Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

En France, Staphylococcus aureus est le micro-organisme pathogène le plus souvent incriminé dans des cas de toxi-infections alimentaires collectives par le lait et les produits laitiers. L'intoxication alimentaire résulte de l'ingestion d'entérotoxines staphylococciques (SE) produites dans les aliments par des souches de S. aureus productrices de SE. Dans le but d'identifier les principaux paramètres technologiques qui affectent la croissance de S. aureus, l'expression des gènes et la production d'entérotoxines pendant la fabrication de fromage à pâte pressée non cuite, l'impact de différents paramètres du procédé a été étudié à l'aide de plans d'expériences. Pour étudier l'expression des gènes des entérotoxines au cours de la fabrication de fromage, nous avons tout d'abord développé une méthode efficace pour récupérer l'ARN total à partir de fromage et nous avons appliqué une stratégie robuste pour étudier l'expression de gènes par RT-PCR quantitative. En se basant sur les résultats d'une enquête sur les pratiques des fabricants de fromages à pâte pressée non cuite, nous avons ensuite étudié l'impact de cinq paramètres technologiques du procédé de fabrication sur le comportement de cinq souches productrices des entérotoxines A, B, C ou D, indépendamment inoculées à 10³ ufc/ml dans le lait, au cours des 72 premières heures de la fabrication. Quels que soient les paramètres testés ou les souches étudiées, la population de S. aureus atteint au moins 10⁵ ufc/g de fromage quatre heures après le moulage. Au cours des 54 fabrications fromagères, SEA et SED sont les seules entérotoxines détectées, en quantité très faible (non quantifiable pour SEA) et variable en fonction des paramètres étudiés. La production d'entétérotoxine semble corrélée à une expression précoce du gène au cours de la fabrication (moins de 6 heures après l'emprésurage du lait). Le premier plan d'expériences mis en œuvre a révélé que, parmi les cinq paramètres étudiés, la température et la durée de maturation du lait avaient le plus fort impact sur la production de SE. Par la méthodologie des surfaces de réponses, nous avons ensuite établi des modèles mathématiques pour décrire la relation entre l'expression des gènes et la production d'entérotoxines et les deux paramètres de maturation du lait. La température de maturation du lait apparaît comme le paramètre clé qui doit être contrôlé pour limiter le risque d'intoxication alimentaire par S. aureus dans les fromages à pâte pressée non cuite.

Notre travail montre la prédominance du clone « Lyon » parmi les souches de Staphylococcus aureus responsables d’infections invasives (i.e. bactériémies). Il est caractérisé par la présence du gène codant la «staphylococcal enterotoxin » (SE) A. Afin de mieux comprendre le lien éventuel entre la prédominance de la SEA et la gravité des infections induites, nous avons orienté nos travaux sur le versant immuno‐inflammatoire des SE. L’étude des répertoires Vβ induits par l’ensemble des SE s’est révélée peu discriminante. A l’aide d’approches génomiques et protéiques réalisées sur des lymphocytes et monocytes humains, nous avons observé le puissant potentiel inflammatoire de la SEA en particulier par rapport à la SEG (SE appartenant à l’opéron egc retrouvé dans les infections de faible sévérité) et la prédominance de la réponse lymphocytaire T. Enfin, afin de mieux comprendre la spécificité des effets observés, nous avons conduit des expériences sur lymphocytes purifiés en ciblant les Ly T effecteurs (CD4+CD25‐) et Ly T régulateurs (CD4+CD25+FOXP3+). Nos travaux ont confirmé l’induction par la SEA d’une forte réponse inflammatoire, associant une synthèse de cytokines de type Th1 et Th17 dans les deux lignées lymphocytaires. De plus, nos résultats suggèrent que les SE provoquent une perte des fonctions suppressives des Ly T régulateurs ouvrant de nouvelles perspectives quant à l’implication des SAgs dans de nombreuses situations cliniques en particulier le choc septique, et les infections chroniques / Our work shows the prevalence of the “Lyon” clone among Staphylococcus aureus strains responsible for severe systemic infections (i.e. bacteremia). This clone is characterized by the presence of the staphylococcal enterotoxin (SE) A coding gene. To better understand the possible link between the prevalence of SEA and the severity of infections, we focused our work on the immuno inflammatory responses of SE. By using genomic and protein studies, in human lymphocytes and monocytes, we observed the potent inflammatory property of SEA (especially in comparison with SEG ‐ belonging to the egc cluster mainly found in less severe infections) mainly targeting T cell response over monocytes. Finally, to better understand the specificity of these effects, we performed experiments on purified lymphocytes and targeted effectors (CD4+CD25‐) and regulatory T lymphocytes (CD4+CD25+FOXP3+). Our works confirmed the induction by SEA of a strong inflammatory response, characterized by the release of Th1 and Th17 cytokines in both lymphocyte lineages. Furthermore, our results also showed the loss of the regulatory T cell suppressive functions after SE stimulation. Collectively, these results offer new perspectives for the implication of the SAgs in numerous clinical situations in particular toxic shock and the chronic infections.

Le gène de l’entérotoxine thermostable b (estB) d’Escherichia coli a été fusionné au gène de la protéine liant le maltose (malE) dans le vecteur pMAL-p via PCR. Par la suite, deux constructions plasmidiques ont été realisées à partir de ce nouveau vecteur, nommé pMAL-STb. Dans un premier temps, un marqueur hexahistidine (His6) a été ajouté entre malE et estB, et dans un deuxième temps, un marqueur décahistidine (His10) a été placé en amont de malE. La séquence signal de la protéine liant le maltose (MBP) dirige l’exportation de la protéine de fusion du cytoplasme vers le périplasme, où l’entérotoxine STb acquière sa conformation active. MBP est également reconnue pour améliorer le rendement et la solubilité de la protéine passagère tandis que le marqueur histidine, connu comme étant le meilleur marqueur d’affinité pour la purification protéique, facilite sa purification jusqu’à homogénéité. De plus, les gènes fusionnés sont sous le contrôle du promoteur tac (Ptac), un promoteur fort et inductible. Suite à l’induction par l’IPTG, la souche recombinante exprime une protéine d’environ 48 kDa, qui est facilement identifiable par électrophorèse à partir du surnageant obtenu via choc osmotique. Une séquence encodant un site de clivage spécifique au facteur Xa est présente dans le plasmide afin de séparer les marqueurs MBP et histidine de STb. Le clivage de la protéine de fusion avec le facteur Xa libère MBP (42 kDa) attachée au marqueur histidine et un polypeptide de 5.2 kDa, correspondant au poids moléculaire de STb mature. Avec cette méthode, nous visons à obtenir une méthode plus efficace pour la production et la purification de STb. / The heat-stable enterotoxin b gene (estB) of Escherichia coli was fused to the gene for maltose-binding protein (malE) into the pMAL-p vector using PCR. Afterward, two plasmid constructs were realized from this new vector, named pMAL-STb. Firstly, a hexahistidine tag (His6) was added between malE and estB and secondly, a decahistidine tag (His10) was placed upstream of malE. The signal sequence of maltose-binding protein (MBP) directs the export of the fusion protein from the cytoplasm to the periplasm, where the enterotoxin STb acquires its active conformation. MBP is also known to improve the yield and solubility of the passenger protein while the histidine tag, viewed as the best affinity tag for protein purification, facilitates its purification to homogeneity. Furthermore, the fused genes are controlled by the tac promoter (Ptac), a strong inducible promoter. Following IPTG induction, the recombinant strain expressed a protein of approximately 48 kDa, which is easily identified from osmotic shock fluid following electrophoresis. A sequence encoding a factor Xa cleavage site is present in the plasmid to separate MBP and histidine tags from STb. The cleavage of the fusion protein with factor Xa generates the maltose-binding protein (42 kDa) attached to the histidine tag and a polypeptide of 5.2 kDa, corresponding to the molecular mass of mature STb. With this method, we aim at obtaining a more efficient way to produce and purify STb.

Les E. coli entérotoxinogènes (ETEC) sont souvent la cause de diarrhée post-sevrage chez le porc. Deux types d’entérotoxines sont retrouvées chez les ETEC, soit les thermolabiles, comme la toxine LT, et les thermostables, comme EAST-1, STa et STb. Cette dernière est composée de 48 acides aminés et est impliquée dans la pathologie causée par les ETEC. Pour la première fois un variant de la toxine STb fut découvert dans une étude. Nous avons alors émis l’hypothèse qu’il y a présence de variants dans la population de souches ETEC du Québec. Dans les 100 souches STb+ analysées, 23 possédaient le gène de la toxine avec une variation dans la séquence génétique : l’asparagine était présente en position 12 remplaçant ainsi l’histidine. Une corrélation entre la présence du variant et la présence de facteurs de virulence retrouvés dans ces 100 souches ETEC étudiées a été effectuée. Ce variant semble fortement associé à la toxine STa puisque toutes les souches variantes ont hybridé avec le gène codant pour cette dernière. Étant donné sa présence répandue dans la population de souches ETEC du Québec, nous avons de plus émis l’hypothèse que ce variant a des caractéristiques biologiques altérées par rapport à la toxine sauvage. L’analyse par dichroïsme circulaire a montré que le variant et la toxine sauvage ont une structure secondaire ainsi qu’une stabilité similaires. Par la suite, l’attachement au récepteur de la toxine, le sulfatide, a été étudié par résonnance plasmonique de surface (biacore). Le variant a une affinité au sulfatide légèrement réduite comparativement à la toxine sauvage. Puisque l’internalisation de la toxine fut observée dans une étude précédente et qu’elle semble liée à la toxicité, nous avons comparé l’internalisation du variant et de la toxine sauvage à l’intérieur des cellules IPEC-J2. L’internalisation du variant dans les cellules est légèrement supérieure à l’internalisation de la toxine sauvage. Ces résultats suggèrent que le variant est biochimiquement et structurellement comparable à la toxine sauvage. / Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) are a major cause of post-weaning diarrhea. STb is one of two heat-stable toxins produced by ETEC and is mostly associated with pathogenic porcine isolates. For the first time, a variant of the toxin was observed in a study in 2003. Our hypothesis is that STb variants are present in ETEC strains from Quebec. To screen for alterations at the gene level, a collection of 100 STb+ ETEC strains isolated from diseased pigs was randomly selected and analyzed. A total of 23 strains had a change from His12 to Asn. An association between the presence of the variant and virulence factors present in those strains was done. These strains were also positive for STa. Since this variant seems to be widely distributed in Quebec, we hypothesize that the variant has different biological properties compared to the wild-type STb. First, the secondary structure of the variant and wild-type toxin and their thermal stability was determined by circular dichroism. Both show similar structures and thermal stability. In addition, the binding affinity with the toxin receptor, the sulfatide, was determined by surface plasmon resonance. The affinity of the wild-type for the sulfatide is slightly superior to the variant. Finally, the internalization inside IPEC-J2 cells of the variant was compared to the wild-type. The variant is able to internalize more cells than the wild-type. Altogether, these results suggest that both the variant and the wild-type toxin are biochemically and structurally similar.

L’entérotoxine stable à la chaleur STb est produite par les Escherichia coli entérotoxinogènes (ETEC). Son rôle dans la diarrhée post-sevrage porcine est établi. L’internalisation de STb a été observée dans des cellules épithéliales intestinales humaines et de rat. Cependant, le mécanisme d’internalisation n’est pas totalement compris, particulièrement dans le jéjunum porcin, la cible in vivo de STb. Par la cytométrie en flux, nous avons examiné l’internalisation de STb couplée à un marqueur fluorescent dans les cellules épithéliales intestinales porcines IPEC-J2 et les fibroblastes murins NIH3T3. Nos résultats révèlent que l’internalisation de STb est températureindépendante dans les IPEC-J2 tandis qu’elle est température-dépendante dans les NIH3T3, où la réorganisation de l’actine est aussi nécessaire. Toutefois, les niveaux de sulfatide, le récepteur de STb, sont semblables à la surface des deux lignées. Le sulfatide est internalisé à 37°C de façon similaire entre les deux types cellulaires. La rupture des lipid rafts, les microdomaines membranaires contenant le sulfatide, par la méthyl-βcyclodextrine ou la génistéine, n’affecte pas l’internalisation de STb dans les deux lignées. Notre étude indique que le mécanisme d’internalisation de STb est dépendant du type cellulaire. L’activité de la cellule hôte peut être requise ou non. Le récepteur de STb, le sulfatide, n’est pas directement impliqué dans ces mécanismes. L’internalisation activité cellulaire-dépendante suggère une endocytose, nécessitant la réorganisation de l’actine mais pas les lipid rafts. L’internalisation de STb est donc un processus complexe dépendant du type cellulaire, qu’il apparait plus relevant d’étudier dans des modèles cellulaires représentatifs des conditions in vivo. / Heat-stable enterotoxin b (STb) is one of the toxins produced by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) and its role in swine post-weaning diarrhea is well established. Internalization of STb in intestinal human and rat epithelial cells has been shown by previous studies. However, the uptake mechanism is still not fully understood, especially in porcine jejunum epithelium, the in vivo STb target. Using flow cytometry, we studied internalization of fluorescently-labelled STb in porcine epithelial intestinal IPEC-J2 and murine fibroblast NIH3T3 cell lines. Our results revealed that STb is internalized in both cell lines. Toxin uptake is not dependent on the temperature in IPEC-J2 cells, whereas it is in NIH3T3 fibroblasts. Actin reorganization is only required for STb internalization in NIH3T3 cells. However, membrane sulfatide, the toxin receptor, is similarly present in both cell lines and similarly internalized with time at 37°C. Disruption of lipid rafts, known to contain sulfatide, with inhibitors (methyl-βcyclodextrin or genistein), did not affect toxin uptake in both cell lines. Altogether, these data indicate that STb internalization mechanisms are cell-type dependent. Moreover, uptake can depend on host cell activity or not. Sulfatide, the toxin receptor, is not directly involved in these mechanisms. Uptake independent on cell activity occurs in porcine intestinal epithelium. The cell activity-dependent uptake suggests an endocytosis, which requires actin rearrangement and is not mediated by lipid rafts. STb internalization is therefore a complex process varying upon cell type, which should preferentially be studied in cellular models representative of in vivo conditions, such as porcine cell lines.

Les E. coli entérotoxinogènes (ETEC) sont souvent la cause de diarrhée post-sevrage chez le porc. Deux types d’entérotoxines sont retrouvées chez les ETEC, soit les thermolabiles, comme la toxine LT, et les thermostables, comme EAST-1, STa et STb. Cette dernière est composée de 48 acides aminés et est impliquée dans la pathologie causée par les ETEC. Pour la première fois un variant de la toxine STb fut découvert dans une étude. Nous avons alors émis l’hypothèse qu’il y a présence de variants dans la population de souches ETEC du Québec. Dans les 100 souches STb+ analysées, 23 possédaient le gène de la toxine avec une variation dans la séquence génétique : l’asparagine était présente en position 12 remplaçant ainsi l’histidine. Une corrélation entre la présence du variant et la présence de facteurs de virulence retrouvés dans ces 100 souches ETEC étudiées a été effectuée. Ce variant semble fortement associé à la toxine STa puisque toutes les souches variantes ont hybridé avec le gène codant pour cette dernière. Étant donné sa présence répandue dans la population de souches ETEC du Québec, nous avons de plus émis l’hypothèse que ce variant a des caractéristiques biologiques altérées par rapport à la toxine sauvage. L’analyse par dichroïsme circulaire a montré que le variant et la toxine sauvage ont une structure secondaire ainsi qu’une stabilité similaires. Par la suite, l’attachement au récepteur de la toxine, le sulfatide, a été étudié par résonnance plasmonique de surface (biacore). Le variant a une affinité au sulfatide légèrement réduite comparativement à la toxine sauvage. Puisque l’internalisation de la toxine fut observée dans une étude précédente et qu’elle semble liée à la toxicité, nous avons comparé l’internalisation du variant et de la toxine sauvage à l’intérieur des cellules IPEC-J2. L’internalisation du variant dans les cellules est légèrement supérieure à l’internalisation de la toxine sauvage. Ces résultats suggèrent que le variant est biochimiquement et structurellement comparable à la toxine sauvage. / Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) are a major cause of post-weaning diarrhea. STb is one of two heat-stable toxins produced by ETEC and is mostly associated with pathogenic porcine isolates. For the first time, a variant of the toxin was observed in a study in 2003. Our hypothesis is that STb variants are present in ETEC strains from Quebec. To screen for alterations at the gene level, a collection of 100 STb+ ETEC strains isolated from diseased pigs was randomly selected and analyzed. A total of 23 strains had a change from His12 to Asn. An association between the presence of the variant and virulence factors present in those strains was done. These strains were also positive for STa. Since this variant seems to be widely distributed in Quebec, we hypothesize that the variant has different biological properties compared to the wild-type STb. First, the secondary structure of the variant and wild-type toxin and their thermal stability was determined by circular dichroism. Both show similar structures and thermal stability. In addition, the binding affinity with the toxin receptor, the sulfatide, was determined by surface plasmon resonance. The affinity of the wild-type for the sulfatide is slightly superior to the variant. Finally, the internalization inside IPEC-J2 cells of the variant was compared to the wild-type. The variant is able to internalize more cells than the wild-type. Altogether, these results suggest that both the variant and the wild-type toxin are biochemically and structurally similar.