in several tissues during its development utilizing real-time PCR and a correlation with the levels of urease activity were investigated. Altogether, these data improve the understanding of multiple factors involved on the urease activation process.

Ureases são enzimas que realizam hidrólise da uréia em amônia e dióxido de carbono e são isoladas de plantas, fungos e bactérias. A urease de C. ensiformis (JBU) tem algumas atividades biológicas independentes da sua atividade enzimática, como por exemplo: agregação plaquetária e efeito inseticida. O efeito inseticida é devido à liberação de um peptídeo interno por enzimas digestivas específicas dos insetos. Este peptídeo foi isolado, caracterizado e um análogo recombinante foi obtido e denominado Jaburetox-2Ec. Somente insetos com enzimas digestivas acídicas, como catepsinas, são capazes de liberar o peptídeo tóxico a partir da hidrólise de JBU. Insetos com enzimas básicas do tipo tripsina não são suscetíveis pois não há formação do peptídeo tóxico. Ninfas de D. peruvianus são sensíveis aos efeitos da JBU enquanto adultos não são. Este trabalho teve como objetivo estudar as diferenças enzimáticas entre os dois estágios do inseto para elucidar o processamento diferencial da JBU. Realizando a hidrólise in vitro da JBU com o homogeneizado de intestino de ninfas e adultos foi visto que tanto adultos como ninfas hidrolisam a JBU, mas somente ninfas liberam o peptídeo tóxico identificado pelo anticorpo específico anti-Jaburetox-2Ec. Ainda, através de ensaios enzimáticos utilizando substratos fluorogênicos e inibidores específicos, foi observada uma diferença no pH ótimo de atividade e na susceptibilidade a inibidores das enzimas digestivas presentes nos dois estágios. Substratos fluorogênicos correspondentes às regiões flanqueadoras do peptídeo dentro da JBU intacta foram desenhados e testados com os dois homogeneizados, o que também revelou que os homogeneizados dos dois estágios têm ação diferencial sobre estes substratos, sendo que ninfas liberariam mais eficientemente a extremidade Nterminal do peptídeo quando comparado aos adultos. Verificamos ainda que, em estudos eletrofisiológicos utilizando a técnica de “Planar Lipid Bilayer”, tanto a JBU como o Jaburetox-2Ec são capazes de se inserir em membrana lipídica planar, formando canais iônicos. Os canais formados pela JBU apresentaram quatro níveis de condutância majoritárias e seletividade para íons cloreto. / Ureases are enzymes that hydrolyze urea in ammonium and carbon dioxide and they have been isolated from plants, fungi and bacteria. Jackbean urease, from Canavalia ensiformis (JBU) displays biological activities unrelated from its enzymatic activity, as platelet aggregation and insecticide effect. This insecticide effect is due to the release of an internal peptide by insect specific digestive enzymes. This peptide was isolated, characterized and the recombinant peptide obtained was called Jaburetox- 2Ec. Only insects that rely on cathepsin-like digestive enzymes are able to hydrolyze JBU and release the toxic peptide. Insects with alkaline enzymes like tripsins are not susceptible because they don’t release the toxic peptide. Nymphs of D. peruvianus are susceptible to JBU effects while adults are not. The goal of this work was to study the enzymatic differences between both insect stages to elucidate JBU’s differential processing. In vitro hydrolysis were performed with nymphs and adults midgut homogenates and we observed that both adults and nymphs hydrolyze JBU but only nymphs are able to release the toxic peptide identified by Jaburetox-2Ec antibodies. Furthermore, in enzymatic assays using different fluorogenic substrates and specific inhibitors a difference in optimum pH and susceptibility to inhibitors of the digestive enzymes in both stages was observed. Fluorogenic substrates corresponding to the flanking regions of the peptide inside the intact JBU were produced and tested with both homogenates. Homogenates from both stages have differential action upon these substrates, considering that nymphs hydrolyses more efficiently the N-terminal of the peptide compared to adults. In electrophysiological studies using the Planar Lipid Bilayer technique we verify that JBU and Jaburetox-2Ec are able to insert in planar lipid membrane forming ionic channels. JBU’s channels display four major conductance levels and selectivity for chloride íons.