As sementes de Canavalia ensiformis são fonte de várias proteínas de interesse bioquímico e biotecnológico, como urease (JBU) e a canatoxina (CNTX). Ureases são enzimas dependentes de níquel que catalisam a hidrólise de uréia em amônia e carbamato encontradas em plantas, fungos e bactérias. A canatoxina, uma proteína tóxica isolada a partir da mesma semente em 1981 por Carlini & Guimarães é uma isoforma de urease. A CNTX e a urease possuem atividade inseticida, sendo que o efeito entomotóxico se deve à produção de fragmentos das proteínas, gerados pela ação das enzimas digestivas dos insetos. Apenas grupos de insetos com digestão baseada em enzimas acídicas são suscetíveis à toxina. O mecanismo de ação da CNTX e peptídeos gerados a partir da sua hidrólise não está claramente elucidado. Considerando o potencial das isoformas de ureases de C. ensiformis e peptídeos derivados para desenvolvimento de inseticidas, é importante investigar os mecanismos de ação e os órgãos ou tecidos–alvos de sua toxicidade nos insetos. Esse trabalho teve como objetivo testar diferentes protocolos visando a imunolocalização da toxina e/ou seus fragmentos em diferentes tecidos do inseto modelo Dysdercus peruvianus, um percevejo praga da cultura do algodão. Mesmo testando diferentes condições experimentais, observamos reação cruzada dos anticorpos anti-urease com os tecidos do inseto D. peruvianus, inviabilizando os estudos de imunolocalização. Considerando que a semente de algodão apresenta uma urease endógena ainda pouco caracterizada, e o alto grau de homologia existente entre ureases de diferentes fontes vegetais, a reação cruzada observada nos tecidos dos insetos pode ser devido à presença da urease do algodão e de seus fragmentos, provenientes do alimento consumido. Outras tentativas de identificação de alvos moleculares do inseto que interagem in vitro com a urease foram feitas, como ensaios de ligand blot e cromatografia de afinidade, mas estes não apresentaram resultados conclusivos. A produção de anticorpos monoclonais contra as diferentes isoformas de ureases de C. ensiformis está entre as alternativas possíveis para atingir nosso objetivo. Numa primeira tentativa, camundongos foram imunizados com uma mistura de isoformas da urease de C. ensiformis, que apresentam cerca de 85% de identidade, resultando na produção de anticorpos com especificidades diferenciadas para JBU e para a CNTX. Obtivemos 22 clones positivos: dois apresentaram maior especificidade pela CNTX (cerca de 4 vezes); dois clones foram mais específicos para urease (cerca de 2 vezes) e um foi capaz de reconhecer um peptídeo inseticida recombinante derivado da urease, com maior especificidade (resposta 1,5 maior do que CNTX ou JBU). Os resultados demonstraram que é possível produzir anticorpos monoclonais que diferenciam as diferentes ureases de C. ensiformis, para uso futuro em imunohistoquímica.

Ureases são enzimas níquel-dependentes que catalisam a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono. Além disso, apresentam diversas propriedades independentes da catálise, sendo consideradas proteínas moonlighting. São amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas em bactérias, arqueas, plantas e fungos, podendo se organizar em unidades funcionais compostas por uma, duas ou três subunidades. Sua ativação, que envolve a passagem da enzima de sua forma apo-urease a sua forma holourease, requer pelo menos três proteínas acessórias. Parte de suas propriedades não-catalíticas é associada à liberação de peptídeos internos da proteína nativa. Nesse contexto, a presente tese se dedicou ao estudo de diferentes aspectos da biologia estrutural de ureases. Ao elaborar uma narrativa filogenética, envolvendo varredura de bancos de dados em larga escala e diferentes algoritmos de reconstrução de árvores, foi possível propor uma rota evolutiva indicando a transição de três subunidades para uma única unidade funcional, sem passar por intermediários de duas cadeias. Quanto ao seu processo de ativação, por meio de múltiplos cálculos de atracamento baseados em dados experimentais prévios (especialmente SAXS), foram propostas estruturas para suas diferentes etapas, em resolução atomística. Finalmente, o comportamento dinâmico de diferentes peptídeos derivados de urease foram analisados computacionalmente por meio de simulações de longa duração (500 ns) e associados a outros dados obtidos in vitro, permitindo justificar efeitos diferenciais obtidos na aplicação destes peptídeos. De maneira geral, o trabalho empregou técnicas computacionais à análise de ureases, fornecendo bases para futuros estudos de suas propriedades, sejam catalíticas ou não, incluindo sua aplicação biotecnológica. / Ureases are nickel-dependent enzymes that catalyze the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide. They have many catalysis-independent properties, being considered moonlighting proteins. Ureases are found in bacteria, archaea, plants, and fungi, and may be organized in functional units composed by one, two, or three subunits. Their activation, involving the transition from apo to holourease, requires at least three accessory proteins. Some of their non-catalytic properties are related to the release of internal peptides from the native protein. In this context, this thesis was developed upon the study of different aspects of urease structural biology. By phylogenetical reconstruction, employing large-scale databank scans and different tree-building algorithms, we were able to propose an evolutionary route by which the transition from three to one functional subunits was possible, with no need for a two-chained intermediate. Regarding the activation mechanism, we have proposed structural models for the oligomeric intermediates of the process by multiple docking calculations, at atomistic resolution, based on previous experimental data (especially SAXS). Additionally, the dynamical behavior of different ureasederived peptides was analyzed by computational simulations at large time scales (500 ns) and correlated to in vitro results, allowing us to explain the variable effects observed after their application on test systems. In short, in this work we have employed computational techniques to the analysis of urease, providing working grounds for further studies of this enzyme and its properties (catalytical or not), including its biotechnological applicability.

Ureases, enzimas que catalisam a hidrólise da ureia formando amônia e dióxido de carbono, são sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. A espécie leguminosa Canavalia ensiformis, conhecida em inglês como Jack Bean, produz diferentes isoformas de ureases, sendo a chamada Jack Bean Urease (JBU) a isoforma majoritária. Ureases possuem atividade inseticida já comprovada para diferentes espécies de insetos e um dos seus efeitos no animal é o bloqueio neuromuscular. O objetivo deste trabalho foi compreender o mecanismo de ação responsável pela atividade neurotóxica da JBU e pelo bloqueio neuromuscular em insetos. A injeção de JBU em baratas (Nauphoeta cinerea), apesar de não letal, induziu uma inibição da enzima acetilcolinesterase no SNC. A urease, assim como a acetilcolina ou o anticolinérgico neostigmina, também induziu um aumento no ritmo cardíaco das baratas. Insetos tratados com JBU tiveram um aumento no tempo de grooming, efeito comportamental este mimetizado com o tratamento por octopamina. Os resultados acima citados indicam um efeito da JBU no SNC do animal, interferindo com a neurotransmissão colinérgica e octopaminérgica e, possivelmente, também GABAérgica. A atividade de JBU sobre o sistema neuromuscular de insetos também foi estudada através de registros eletrofisiológicos do potencial de ação neural, muscular e de placa motora. Em preparação de músculo tarsal de gafanhoto (Locusta migratoria), a urease reduziu a amplitude do potencial de ação evocado; entretanto quando aplicada diretamente no músculo oviductal isolado, a JBU não alterou a resposta contrátil. Em preparações de placa motora de larvas da mosca-da-fruta Drosophila melanogaster, a urease aumentou a amplitude dos potenciais excitatórios pós-sinápticos (EJPs) e a frequência dos eventos miniaturas (mEJPs). O efeito da JBU sobre a junção neuromuscular de insetos foi reduzido conforme a concentração de cálcio no meio extracelular também foi reduzida e completamente revertido quando o cálcio foi removido do meio (presença de EGTA e cloreto de Co2+), indicando que a mobilidade de íons de cálcio possui um papel importante na toxicidade induzida por JBU no inseto. Experimentos de imagem de cálcio em gânglios de N. cinerea confirmaram um maior influxo de cálcio no neurônio na presença de JBU, indicando que mobilidade do cálcio através da membrana foi alterada. Os resultados obtidos confirmam que a urease induz neurotoxicidade em insetos tanto a nível central como periférico, atuando sobre os gânglios do cordão nervoso, sobre neurônios aferentes e sobre o terminal pré-sináptico de neurônios motores. A neurotoxicidade induzida por JBU aparenta ser dependente do influxo de íons de cálcio no neurônio. / Ureases, enzymes that catalyse the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide, are synthesized by plants, fungi and bacteria. The legume Canavalia ensiformis, known as jack bean, produces different isoforms of ureases, being the jack bean urease (JBU) its major isoform. Ureases have insecticidal activity against different insect species and one of effects induced by JBU is a neuromuscular blockage. The aim of this work is to further understand the mechanism of action behind this blockage. The injection of JBU into cockroaches (Nauphoeta cinerea), despite not lethal, caused inhibition of brain acetylcholinesterase enzyme. Urease, as well as acetylcholine or the anticholinesterase drug neostigmine, induced a positive cardiac chronotropism in cockroaches. Similar to octopamine, JBU induced an increase in the time spent on grooming behaviour. These results indicate that JBU may act on the central nervous system of the animal by interfering with neurotransmission, more specifically on the cholinergic, octopaminergic and, possibly, GABAergic pathways. The activity of JBU on the neuromuscular junction of insects was studied through electrophysiological recordings. On the tarsus muscle of locust (Locusta migratoria), JBU reduced the amplitude of evoked muscle potentials, but did not alter the contractile response when applied to the oviduct muscle isolated. When applied on the end-plate of flies (Drosophila melanogaster) JBU led to an increase in the amplitude of Excitatory Junctional Potentials (EJPs), as well as to higher frequency of miniature Excitatory Junctional Potentials (mEJPs). JBU’s effect on the neuromuscular junction was reduced when the extracellular calcium concentrations decreased, and it was completely reversed when in calcium free preparations (in the presence of EGTA and Cobalt chloride), indicating that calcium mobility may play an important role in JBU-induced toxicity. Calcium imaging of cockroach ganglions revealed increased calcium influx upon exposition to JBU. These results indicate that JBU induces a central and peripheral neurotoxicity in insects, by interfering on neurotransmitters release or signalling in the ventral nerve cord, in the afferent neurons and in the motor neurons. Moreover, JBU-induced neurotoxicity depends on the influx of calcium ions into the neurons.

A cultura algodoeira tem significativa participação na economia mundial. O algodão (Gossypium hirsutum) é predado por uma grande variedade de insetos, entre eles o percevejo manchador Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae). O hábito alimentar deste inseto provoca danos nas sementes e fibras depreciando-as para a utilização comercial. Como alternativa para o aumento da resistência das plantas ao ataque de insetos predadores, estratégias biotecnológicas vêm sendo consideradas. A Canavalia ensiformis é fonte de proteínas com atividade inseticida como a urease, a canatoxina e a concanavalina-A. Tanto a canatoxina como a urease exercem efeitos tóxicos em ninfas deste percevejo, causando mortalidade e atraso no desenvolvimento dos insetos sobreviventes. De maneira análoga a outros modelos de insetos já estudados, a toxicidade em D. peruvianus dependeria da ativação proteolítica das proteínas por enzimas digestivas (catepsinas) do inseto e formação de um peptídeo tóxico. Neste trabalho, estudos de hidrólise in vitro na presença de inibidores seguidos por SDS-page e Western-blot confirmaram a ativação proteolítica da urease por enzimas do tipo catepsina-B. O homogeneizado de intestinos de ninfas hidrolisa também substratos típicos para catepsinas, como hemoglobina e Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, e a atividade proteolítica é bloqueada por pepstatina-A e E-64, inibidores específicos para aspártico e cisteíno proteinases, respectivamente. Duas cisteíno proteinases (DpQ-NR e DpQ-E) de intestinos de ninfas de D. peruvianus foram parcialmente purificadas e caracterizadas. Ambas apresentaram pH ótimo de atividade proteolítica entre 4,5 e 6,5, na presença de DTT e foram totalmente inibidas por E-64. No entanto o perfil de inibição evidencia a presença de outras enzimas nas frações. Ensaios de especificidade da fração DpQ-NR revelaram a preferência da enzima por substratos contendo resíduo hidrofóbico em P2, enquanto a enzima DpQ-E tem preferência por substratos contendo aminoácidos básicos em P1. Assim, o trabalho desenvolvido sugere a presença de proteinases múltiplas no sistema digestivo de D. peruvianus e o possível envolvimento destas peptidases na ativação proteolítica da urease. / Cotton (Gossypium hirsutum), an important agricultural commodity, is attacked by a number of pests, such as the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus (Hemiptera: Pyrrhocoridae) which may cause severe losses in cotton plantations. Bug feeding on the cotton seeds and stains the cotton fibers resulting in damage to the seed, besides being a vector for phytopathogenic bacteria and fungi. Biotechnology strategies focusing on plant defensive molecules are being considered as an alternative to increase host plant resistance against this pest. The jack bean Canavalia ensiformis is the source of proteins displaying insecticidal activity such as urease, canatoxin and concanavalin-A. Canatoxin and urease were shown to cause lethality and severe detrimental effects in surviving insects, delaying the development stages of D. peruvianus. As in other insect models studied previously, this would depend on the proteolytic activation of the protein by insect cathepsin-like digestive enzymes to produced toxic peptides. The in vitro hydrolysis of urease in the presence of inhibitors, followed by SDS-page and Wester-blot confirm the proteolytic activation by insect cathepsin B-like enzymes. A nymphal gut extract hydrolysed typical cathepsin substrates, such as hemoglobin and Abz-AIAFFSRQ-EDDnp, and hydrolysis was blocked by pepstatin-A and E-64, specific inhibitors of aspartic and cysteine proteinases. Two cysteine peptidases (DpQ-NR and DpQ-E) of D. peruvianus nymphs were partially purified and characterized. Both enzymes showed maximum activities at pH 4.5-5.0 and 5.5-6.5 in the presence of dithiotreitol and were totally inhibited by E-64. However, the inhibition profile points out to the presence of other types of proteinases in both fractions. DpQ-NR preferentially hydrolysed substrate with hydrophobic amino acids in P2, while DpQ-E had preference for substrate with basic residues in P1. Therefore, our work suggests the presence of multiple proteinases with distinct biochemical properties in the digestive system of D. peruvianus and the potencial involvement of these peptidases on the proteolytic activation of urease.

A urease de Canavalia ensiformis é de relevância histórica tendo sido a primeira proteína a ser cristalizada, feito realizado por Sumner em 1926 comprovando assim a natureza protéica das enzimas. Essa proteína também foi a primeira enzima contendo níquel a ser identificada. As ureases são amplamente encontradas em vegetais, bactérias e fungos, apresentando um alto grau de homologia entre si. Esta similaridade de seqüência primária indica um processo conservativo durante a Evolução e um papel fisiológico importante destas enzimas. As ureases microbianas estão envolvidas em processos patogênicos como formação de cálculos urinários, incrustação de catéter, pielonefrites, úlceras pépticas e possivelmente, na formação de tumores de estômago. Em vegetais, pouco se sabe a respeito da função biológica das ureases, embora sua presença em tecidos vegetais seja freqüente. Postula-se seu envolvimento na biodisponibilidade de nitrogênio; ou mesmo como mecanismo de defesa dos vegetais. A canatoxina, uma isoforma de urease isolada da C. ensiformis, é tóxica para insetos e possui outras atividades biológicas de interesse, dentre as quais destacam-se: 1) atividade secretagoga e pró-agregante em plaquetas de coelho; 2) atividade hemaglutinante indireta para hemácias de coelho; 3) propriedade próinflamatória, evidenciada nos modelos de edema de pata e pleuresia em ratos. Este estudo propõe-se a investigar se ureases bacterianas apresentariam propriedades biológicas como as da canatoxina; e se essas propriedades são dependentes ou não da atividade enzimática dessas ureases.

A Canavalia ensiformis é uma leguminosa altamente resistente ao ataque de insetos, e contribuindo para essa resistência, a planta possui isoformas de urease, que são proteínas que apresentam atividade entomotóxica. Essa toxicidade é dependente de uma ativação proteolítica da molécula por enzimas digestivas do inseto, do tipo catepsinas, e subseqüente liberação de peptídeos internos, os quais possuem a ação inseticida. A partir dessa informação foi construído um peptídeo recombinante com base na seqüência da urease, chamado Jaburetox-2Ec, o qual é tóxico para insetos resistentes e suscetíveis a urease intacta. O hemíptero Oncopeltus fasciatus é um dos nossos modelos de estudo. O objetivo deste trabalho foi identificar as principais peptidases digestivas de ninfas de O. fasciatus, auxiliando na elucidação do mecanismo de ação inseticida dessas toxinas, além de estudar os efeitos da urease intacta e do peptídeo derivado sobre órgãos isolados. Quando alimentadas com diferentes concentrações da urease majoritária de C. ensiformis (JBU), ninfas de O. fasciatus apresentam uma taxa de mortalidade superior a 80% após duas semanas, assim como quando injetadas com Jaburetox-2Ec apresentam uma taxa de mortalidade de 100% após 48 horas. Ninfas de quarto instar foram dissecadas para retirada dos intestinos e obtenção de um extrato protéico bruto, o qual foi utilizado para a realização dos ensaios enzimáticos. O extrato bruto foi capaz de hidrolisar in vitro a JBU e liberar peptídeos com massa semelhante a peptídeos entomotóxicos já conhecidos, reconhecíveis pelo anticorpo anti-Jaburetox-2Ec. A atividade proteolítica majoritária sobre substratos protéicos, em pH 4.0, foi bloqueada por inibidores específicos de aspártico e cisteíno peptidases, não sendo afetada EDTA, inibidor de metalopeptidases. Ao utilizar-se um substrato específico para cisteíno peptidases, o pico majoritário observado foi em pH 5.0, sendo a atividade completamente inibida por E-64 (inibidor de cisteíno peptidases) em todos os valores de pH testados. Ao utilizarse um substrato desenhado para aspártico peptidases, a atividade majoritária foi novamente em pH 5.0, sendo parcialmente inibida por Pepstatina A (inibidor de aspártico peptidases) é parcial em todos os valores de pH testados. Substratos sintéticos correspondentes às regiões N e C-terminal que flanqueiam o peptídeo inseticida na molécula de urease também foram testados. O primeiro não foi hidrolisado pelo extrato bruto, enquanto que o segundo apresentou um pico de atividade majoritário em pH 4.0-5.0, com inibição total por E-64. O extrato bruto foi submetido a um processo de purificação de duas etapas, uma troca iônica e uma cromatografia de gel filtração. A purificação foi monitorada utilizando-se um substrato específico para cisteíno peptidases, e a fração da gel filtração com maior atividade apresentou massa molecular de 22 kDa. A fração ativa foi submetida a um gel de poliacrilamida, a banda foi excisada e digerida com tripsina, e os peptídeos resultantes foram então analisados por espectrometria de massas. Uma catepsina L foi identificada, com massa molecular semelhante ao previsto pela gel filtração. Os resultados sugerem que a susceptibilidade de ninfas de O. fasciatus a JBU é, como em outros modelos de insetos, relacionada à proteólise limitada da proteína ingerida e posterior liberação de peptídeos inseticidas por enzimas do tipo catepsinas. Diferentes tipos de catepsinas podem estar liberando os peptídeos inseticidas a partir da urease, sendo que um cisteíno peptidase, tipo Catepsina L, pode ter um papel importante na ativação da proteína em O. fasciatus. Adicionalmente fizemos localização in situ de Jaburetox-2Ec após injeção na hemolinfa e observamos imunoreatividade no sistema nervoso central de ninfas de O. fasciatus, indicando que o peptídeo pode estar agindo neste local. Além dos efeitos tóxicos causados pelos peptídeos derivados da urease, já foram relatados em outros modelos, efeitos causados pela molécula intacta. Testamos, então, o efeito da JBU sobre contrações de intestinos ex vivo de O. fasciatus. Observamos que a urease tem a capacidade de inibir, em algumas concentrações, o efeito excitatório da serotonina sobre as contrações musculares, atividade que não é compartilhada com Jaburetox- 2Ec. Concluímos com os dados gerados nesse estudo, e em estudos prévios, que a toxicidade das ureases não só é devida à ativação proteolítica e liberação de peptídeos, mas também à proteína intacta, que parece estar causando distúrbios em processos de sinalização celular. / Jackbean (Canavalia ensiformis) is a legume highly resistant to insects. Contributing to this resistance, the plant contains urease isoforms that are entomotoxic upon the release of internal peptides by insect’s digestive cathepsin-like enzymes. A recombinant peptide, called Jaburetox-2Ec, was built based on urease’s sequence and this peptide is poisonous to all insects tested. The hemipteran bug Oncopeltus fasciatus is one of our models of study. In this work we aimed to identify the main digestive peptidases of O. fasciatus, helping to elucidate the insecticidal mechanism of action of these toxins, and to test the effects of urease and derived peptides upon isolated organs. When fed with different Jackbean major urease (JBU) concentrations, O. fasciatus nymphs showed a mortality rate higher than 80% after two weeks. When injected with Jaburetox-2Ec the mortality rate was 100% after 48 hours. Homogenates of midguts dissected from fourth instars were used to perform proteolytic activity assays. The homogenates hydrolyzed JBU in vitro, yielding a fragment similar in size to known entomotoxic peptides. The major proteolytic activity at pH 4.0 upon protein substrates was blocked by specific aspartic and cysteine peptidases inhibitors, but was not affected by a metalopeptidase inhibitor (EDTA). The optimal activity upon a fluorogenic substrate specific for cysteine peptidases was at pH 5.0, being completely inhibited by E-64 at all pH values tested. The optimal activity upon a fluorogenic substrate designed for aspartic peptidases was again at pH 5.0, being partially blocked by Pepstatin A in the pH range 2 to 10. Fluorogenic substrates corresponding to the Nand C-terminal regions flanking the entomotoxic peptide within urease sequence were also tested. While the N-terminal peptide was not hydrolyzed by the midguts homogenate, the C-terminal peptide was cleaved maximally at pH 4.0-5.0, with complete inhibition by E-64. The midguts homogenate was submitted to ion exchange chromatography followed by gel filtration yielding a 22 kDa protein peak. After SDSPAGE this band was excised from the gel, digested with trypsin and the peptides were analyzed by mass spectrometry. A Cathepsin L was identified. The results suggest that susceptibility of O. fasciatus nymphs to JBU is, like in other insect models, due to limited proteolysis of ingested protein and subsequent release of entomotoxic peptides by Cathepsin-like digestive enzymes. Moreover, we performed in situ localization of Jaburetox-2Ec after injection in the hemolymph, and we observed immunoreactive processes in O. fasciatus nymphs’ central nervous system, indicating that the peptide could be acting there. Besides the poisonous effects caused by urease derived peptides, effects caused by the intact molecule were already described. Hence we tested urease’s effect upon O. fasciatus isolated midguts contractions. We observed that urease is capable of inhibiting, at some concentrations, serotonin excitatory effect on muscular contractions, activity that was not shared with Jaburetox-2Ec. We concluded from the data of this study and previous studies, that urease’s toxicity is not only due to proteolytic activation and release of toxic peptides, but also to the intact molecule, which seems to be causing disturbances in cell signalling.

Ureases, apesar de sua importância histórica para a Bioquímica, ainda são enigmáticas. Pouco se sabe a respeito de suas propriedades não-catalíticas, por exemplo. Nesse contexto, o presente trabalho submeteu uma urease de Canavalia ensiformis (JBURE-IIB) a simulações de dinâmica molecular, nos níveis de detalhamento atomístico e coarse-grained, buscando obter uma caracterização conformacional dessa urease, tanto como monômero quanto como trímero. Os dados assim obtidos sugerem que os domínios da proteína apresentam diferentes mobilidades, sendo o domínio γ o mais flexível. Esse domínio é também o principal responsável pela compactação do monômero da urease isolado, quando comparado à sua conformação cristalográfica. A mobilidade do domínio γ foi também associada ao processo de oligomerização da enzima. A forma trimérica da urease de C. ensiformis também se tornou mais compacta após a simulação, apontando as ureases como moléculas altamente flexíveis, principalmente devido às regiões de alças que conectam domínios estruturais, no caso de ureases vegetais. Sendo uma propriedade não necessariamente associada à catálise, a análise de tal flexibilidade pode auxiliar tentativas futuras de explicar a participação não-catalítica da urease em suas propriedades multifuncionais. / Ureases, despite their historical importance in biochemistry, are still enigmatic. For instance, little is known about their non-catalytic properties. In this context, the current work submitted a Canavalia ensiformis urease (JBURE-IIB) to molecular dynamics simulations at both atomistic and coarse-grained levels in order to obtain a conformational characterization of such urease in both monomeric and trimeric forms. The data suggest that the domains of the protein present different mobilities, with the γ domain being the most flexible one. This domain is also the main responsible for the compactness of the isolated urease monomer when compared to its crystallographic conformation. The γ domain mobility was also associated with the oligomerization process of the enzyme. The trimeric form of C. ensiformis urease also became more compact after simulation, pointing to ureases as highly flexible molecules, mainly due to coiled regions connecting the structural domains, in the case of plant ureases. As a property not necessarily related to catalysis, the analysis of this flexibility may enlighten further efforts to solve the non-catalytic aspects of urease in its moonlighting properties.

Resumo não disponível.

Ureases, enzimas que catalisam a hidrólise da ureia formando amônia e dióxido de carbono, são sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. A espécie leguminosa Canavalia ensiformis, conhecida em inglês como Jack Bean, produz diferentes isoformas de ureases, sendo a chamada Jack Bean Urease (JBU) a isoforma majoritária. Ureases possuem atividade inseticida já comprovada para diferentes espécies de insetos e um dos seus efeitos no animal é o bloqueio neuromuscular. O objetivo deste trabalho foi compreender o mecanismo de ação responsável pela atividade neurotóxica da JBU e pelo bloqueio neuromuscular em insetos. A injeção de JBU em baratas (Nauphoeta cinerea), apesar de não letal, induziu uma inibição da enzima acetilcolinesterase no SNC. A urease, assim como a acetilcolina ou o anticolinérgico neostigmina, também induziu um aumento no ritmo cardíaco das baratas. Insetos tratados com JBU tiveram um aumento no tempo de grooming, efeito comportamental este mimetizado com o tratamento por octopamina. Os resultados acima citados indicam um efeito da JBU no SNC do animal, interferindo com a neurotransmissão colinérgica e octopaminérgica e, possivelmente, também GABAérgica. A atividade de JBU sobre o sistema neuromuscular de insetos também foi estudada através de registros eletrofisiológicos do potencial de ação neural, muscular e de placa motora. Em preparação de músculo tarsal de gafanhoto (Locusta migratoria), a urease reduziu a amplitude do potencial de ação evocado; entretanto quando aplicada diretamente no músculo oviductal isolado, a JBU não alterou a resposta contrátil. Em preparações de placa motora de larvas da mosca-da-fruta Drosophila melanogaster, a urease aumentou a amplitude dos potenciais excitatórios pós-sinápticos (EJPs) e a frequência dos eventos miniaturas (mEJPs). O efeito da JBU sobre a junção neuromuscular de insetos foi reduzido conforme a concentração de cálcio no meio extracelular também foi reduzida e completamente revertido quando o cálcio foi removido do meio (presença de EGTA e cloreto de Co2+), indicando que a mobilidade de íons de cálcio possui um papel importante na toxicidade induzida por JBU no inseto. Experimentos de imagem de cálcio em gânglios de N. cinerea confirmaram um maior influxo de cálcio no neurônio na presença de JBU, indicando que mobilidade do cálcio através da membrana foi alterada. Os resultados obtidos confirmam que a urease induz neurotoxicidade em insetos tanto a nível central como periférico, atuando sobre os gânglios do cordão nervoso, sobre neurônios aferentes e sobre o terminal pré-sináptico de neurônios motores. A neurotoxicidade induzida por JBU aparenta ser dependente do influxo de íons de cálcio no neurônio. / Ureases, enzymes that catalyse the hydrolysis of urea into ammonia and carbon dioxide, are synthesized by plants, fungi and bacteria. The legume Canavalia ensiformis, known as jack bean, produces different isoforms of ureases, being the jack bean urease (JBU) its major isoform. Ureases have insecticidal activity against different insect species and one of effects induced by JBU is a neuromuscular blockage. The aim of this work is to further understand the mechanism of action behind this blockage. The injection of JBU into cockroaches (Nauphoeta cinerea), despite not lethal, caused inhibition of brain acetylcholinesterase enzyme. Urease, as well as acetylcholine or the anticholinesterase drug neostigmine, induced a positive cardiac chronotropism in cockroaches. Similar to octopamine, JBU induced an increase in the time spent on grooming behaviour. These results indicate that JBU may act on the central nervous system of the animal by interfering with neurotransmission, more specifically on the cholinergic, octopaminergic and, possibly, GABAergic pathways. The activity of JBU on the neuromuscular junction of insects was studied through electrophysiological recordings. On the tarsus muscle of locust (Locusta migratoria), JBU reduced the amplitude of evoked muscle potentials, but did not alter the contractile response when applied to the oviduct muscle isolated. When applied on the end-plate of flies (Drosophila melanogaster) JBU led to an increase in the amplitude of Excitatory Junctional Potentials (EJPs), as well as to higher frequency of miniature Excitatory Junctional Potentials (mEJPs). JBU’s effect on the neuromuscular junction was reduced when the extracellular calcium concentrations decreased, and it was completely reversed when in calcium free preparations (in the presence of EGTA and Cobalt chloride), indicating that calcium mobility may play an important role in JBU-induced toxicity. Calcium imaging of cockroach ganglions revealed increased calcium influx upon exposition to JBU. These results indicate that JBU induces a central and peripheral neurotoxicity in insects, by interfering on neurotransmitters release or signalling in the ventral nerve cord, in the afferent neurons and in the motor neurons. Moreover, JBU-induced neurotoxicity depends on the influx of calcium ions into the neurons.

Resumo não disponível.