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Étude des voies d’internalisation de l’entérotoxine STb d’Escherichia coli dans des lignées cellulairesAlbert, Marie-Astrid 12 1900 (has links)
L’entérotoxine stable à la chaleur STb est produite par les Escherichia coli
entérotoxinogènes (ETEC). Son rôle dans la diarrhée post-sevrage porcine est établi.
L’internalisation de STb a été observée dans des cellules épithéliales intestinales
humaines et de rat. Cependant, le mécanisme d’internalisation n’est pas totalement
compris, particulièrement dans le jéjunum porcin, la cible in vivo de STb. Par la
cytométrie en flux, nous avons examiné l’internalisation de STb couplée à un marqueur
fluorescent dans les cellules épithéliales intestinales porcines IPEC-J2 et les fibroblastes
murins NIH3T3. Nos résultats révèlent que l’internalisation de STb est températureindépendante
dans les IPEC-J2 tandis qu’elle est température-dépendante dans les
NIH3T3, où la réorganisation de l’actine est aussi nécessaire. Toutefois, les niveaux de
sulfatide, le récepteur de STb, sont semblables à la surface des deux lignées. Le sulfatide
est internalisé à 37°C de façon similaire entre les deux types cellulaires. La rupture des
lipid rafts, les microdomaines membranaires contenant le sulfatide, par la méthyl-βcyclodextrine ou la génistéine, n’affecte pas l’internalisation de STb dans les deux
lignées. Notre étude indique que le mécanisme d’internalisation de STb est dépendant du
type cellulaire. L’activité de la cellule hôte peut être requise ou non. Le récepteur de STb,
le sulfatide, n’est pas directement impliqué dans ces mécanismes. L’internalisation
activité cellulaire-dépendante suggère une endocytose, nécessitant la réorganisation de
l’actine mais pas les lipid rafts. L’internalisation de STb est donc un processus complexe
dépendant du type cellulaire, qu’il apparait plus relevant d’étudier dans des modèles
cellulaires représentatifs des conditions in vivo. / Heat-stable enterotoxin b (STb) is one of the toxins produced by enterotoxigenic
Escherichia coli (ETEC) and its role in swine post-weaning diarrhea is well established.
Internalization of STb in intestinal human and rat epithelial cells has been shown by
previous studies. However, the uptake mechanism is still not fully understood, especially
in porcine jejunum epithelium, the in vivo STb target. Using flow cytometry, we studied
internalization of fluorescently-labelled STb in porcine epithelial intestinal IPEC-J2 and
murine fibroblast NIH3T3 cell lines. Our results revealed that STb is internalized in both
cell lines. Toxin uptake is not dependent on the temperature in IPEC-J2 cells, whereas it
is in NIH3T3 fibroblasts. Actin reorganization is only required for STb internalization in
NIH3T3 cells. However, membrane sulfatide, the toxin receptor, is similarly present in
both cell lines and similarly internalized with time at 37°C. Disruption of lipid rafts,
known to contain sulfatide, with inhibitors (methyl-βcyclodextrin or genistein), did not
affect toxin uptake in both cell lines. Altogether, these data indicate that STb
internalization mechanisms are cell-type dependent. Moreover, uptake can depend on host
cell activity or not. Sulfatide, the toxin receptor, is not directly involved in these
mechanisms. Uptake independent on cell activity occurs in porcine intestinal epithelium.
The cell activity-dependent uptake suggests an endocytosis, which requires actin
rearrangement and is not mediated by lipid rafts. STb internalization is therefore a
complex process varying upon cell type, which should preferentially be studied in cellular
models representative of in vivo conditions, such as porcine cell lines.
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Effets de différents adjuvants de la famille de la toxine du choléra sur les lymphocytes T CD4 dans un modèle murin d'immunisation intrarectale avec des pseudoparticules virales de rotavirus / Effects of adjuvants of the cholera toxin family on CD4 + T cell responses in a murine model of intrarectal immunization with rotavirus-like particlesThiam, Fatou 14 December 2011 (has links)
La vaccination muqueuse est un moyen efficace de lutter contre les pathogènes qui utilisent les muqueuses comme porte d’entrée. Cependant, la vaccination muqueuse avec des antigènes non réplicatifs nécessite l’utilisation d’adjuvants. Les molécules de la famille de la toxine du choléra, l’entérotoxine thermolabile d’E.coli (LT), la toxine du choléra (CT) ainsi que le mutant LT-R192G et les sous-unités B non toxiques de ces toxines (LTB et CTB) ont été montrées augmenter les réponses immunitaires contre des antigènes coadministrés par voie muqueuse. Cependant leur mécanisme d’action est complexe et reste encore mal connu et des différences entre molécules entières et sous-unités B ont été rapportées ainsi que, pour une même molécule, des différences selon le modèle utilisé. Dans ce travail, nous avons étudié les effets de ces cinq molécules sur les réponses anticorps ainsi que sur les lymphocytes T CD4 dans un modèle murin d’immunisation intrarectale avec des pseudoparticules virales de rotavirus (VLP-2/6). Chez les souris non immunisées, nous avons montré que ces molécules, à l’exception de la CTB, diminuent in vitro les lymphocytes T régulateurs naturels CD4+CD25+Foxp3+, probablement par un mécanisme d’apoptose. Chez les souris immunisées, toutes les molécules étudiées induisent une même réponse anticorps sérique et fécale spécifique des VLP-2/6, qu’il s’agisse des molécules entières connues pour leur fort pouvoir adjuvant ou des sous-unités B qui, elles, ont été rapportées avoir un plus faible effet adjuvant voire un effet tolérogène dans certaines études. Concernant la réponse T CD4, les réponses spécifiques de l’antigène et de l’adjuvant ont été analysées. Des différences importantes ont été mises en évidence entre ces molécules. Notamment, seules les molécules entières (LT, LT-R192G et CT) induisent la production d’IL-2 et l’activation de lymphocytes T CD4+CD25+Foxp3- mémoires spécifiques de l’antigène tout en permettant la mise en place d’une régulation médiée par des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+Foxp3+ (boucle d’autorégulation), qui pourraient jouer un rôle majeur lors d’une réponse secondaire, afin d’éviter les réactions inflammatoires délétères. Malgré ces différences, toutes les molécules étudiées induisent la production d’IL-17, suggérant le rôle majeur de cette cytokine dans l’effet adjuvant.L’influence de la voie d’administration sur ces effets est en cours d’étude grâce à la comparaison avec la voie intranasale / Mucosal immunization is an important goal of vaccine development to protect against pathogens that use mucosa as portals of entry. However, the use of non-replicating antigens requires the addition of adjuvants.Cholera-like enterotoxins, cholera toxin (CT) from Vibrio cholerae and the heat-labile enterotoxin (LT) from toxinogenic strains of E. coli, as well as the mutant LR-192G and their B subunits (CTB and LTB) have been shown to increase immune responses against unrelated co-administered antigens by mucosal routes. However, their mechanism of action is very complex and not completely understood and differences exist between holotoxins and B subunits and within molecules, differences exist between the models used.In this work, we have studied the effects of these five molecules on antibody responses and on CD4+ T cell responses in a murine model of intrarectal immunization using rotavirus-like particles (2/6-VLP). In non-immunized mice, we have shown that all molecules, except CTB, decreased CD4+CD25+Foxp3+ natural regulatory T cells, probably by induction of apoptosis.In immunized mice, all molecules induced similar VLP-2/6 specific systemic and fecal antibody responses, teither he holotoxins, which are well known for their strong adjuvanticity or their B subunits with a less strong adjuvanticity but with also a tolerogenic effect in some studies.Regarding the CD4+ T cell response, antigen- and adjuvant- specific responses have been analysed. Important differences have been highlighted between the molecules. Among others things, only whole toxins (LT, LT-R192G and CT) trigger IL-2 production and activation of antigen specific memory CD4+CD25+Foxp3- T cells and at the same time antigen specific CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells are activated which may control the effector response (Feedback loop regulation) and avoid deleterious inflammation. In spite of these differences, all studied molecules triggered IL-17 production, suggesting the major role of this cytokine in adjuvanticity. We are currently comparing the intrarectal and intranasl routes in order to evaluate the role played by the route of immunisation in different effects of these molecules
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Effets de différents adjuvants de la famille de la toxine du choléra sur les lymphocytes T CD4 dans un modèle murin d'immunisation intrarectale avec des pseudoparticules virales de rotavirusThiam, Fatou 14 December 2011 (has links) (PDF)
La vaccination muqueuse est un moyen efficace de lutter contre les pathogènes qui utilisent les muqueuses comme porte d'entrée. Cependant, la vaccination muqueuse avec des antigènes non réplicatifs nécessite l'utilisation d'adjuvants. Les molécules de la famille de la toxine du choléra, l'entérotoxine thermolabile d'E.coli (LT), la toxine du choléra (CT) ainsi que le mutant LT-R192G et les sous-unités B non toxiques de ces toxines (LTB et CTB) ont été montrées augmenter les réponses immunitaires contre des antigènes coadministrés par voie muqueuse. Cependant leur mécanisme d'action est complexe et reste encore mal connu et des différences entre molécules entières et sous-unités B ont été rapportées ainsi que, pour une même molécule, des différences selon le modèle utilisé. Dans ce travail, nous avons étudié les effets de ces cinq molécules sur les réponses anticorps ainsi que sur les lymphocytes T CD4 dans un modèle murin d'immunisation intrarectale avec des pseudoparticules virales de rotavirus (VLP-2/6). Chez les souris non immunisées, nous avons montré que ces molécules, à l'exception de la CTB, diminuent in vitro les lymphocytes T régulateurs naturels CD4+CD25+Foxp3+, probablement par un mécanisme d'apoptose. Chez les souris immunisées, toutes les molécules étudiées induisent une même réponse anticorps sérique et fécale spécifique des VLP-2/6, qu'il s'agisse des molécules entières connues pour leur fort pouvoir adjuvant ou des sous-unités B qui, elles, ont été rapportées avoir un plus faible effet adjuvant voire un effet tolérogène dans certaines études. Concernant la réponse T CD4, les réponses spécifiques de l'antigène et de l'adjuvant ont été analysées. Des différences importantes ont été mises en évidence entre ces molécules. Notamment, seules les molécules entières (LT, LT-R192G et CT) induisent la production d'IL-2 et l'activation de lymphocytes T CD4+CD25+Foxp3- mémoires spécifiques de l'antigène tout en permettant la mise en place d'une régulation médiée par des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+Foxp3+ (boucle d'autorégulation), qui pourraient jouer un rôle majeur lors d'une réponse secondaire, afin d'éviter les réactions inflammatoires délétères. Malgré ces différences, toutes les molécules étudiées induisent la production d'IL-17, suggérant le rôle majeur de cette cytokine dans l'effet adjuvant.L'influence de la voie d'administration sur ces effets est en cours d'étude grâce à la comparaison avec la voie intranasale
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