Submitted by LAÍS POSTAI SACCO null (31625110898) on 2017-06-21T15:01:55Z No. of bitstreams: 1 Tese_Lais_Postai_Sacco.pdf: 14011418 bytes, checksum: e592a0bb9ebe0abbea9792c3fcc13a2e (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-06-21T16:09:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sacco_lp_dr_jabo.pdf: 14011418 bytes, checksum: e592a0bb9ebe0abbea9792c3fcc13a2e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-21T16:09:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sacco_lp_dr_jabo.pdf: 14011418 bytes, checksum: e592a0bb9ebe0abbea9792c3fcc13a2e (MD5) Previous issue date: 2017-06-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Consórcios de bactérias se constituem em comunidades microbianas que podem possuir um conjunto de diferentes vias metabólicas que podem mediar a degradação das diferentes moléculas. Além disso, esses consórcios de micro- organismos podem fornecer enzimas com grande utilidade em processos biotecnológicos aplicados a indústria. Estas enzimas estão sendo amplamente aplicadas em diversos setores da indústria, devido às vantagens como especificidade das enzimas catalizadoras, o baixo custo e, a facilidade de sua produção em larga escala, não produzir efeitos tóxicos nem gerar resíduos tóxicos ao ambiente. Levando em consideração o potencial dos consórcios microbianos e as vantagens das enzimas microbianas em processos biotecnológicos, esse trabalho teve como objetivo a aplicação de bactérias isoladas dos consórcios, em diversos processos biotecnológicos e agroindústriais. Foram utilizados dois consórcios para o isolamento dos micro-organismos provenientes de solo com alta taxa de degradação de biomassa. Os consórcios foram cultivados em bagaço de cana-de-açúcar e carboximetilcelulose (CMC), assim como em outros resíduos da agroindustria como palha de milho, casca de amendoim, originando desta forma outras comunidades as quais foram utilizadas no isolamento de bactérias. Foram estudados dois isolados bacterianos produtores de exopolissacarídeos (EPS), a caracterização destes EPS e aplicação deles em biorremediação ou como agente antibiofilme. Além de serem isoladas bactérias produtoras de proteases, uma enzima muito utilizada na indústria. Foi realizado um screening destes isolados bacterianos com atividade proteolítica alcalina e se observou que 4 isolados possuem atividade para ser explorada em diferentes segmentos da industria e em processos de biorremediação. Observou-se ainda que os isolados bacterianos obtidos têm capacidade de solubilizar fosfato insolúvel, portanto foi realizada a aplicação de bactérias solubilizadoras de fosfato e produtoras de auxinas em sementes de feijão guandu, o que permitiu a seleção de dois isolados promissores para a utilização como inoculantes. / Bacteria consortia have different microbial communities, which may possess a set of different metabolic pathways that can mediate the degradation of different molecules. In addition, these consortia of microorganisms can provide enzymes with great utility in biotechnological processes applied to industry. These enzymes are being widely applied in various industry sectors, due to the advantages such as the specificity of the catalytic enzymes, the low cost, the ease of its large scale production, and because they do not produce toxic effects nor generate toxic waste to the environment. Taking into account the potential of microbial consortia and the advantages of microbial enzymes in biotechnological processes this study aimed to apply bacteria isolated from the consortia in various biotechnological and agribusiness processes. Two consortia were used to isolate microorganisms isolated from soil with high rate of biomass degradation. The consortia were cultivated in sugarcane bagasse and carboxymethyl cellulose (CMC), as well as other agribusiness residues such as maize straw and peanut shells, thus originating other communities that were used for the isolation of bacteria. The characterization of two bacterial isolates producing exopolysaccharides (EPS), the characterization of these EPS and the application in bioremediation or as an anti biofilm agent were carried out. In addition to being isolated producing-proteases bacteria, it is an enzyme widely used in industry. A screening of these bacterial isolates with alkaline proteolytic activity was carried out and as a result the 4 isolates have activity to be exploited in different segments of the industry and in bioremediation processes. These bacterial isolates have the ability to solubilize insoluble phosphate, therefore the application of phosphate-solubilizing bacteria and auxin producers in pigeon bean seeds were carried out, which allowed the selection of two promising isolates for use as inoculants.

Orientador: Cleslei Fernando Zanelli / Coorientador: Tatiana Maria de Souza Moreira / Banca: Alessandro de Mello Varani / Banca: Francis de Morais Franco Nunes / Resumo: A classe dos triterpenos pentacíclicos apresenta uma diversidade de estruturas que é devida ao número de rearranjos que a molécula do precursor oxidoesqualeno sofre durante a ciclização, sendo a friedelina o derivado com maior número de rearranjos. As oxidoesqualeno ciclases (OSCs) são enzimas que catalizam a biossíntese dos triterpenos, gerando essa variedade de estruturas. O objetivo deste estudo foi clonar OSCs a partir de folhas de Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek, uma espécie medicinal brasileira, para posterior análise funcional dos seus triterpenos pentacíclicos e localização filogenética em relação às OSC já caracterizadas de outras espécies. Para esta finalidade, adotou-se a estratégia de RT-PCR. O RNA total foi extraído a partir das folhas de M. ilicifolia e utilizado na síntese de cDNA. A amplificação de fragmentos "core" de genes de OSCs foi realizada com iniciadores parcialmente degenerados desenhados para amplificar regiões conservadas entre enzimas dessa família. Os fragmentos clonados foram sequenciados e iniciadores específicos foram desenhados para as amplificações das extremidades 5' e 3'. Posteriormente iniciadores específicos foram desenhados para clonagem dos cDNAs completos. Comparação com banco de dados revelou que uma das ORFs obtida possui alta identidade com cicloartenol sintases de outras espécies de plantas já caracterizadas e que outras três ORFs clonadas possuem alta identidade com triterpeno sintases como beta-amirina, lupeol e isomultiflorenol sintases. As ORFs clonadas serão utilizadas em estudos futuros para expressão por sistema heterólogo permitindo a identificação das oxidoesqualeno ciclases por meio de análise dos produtos gerados / Abstract: The class of pentacyclic triterpenes presents a diversity of structures due to the number of rearrangements that the molecule of oxidosqualene undergoes during cyclization, being friedelin the derivative with maximum number of rearrangements. The oxidosqualene cyclases (OSCs) are enzymes that catalyze the biosynthesis of triterpenes, generating a wide variety of molecules. This study aims to clone OSC from leaves of Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek, a medicinal species from Brazil, for further functional analysis of its pentacyclic triterpenes and phylogenetic localization in comparison of OSCs characterized from other species. For this purpose, we adopted the strategy of RT-PCR. Total RNA was extracted from leaves of M. ilicifolia and used in the synthesis of cDNA. The PCR amplification of core fragments of OSC genes was performed with partially degenerated primers designed to amplify highly conserved regions among this class of enzymes. The cloned fragments were sequenced and specific primers were designed for amplification of 5' and 3' ends. Then, specific primers were designed for amplification of full-length cDNAs. Phylogenetic analyzes revealed that TS6 showed high identity with cycloartenol synthase of several other plant species already characterized, and CS4 exhibit high identity to triterpene synthases as beta-amyrin, lupeol and isomultiflorenol synthases from other plant species. The ORFs cloned will be used in future studies for expression in heterologous system allowing identification of the oxidosqualene cyclases by analysis of the products generated. / Mestre

Orientador: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Adalberto Pessoa Junior / Resumo: A tanase (EC 3.1.1.20) é uma enzima capaz de hidrolisar ligações éster e depsídicas de taninos hidrolisáveis obtendo-se como produtos a glicose e o ácido elágico ou ácido gálico, sendo este último, um importante substrato para as indústrias farmacêutica e química. Entre os diferentes organismos capazes de produzir tanases, os microrganismos, de modo especial os fungos filamentosos, vêm se destacando uma vez que são mais versáteis na degradação de diferentes tipos de taninos. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi estudar a produção de tanases intra e extracelulares por Aspergillus phoenicis em Fermentação Submersa (FSbm) e em Fermentação em Substrato Sólido (FSS), melhorando as condições de cultivo para obtenção destas enzimas em altos níveis, purificando e caracterizando-as bioquimicamente. Os maiores níveis enzimáticos em FSS foram obtidos utilizando-se folhas de caju e chá verde como fonte de carbono umedecidas com solução de sais Khanna (1:1, m/v), a 30ºC por 6 dias e em FSbm tendo 2% de ácido tânico como fonte de carbono, por 3 dias a 30ºC para ambas as formas enzimáticas. Fontes de nitrogênio e fosfato aumentaram a produção de tanases quando adicionadas em baixas concentrações. As tanases extra e intracelular produzidas em FSbm foram purificadas 22 e 17 vezes com recuperação de 9% e 16%, respectivamente, após dois passos cromatográficos, DEAE-Celulose e Sepharose CL6B. A forma extracelular possui massa molar nativa de aproximadamente 218,8 kDa com 65,1% de carboidratos. Já a enzima intracelular apresentou massa molar nativa de 154,9 kDa e 43,2% de carboidratos. A temperatura ótima de atividade para ambas as enzimas purificadas foi de 60ºC e o pH ótimo de atividade ficou estabelecido na faixa de 5,0 a 6,0 para ambas as formas tanásicas. As tanases se mostraram... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: (EC 3.1.1.20) is an enzyme able to hydrolize ester and depside bonds of hydrolysable tannins obtaining as products glucose and ellagic acid or gallic acid. This last one is an important substrate for the pharmaceutical and chemical industries. Among different organisms able to produce tannases, the microorganisms, especially filamentous fungi, have been highlighted since they are more versatile in the degradation of different types of tannins. In this context, the aim of this work was to study the production of intracellular and extracellular tannase from Aspergillus phoenicis under Submerged Fermentation (SbmF) and Solid Substrate Fermentation (SSF), improving culture conditions to obtain these enzymes at high levels, purifying and characterizing them biochemically. The highest enzyme levels were obtained in SSF using cashew and green tea leaves wetted with Khanna salt solution (1:1, w/v) as carbon source at 30°C for 6 days and SbmF with 2% tannic acid as carbon source, for 3 days at 30°C, for both enzymatic forms. Nitrogen and phosphate sources increased the production of tannase when added at low concentrations. The extra and intracellular tannase produced in SbmF were purified 22 and 17 times with recovery of 9% and 16%, respectively, after two chromatographic steps, DEAE-Cellulose and Sepharose CL6B. The extracellular form has native molecular mass of 218.8 kDa with 65.1% of carbohydrate content. The intracellular enzyme showed native molecular mass of 154.9 kDa and 43.2% of carbohydrate content. The optimum temperature for both purified enzymes was 60°C, and the optimum pH activity was established at a range from 5.0 to 6.0 for both enzymatic forms. Tannase proved to be quite stable at both temperature and pH and the activities remained constant for all ions tested, except for... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Banca: Valéria Mart Gomes de Lima / Banca: Rondinelli Donizetti Herculano / Resumo: As amilases são enzimas que catalisam a hidrólise do amido, dentre as quais se destaca a α-amilase, a β-amilase e a glicoamilase. Apresentam grande importância biotecnológica devido sua aplicação em vários processos industriais, principalmente alimentício. Podem ser obtidas de plantas, animais e microorganismos, no entanto, enzimas microbianas encontram maior demanda industrial. Além da importância econômica destas enzimas, novas metodologias têm sido desenvolvidas com resíduos como substrato para muitos processos industriais. A utilização de resíduos agro-industriais não só contribui para minimizar o impacto ambiental como atribui um valor econômico a esses substratos. Além disso, a imobilização de enzimas tem sido uma estratégia utilizada para a condução de bioprocessos, uma vez que os biocatalisadores imobilizados podem ser reutilizados em processos contínuos reduzindo custos de produção. Neste trabalho foi comparada a produção de amilases de dois fungos importantes para a indústria de alimentos, Rhizopus oryzae e Rhizopus microsporus var. oligosporus em fermentação submersa avaliando posteriormente os melhores métodos de imobilização da enzima, visando a produção de xarope de glicose. Os resultados mostraram que a farinha de trigo tipo II foi melhor ao farelo de mandioca e à farinha de mandioca como fonte de carbono na fermentação. As condições definidas para a fermentação foram: temperatura de 30°C e 96 h de tempo de fermentação para ambos os micro-organismos. O melhor pH para a atividade enzimática de Rhizopus oryzae foi 5,0, e de Rhizopus microsporus var. oligosporus foi 4,0 e 5,0. Ambas as enzimas apresentaram 100% de estabilidade em pH 4,0 a 7,0. A melhor temperatura para a atividade enzimática da amilase de R. oryzae foi 50°C e de R. oligosporus foram 60°C e 65°C. Ambas as... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Amylases are enzymes that catalyze starch hydrolysis, among which stands out α-amylase, β-amylase and glucoamylase. These enzymes have great importance due to its biotechnological application in various industrial processes, especially in food industry, among others. Also, they can be obtained from plants, animals and microorganisms, however microbial enzymes are the highest industrial demand. Besides economic importance, new methodologies has been developed with agricultural waste as substrate for many industrial processes. Bio-waste application in agro-industry not only minimizes environmental impacts as it increases economic value attached to these substrates. Immobilized enzymes is one strategy being used to conduct bio-processes, since immobilized biocatalysts can be reused in continuous processes and lowering production costs. In this paper two important fungi amylases from Rhizopus oryzae e Rhizopus microsporus var. oligosporus were characterized for enzyme production by optimal conditions and immobilization techniques, in order to produce glucose syrup. Results showed that type II wheat flour was better than cassava bagasse and cassava flour as fermentation's carbon source. Fermentation conditions were: temperature 30°C during 96 hours for both microorganisms. Best enzymatic pH activity of Rhizopus oryzae was achieved at 5.0, and for Rhizopus microsporus var. oligosporus was 4.0 and 5.0. Both enzymes showed 100% stability from pH 4.0 to 7.0. The best temperature for amylase enzymatic activity of R. oryzae was 50°C and R. oligosporus were 60°C and 65°C. Both enzymes were 100% stable at temperature range of 20°C to 40°C, however the enzyme of R. oligosporus were more stable at temperatures above 50°C than R. oryzae. The products of starch enzymatic hydrolysis were analyzed by... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rubens Monti / Banca: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: José Roberto Ernandes / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Jonas Contiero / Resumo: A utilização de açúcar invertido apresenta uma série de vantagens em relação à acarose diluída e a hidrólise enzimática é superior em rendimento à hidrólise ácida, lém de fornecer um produto de melhor qualidade e não gerar resíduos tóxicos. este sentido, o objetivo deste trabalho foi imobilizar multipontualmente uma nvertase comercial e uma inulinase produzida por uma cepa de Kluyveromyces arxianus em suporte glioxil-agarose, amino-agarose, glutaraldeído-agarose e com uportes epóxidos Sepabeads, Sepabeads-amino e Eupergit C, e determinar as tividades, estabilidades e capacidade de reuso dos derivados. Os derivados foram btidos através de diferentes protocolos e suas propriedades cinéticas Km e Vmax oram determinadas. Os resultados obtidos com os derivados foram comparados com os obtidos com as enzimas solúveis. Quando a invertase foi imobilizada no suportes agarose usando 5mg de enzima/g de suporte, os derivados possibilitaram ao menos duas reutilizações com manutenção da atividade, o que não ocorreu quando alta concentração de enzima foi colocada para reagir com o suporte, tanto usando agarose CL6B como a CL4B. Esta mesma enzima forneceu derivados com alta atividade quando foi realizado "crosslinking" com glutaraldeído, usando agarose CL6B e CL4B, cujas atividades foram as mais elevadas entre todos os derivados (21,643 e 14,984 U/mg prot, respectivamente). Foram obtidos seis derivados de invertase com estabilidade à temperatura de 50°C po r 1440 min e com atividade relativa acima de 80% nas reutilizações; no entanto, não foram obtidos derivados estabilizados com a enzima inulinase. A partir da análise destes resultados foi possível determinar que os derivados amino+glutaraldeído CL6B e amino+glutaraldeído CL4B foram os melhores derivados ativos estabilizados, apresentando eficiência catalítica (Vmax/Km) 0,59 e 0,52,...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of inverted sugar presents a series of advantages in relation to diluted sucrose and the enzymatic hydrolysis have a superior yield over acid hydrolysis, beyond supplying a product of better quality and do not generate toxic residues. In this way, the objective of this work was to immobilize by multipoint linkages a commercial invertase and an inulinase produced by a Kluyveromyces marxianus strain on glyoxyl-agarose, amine-agarose, glutaraldehyde-agarose supports and Sepabeads, Sepabeads-amine and Eupergit C epoxy supports, and to determine the activities, stabilities and the capability of reutilization of the derivatives. The derivatives were obtained through different protocols and kinetic parameters Km and Vmax were determined. The results of the derivatives were compared with the ones obtained with soluble enzymes. When invertase was immobilized on agarose using 5mg of enzyme/g of support, it was possible to reutilize the derivatives at least two times with maintenance of the activity, what it was not possible when high enzyme concentration was placed to react with the support, using agarose CL6B or CL4B. This same enzyme supplied derivatives with high activity when glutaraldehyde was used to crosslink the enzyme and agarose CL6B and CL4B supports, with the higher activity of all (21,643 and 14,984 U/mg prot, respectively). Six invertase derivatives were obtained with stability to the temperature of 50°C and for the period of 1440 min, with relative activity above 80% in the reutilizations, but no one inulinase stabilized derivative was obtained. Analyzing these results, it was possible to conclude that the amine+glutaraldehyde CL6B and amine+glutaraldehyde CL4B were the best active stabilized derivatives, presenting catalytic efficiency (Vmax/Km) of 0,59 and 0,52, respectively, corresponding to 59% and 52% of the soluble enzyme efficiency. Keywords: Enzyme immobilization, ...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Maria de Lourdes Teixeira de Moraes Polizeli / Banca: Érika Barbosa Neves Graminha / Resumo: As amilases, envolvidas na degradação do amido, constituem um grupo de enzimas com diferentes pontos de atuação na molécula de amido, hidrolisando ligações glicosídicas a-1,4 e/ou a-1,6, como as a-amilases e glucoamilases. A característica de termoestabilidade para essas enzimas é bastante desejável visto que, além de serem mais estáveis sob várias condições, ainda permitem a condução de processos de hidrólise do amido em temperaturas elevadas. O presente trabalho visou o estudo da produção de a- amilase e glucoamilase termofílica por Thermomyces lanuginosus TO-03, por fermentação submersa (FSm) e em estado sólido (FES), avaliando-se os efeitos do tempo de cultivo e da fonte de carbono. Foram estudadas também, as propriedades bioquímicas das enzimas produzidas e o efeito das mesmas na hidrólise dos diferentes tipos de amido na produção de xarope. Os resultados mostraram que as produções máximas de atividade de amilase dextrinizante, sacarificante e da glucoamilase por FES foram 3973,6; 95,2 e 235,2 U/g, em 144, 120 e 168h, respectivamente. Em FSm foram obtidos 181,6; 5,0 e 27,1 U/mL para amilase dextrinizante e amilase sacarificante e para Glucoamilase em 168 h fermentação. A glucoamilase obtida por FSm apresentou as seguintes propriedades: temperatura e pH ótimos de 70ºC e 5,5 quando o amido solúvel foi o substrato e de 65ºC e 4,5 quando o substrato foi a maltose. A a-amilase apresentou temperatura ótima de 60°C e pH ótimo 5,5. Quando obtida por FES, a glucoamilase apresentou temperatura ótima de 65ºC, para hidrólise de ambos os substratos e pH ótimo 5,5 para hidrólise do amido solúvel e pH 4,5 para a hidrólise da maltose. A a-amilase de FES apresentou temperatura E pH ótimos de 60°C e pH 5,5. / Abstract: Amylases, involved in starch degradation, constitute a group of enzymes with different action sites on the starch molecule, hydrolysing glycosidic bonds á-1.4 and/or á-1.6, such as á-amylases and glucoamylases. Thermostability for these enzymes is a very desirable characteristic since it makes them more stable under many conditions and it allows hydrolytic processes of starch to take place at high temperatures. This work had the purpose of studying the production of thermophilic á-amylase and glucoamylase by Thermomyces lanuginosus TO-03, in submerged fermentation (SmF) and solid state fermentation (SSF), evaluating the effect of cultivation time and carbon source. Biochemical properties of the enzymes were also studied along with the effect they had on hydrolysis of different types of starch for syrup production. The results show that maximum production of dextrinogenic and saccharogenic amylase and glucoamylase activities by SSF were 3973.6, 95.2 and 235.2 U/g in 144, 120 and 168 h, respectively. In SmF the results were 181.6, 5.0 and 27.1 U/mL for dextrinogenic and saccharogenic amylase and glucoamylase activities in 168 h of fermentation. Glucoamylase from SmF exhibited the following properties: temperature and pH optimum at 70°C and 5,5 when soluble starch was used as substrate and 65°C and 4.5 when maltose was used as substrate. á-amylase from SmF exhibited optimum temperature at 60°C and pH optimum at 5.5. Glucoamylase from SSF exhibited optimum temperature at 65°C, for the hydrolysis of both substrates and pH optimum at 5.5 when hydrolysing soluble starch and 4.5 when hydrolysing maltose. á-amylase from SSF exhibited optimum temperature and pH at 60°C and 5.5. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-11-12T01:01:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000462290-Texto+Completo-0.pdf: 2133615 bytes, checksum: 5c5628b9cc5fd71ee1dcc7d68f182c36 (MD5) Previous issue date: 2014 / Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused mainly by Mycobacterium tuberculosis. The increasing number of infected patients among immune compromised populations and emergence of drug-resistant strains has created urgent need of new strategies to treat TB. Understanding relevant pathways (as the purine salvage) will reveal details of M. tuberculosis that might be used to develop new strategies to combat this pathogen. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) is an enzyme from the purine phosphoribosyltransferase (PRTase) family and catalyzes the conversion of hypoxanthine or guanine and 5-phosphoribosyl-α-1-pyrophosphate (PRPP) to inosine 5’-monophosphate (IMP) or guanosine 5’-monophosphate (GMP), and pyrophosphate (PPi). Here we describe the mode of action of M. tuberculosis HGPRT (MtHGPRT) through kinetic and thermodynamical analysis. Experiments were also performed to determine the oligomeric state in solution, pH, temperature and solvent isotope effects. These data allows us to compare MtHGPRT to homologues from other species and look for similarities and differences in its mechanism and constants. We hope the experiments presented here will contribute to the understanding of this pathogen purine salvage pathway. / A Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa causada principalmente por Mycobacterium tuberculosis. O aumento de pacientes infectados entre a população imunocomprometida e a emergência de cepas resistentes a drogas criam uma necessidade de novas estratégias para tartar a TB. Entender como funcionam as vias metabólicas relevantes, como a via de salvamento de purinas, poderá revelar detalhes do M. tuberculosis que poderão ser úteis para o desenvolvimento de novas estratégias de combate a este patógeno. A hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (HGPRT) é uma enzima da familia das purina fosforribosiltransferases (PRTase) e catalisa a conversão de hipoxantina ou guanina e 5-fosforribosilpirofosfato-α-1-pirofosfato (PRPP) em inosina 5’-monofosfato (IMP) ou guanosina 5’-monofosfato (GMP) respectivamente, com a liberação de pirofosfato inorgânico (PPi). Aqui nós descrevemos o modo de ação da HGPRT de M. tuberculosis (MtHGPRT) através de análises cinéticas e termodinâmicas. Também foram realizados experimentos para determinar o estado oligomérico da enzima em solução e os efeitos de pH, temperatura e efeitos isotópicos do solvente. Esses dados nos permitem comparar a MtHGPRT com homólogos de outras espécies e procurar por similaridades e diferenças nos seu mecanismo e constantes. Nós esperamos que os experimentos apresentados aqui contribuam para o entendimento da via de salvamento de purinas desse patógeno.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000410668-Texto+Completo-0.pdf: 610134 bytes, checksum: 96d58c78aa5915846ec6c97a8caffdcb (MD5) Previous issue date: 2009 / The Tuberculosis (TB) is considered a threat to global public health; according to the World Health Organization, nearly two million people die annually due to this disease. One of the most importat features of this pathogen is its ability to persist in host tissues for a long period in a state of latency, also known as persistence. The importance of the state of latency to the bacillus survival has been an attractive factor towards the development of works to characterize in greater detail this phase of infection by M. tuberculosis. An understanding of the mode of action and the role of pyrimidine salvage pathway enzymes in M. tuberculosis could reveal new targets for the rational design of potent and selective anti-TB agents capable of, hopefully, preventing progression and reactivation of the disease. Cytidine deaminase (CDA; EC 3. 5. 4. 5), an evolutionarily conserved enzyme of the pyrimidine salvage pathway, catalyzes the hydrolytic deamination of cytidine and 2’-deoxycytidine to form uridine and 2’-deoxyuridine, respectively. The probable CDA gene (cdd, Rv3315c) from M. tuberculosis H37Rv was cloned, sequenced, and expressed in Escherichia coli BL21(DE3) cells. The purification protocol of recombinant M. tuberculosis CDA (MtCDA) yielded 35 mg of homogeneous protein from 10 g of cells. Mass spectrometry, N-terminal amino acid sequencing, and gel filtration chromatography confirmed the predicted molecular mass, identity, and oligomeric state of MtCDA, which was estimated to be 52. 99 kDa. These results and the ones for multiple sequence alignment suggest that MtCDA is a homotetramer in solution. Steady-state kinetic measurements yielded the following parameters: KM and kcat values of, respectively, 1004 μM and 4. 8 s-1 for cytidine, and 1059 μM and 3. 5 s-1 for 2'-deoxycytidine. The pH dependence of kcat and kcat/KM for cytidine indicates that the protonation of a single ionizable group with pKa value of 4. 3 abolishes activity, and protonation of a group with pKa value of 4. 7 reduces substrate binding. Crystals of CDA were obtained using the hanging-drop vapour-diffusion method. The demonstration that the Rv3315c locus encodes a protein having CDA activity in M. tuberculosis is the first step to understand the role of this gene product and should help the design of anti-TB agents and vaccines. / A tuberculose (TB) é considerada uma ameaça à saúde pública mundial; segundo a Organização Mundial da Saúde, cerca de dois milhões de pessoas morrem anualmente em conseqüência desta doença. Uma das características mais importantes do patógeno causador da TB é a sua capacidade de persistir nos tecidos do hospedeiro por um longo período em um estado de latência, também conhecido como persistência. A importância do estado de latência à sobrevivência do bacilo tem sido um atrativo fator para o desenvolvimento de trabalhos que caracterizem com maior profundidade esta fase da infecção por M. tuberculosis. O entendimento do modo de ação e o papel das enzimas da rota de salvamento de pirimidinas em M. tuberculosis poderia revelar novos alvos para o desenho racional de agentes anti-TB potentes e seletivos capazes de, se possível, prevenir a progressão e a reativação da doença. A citidina deaminase (CDA, EC 3. 5. 4. 5), uma enzima evolutivamente conservada da rota de salvamento das pirimidinas, catalisa a deaminacao hidrolítica de citidina e 2’-desoxicitidina para formar uridina e 2’-desoxiuridina, respectivamente. O provável gene da CDA (cdd, Rv3315c) de M. tuberculosis foi clonado, seqüenciado e expresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). O protocolo de purificação da CDA recombinante de M. tuberculosis (MtCDA) produziu 35 mg de proteína homogênea a partir de 10 g de células. A análise de espectrometria de massas, seqüenciamento N-terminal e cromatografia por gel filtração confirmaram a massa molecular prevista, a identidade e o estado oligomérico de MtCDA, que foi estimada em 52,99 kDA. Estes resultados e os de alinhamento múltiplo de seqüências sugere que MtCDA é um homotetrâmero em solução. Medidas de cinética em estado estacionário da CDA geraram os seguintes parâmetros: valores de KM e kcat de, respectivamente, 1004 μM e 4,8 s-1 para citidina, e 1059 μM e 3,5 s-1 para 2'- desoxicitidina. A dependência dos valores de kcat e kcat/KM em função do pH para citidina indicam que a protonação de um único grupo ionizável com valor de pKa de 4,3 elimina a atividade, e a protonação de um grupo com pKa de 4,7 reduz a ligação ao substrato. Foram obtidos cristais de CDA utilizando o método de difusão de vapor em gota pendente. A demonstração de que o locus Rv3315c codifica uma proteína com atividade CDA em M. tuberculosis é o primeiro passo para entender o papel do produto deste gene e deverá ajudar no desenho de agentes anti-TB e vacinas.

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é amplamente empregado comercialmente como agente biocontrolador de artrópodes em pragas na agricultura e pecuária, abrangendo vasta gama de hospedeiros. Para que o processo infectivo tenha sucesso, é necessário que o fungo atravesse a cutícula, a primeira e principal defesa do artrópode. A transposição dessa primeira barreira ocorre pela secreção de proteases, lipases e quitinases para degradar seus principais componentes estruturais. Dentre as proteases expressas por M. anisopliae, a família Pr1 de serino-proteases está associada à virulência. Essa família possui 11 isoformas - Pr1A a Pr1K - em M. anisopliae, sendo subdivididas em duas classes. A Classe II compreende 10 isoformas subdivididas em três subfamílias. Essas isoformas agem de forma sinergística entre si e com outros fatores, conferindo maior virulência e permitindo a infecção de diferentes hospedeiros. É suposto que a virulência coevolui por seleção recíproca com o hospedeiro, havendo seleção positiva para a evolução de novas proteases ou isoformas que não sejam inativadas por inibidores do hospedeiro. O presente trabalho busca testar essa hipótese na Classe II da família Pr1, com especial foco em M. anisopliae, utilizando diferentes métodos de inferência filogenética em conjuntos de aminoácidos e nucleotídeos das isoformas individuais, bem como agrupadas por subfamílias, abrangendo homólogos do gênero Metarhizium e fungos relacionados. As árvores obtidas e seus respectivos alinhamentos nucleotídicos foram analisados quanto à substituições sinônimas e não sinônimas para inferência de seleção positiva. Tanto para os conjuntos de dados individuiais quanto para aqueles agrupados por subfamília, as filogenias retratam grupos com alto suporte estatístico condizentes com a taxonomia dos organismos que sintetizam essas proteínas, embora contendo pequenas discrepâncias. Foram identificados sítios sob seleção positiva em seis das nove isoformas avaliadas, em sua maioria localizados no domínio proteolítico. Esses resultados indicam que existe pressão seletiva diferenciada para gerar novas variações de Pr1, com efeito potencial na especificidade por hospedeiros, aumento de virulência, ou adaptação a outros estilos de vida hospedeiro-independente. / The entomopathogenic fungus Metarhizium anisoplie is widely applied as a pest-arthropod biocontrol agent in crops and animal production, encompassing a wide array of hosts. For a successful infection, it is vital that the fungus breaches the host’s cuticle, the first and main defense of artrhopods. Transposing this first barrier requires secreted proteases, lipases and chitinases that degrade the cuticle’s main structural components. Among the expressed proteases of M. anisopliae, the Pr1 family of serine proteases is related to its virulence. In M. anisopliae, this family contains 11 isoforms – Pr1A through Pr1K – divided into two classes. Class II comprises 10 isoforms further divided into three subfamilies. It is believed that these isoforms act synergistically and with other virulence fators, allowing the infection of different hosts. Presumably, virulence coevolves through reciprocal selection with the host, where positive selection occurs for the evolution of new proteases or isoforms that are not inactivated by the host’s inhibitors. The current work tests this hypothesis in Class II of the Pr1 family, with a special focus in M. anisopliae, employing different methods for phylogenetic inference in aminoacid and nucleotide datasets alike for each isoform individually as well as grouped by subfamily, encompassing homologs for the Metarhizium genus and related fungi. The inferred trees and their respective alignments were analyzed regarding synonymous and non-synonymous substitutions to detect positive selection. For each individual dataset, as well as for their subfamily groups, phylogenies depict groups that match the taxonomy of their respective organisms with high statistical support, albeit with minor discrepancies. Positively selected sites were identified in six out of nine Pr1 isoforms, most of them located within the proteolytic domain. These results imply that there exists a differential selective pressure for the evolution of novel Pr1 variations, potentially affecting host specificity, increasing virulence or adapting the fungus to different host-independent lifestyles.

Enzimas microbianas, quando produzidas a um custo acessível e preservadas suas propriedades catalíticas, são ferramentas determinantes para a sustentabilidade das indústrias química e energética. Buscando aprimorar a produção de lipases pela cepa de Staphylococcus warneri EX17, diferentes estratégias de cultivo em biorreatores submersos foram aplicadas para analisar a influência de algumas variáveis na produção da enzima e então foi proposto o cultivo em batelada alimentada. Paralelamente, lipases de S. warneri EX17 (SWL) foram imobilizadas por adsorção hidrofóbica em Octyl-Sepharose, Immobead 150 e MCI GEL CHP20P. Os resultados indicaram que a interação entre enzima e suporte interfere nas propriedades da enzima imobilizada. Os preparados Octyl-SWL e MCI-SWL preservaram sua atividade lipolítica quando expostos a 50 % (v/v) de Butanol, Etanol, n-Hexano, Isopropanol e Metanol. Na síntese do éster aromático butirato de etila, Octyl-SWL e MCI-SWL exibiram desempenho promissor, alcançando em 24 h de reação 28 % e 35,6 % de rendimento, respectivamente. Lipases de S. warneri EX17 purificadas e imobilizadas em suportes hidrofóbicos preservaram propriedades que apontam seu potencial como biocatalisador industrial. / Microbial enzymes, when produced at affordable costs and preserving their catalytic properties, are crucial tools for sustainable chemical and energy industries. To enhance lipase production by Staphylococcus warneri EX17 strain, different cultivation strategies were applied to investigate the influence of some variables on enzyme production and then fed-batch cultivation was proposed. Additionally, three hydrophobic supports, Octyl-Sepharose, Immobead 150 and MCI GEL CHP20P have been assayed to purify and immobilize the lipase from S. warneri EX17 (SWL) via interfacial adsorption. Results indicated that the intensity of the interaction between the lipase and the support surface interferes in properties of the immobilized enzyme. The immobilized preparations Octyl-SWL and MCI-SWL preserved their lipolytic activity in the presence of 50 % (v/v) Butanol, Ethanol, n-Hexane, Isopropanol and Methanol. Octyl-SWL and MCI-SWL catalyzed the ester synthesis reaction giving 28 % and 35.6 % of conversion in 24 h. These enzyme preparations may be promising alternatives as industrial biocatalysts.