Coenzimas piridínicos desempenham papel fundamental relacionado à suas propriedades de óxido-redução. Assim, participam da cadeia respiratória, onde se situam, devido ao valor do potencial de óxido-redução do par, logo no início, sendo os primeiros intermediários entre certos substratos e oxigênio. Constituem-se também no primeiro local de síntese de ATP; muito importante, presumivelmente em conexão com a função respiratória, é de fato de os coenzimas piridínicos intervirem nos sistemas de algumas transhidrogenases. / Not available

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-18Bitstream added on 2014-06-13T20:35:53Z : No. of bitstreams: 1 freitas_ac_me_rcla.pdf: 1903514 bytes, checksum: b15d5cad8c8ce930f33f9a5187a1c952 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As amilases são enzimas que catalisam a hidrólise do amido, dentre as quais se destaca a α-amilase, a β-amilase e a glicoamilase. Apresentam grande importância biotecnológica devido sua aplicação em vários processos industriais, principalmente alimentício. Podem ser obtidas de plantas, animais e microorganismos, no entanto, enzimas microbianas encontram maior demanda industrial. Além da importância econômica destas enzimas, novas metodologias têm sido desenvolvidas com resíduos como substrato para muitos processos industriais. A utilização de resíduos agro-industriais não só contribui para minimizar o impacto ambiental como atribui um valor econômico a esses substratos. Além disso, a imobilização de enzimas tem sido uma estratégia utilizada para a condução de bioprocessos, uma vez que os biocatalisadores imobilizados podem ser reutilizados em processos contínuos reduzindo custos de produção. Neste trabalho foi comparada a produção de amilases de dois fungos importantes para a indústria de alimentos, Rhizopus oryzae e Rhizopus microsporus var. oligosporus em fermentação submersa avaliando posteriormente os melhores métodos de imobilização da enzima, visando a produção de xarope de glicose. Os resultados mostraram que a farinha de trigo tipo II foi melhor ao farelo de mandioca e à farinha de mandioca como fonte de carbono na fermentação. As condições definidas para a fermentação foram: temperatura de 30°C e 96 h de tempo de fermentação para ambos os micro-organismos. O melhor pH para a atividade enzimática de Rhizopus oryzae foi 5,0, e de Rhizopus microsporus var. oligosporus foi 4,0 e 5,0. Ambas as enzimas apresentaram 100% de estabilidade em pH 4,0 a 7,0. A melhor temperatura para a atividade enzimática da amilase de R. oryzae foi 50°C e de R. oligosporus foram 60°C e 65°C. Ambas as... / Amylases are enzymes that catalyze starch hydrolysis, among which stands out α-amylase, β-amylase and glucoamylase. These enzymes have great importance due to its biotechnological application in various industrial processes, especially in food industry, among others. Also, they can be obtained from plants, animals and microorganisms, however microbial enzymes are the highest industrial demand. Besides economic importance, new methodologies has been developed with agricultural waste as substrate for many industrial processes. Bio-waste application in agro-industry not only minimizes environmental impacts as it increases economic value attached to these substrates. Immobilized enzymes is one strategy being used to conduct bio-processes, since immobilized biocatalysts can be reused in continuous processes and lowering production costs. In this paper two important fungi amylases from Rhizopus oryzae e Rhizopus microsporus var. oligosporus were characterized for enzyme production by optimal conditions and immobilization techniques, in order to produce glucose syrup. Results showed that type II wheat flour was better than cassava bagasse and cassava flour as fermentation’s carbon source. Fermentation conditions were: temperature 30°C during 96 hours for both microorganisms. Best enzymatic pH activity of Rhizopus oryzae was achieved at 5.0, and for Rhizopus microsporus var. oligosporus was 4.0 and 5.0. Both enzymes showed 100% stability from pH 4.0 to 7.0. The best temperature for amylase enzymatic activity of R. oryzae was 50°C and R. oligosporus were 60°C and 65°C. Both enzymes were 100% stable at temperature range of 20°C to 40°C, however the enzyme of R. oligosporus were more stable at temperatures above 50°C than R. oryzae. The products of starch enzymatic hydrolysis were analyzed by... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-06-11Bitstream added on 2014-06-13T19:56:04Z : No. of bitstreams: 1 pedrolli_db_me_rcla.pdf: 676301 bytes, checksum: a4723de4ae9b6c5b9f1e2619ab7118b5 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fungo Aspergillus giganteus produz uma única poligalacturonase (PG) quando cultivado em meio líquido com pectina de citrus como única fonte de carbono, e pelo menos três pectina liases (PL) quando cultivado em meio líquido com resíduo de laranja como fonte de carbono. A PG de A. giganteus foi purificada em duas etapas: precipitação de proteínas com 70% de saturação com sulfato de amônio e troca aniônica. A PG purificada apresentou massa molar de 69,7±0,07 kDa. A máxima atividade da enzima foi observada em pH 6,0 a 55-60ºC, sendo essa estável em meio neutro e alcalino. A PG apresentou meias-vidas de 115, 18 e 6 min quando incubada a 40, 50 e 55 ºC, respectivamente. A enzima mostrou-se ativa sobre substratos de qualquer grau de metilação, com maior especificidade para substratos de baixa ou nenhuma metilação, apresentando Vmax 669,6 e 602,8 μmol/mg.min, Km 3,25 e 1,16 mg/mL, kcat 770 e 690 s-1 sobre pectina de citrus 34 % esterificada e ácido poligalacturônico, respectivamente. A PG apresentou atividade exo liberando apenas ácido galacturônico como produto de hidrólise. 2-Mercaptoetanol, DTT, Co2+, Mn2+, Mg2+, NH4 + e Na+ agiram como estimulantes da atividade PG. Já Hg2+, EDTA, citrato de sódio, ácido iodoacético, SDS, Ba2+, Cu2+, Pb2+ e Zn2+ inibiram essa atividade enzimática. A principal pectina liase de A. giganteus, a PL I, foi purificada em três etapas: troca aniônica, troca catiônica e filtração em gel. A massa molar da PL I foi estimada em 55,7±1,4 kDa. A máxima atividade da enzima foi obtida em pH 8,5 a 50ºC. A PL I apresentou meias-vidas de 19, 9 e 6 min a 40, 45 e 50ºC, respectivamente. As maiores atividades da PL I foram observadas em pectinas de citrus com 34 e 72% de metilação, nas quais apresentou Vmax 1.488,1 e 1.129,8 U/mg.min, respectivamente, e Km 4,8 mg/mL para ambos os substratos. O padrão de degradação da pectina... / Aspergillus giganteus produces one polygalacturonase (PG) on liquid medium with citrus pectin as the only carbon source, and at least three pectin lyases (PL) with orange waste. Homogenous PG was obtained after two steps: protein precipitation with 70 % ammonium sulphate saturation and anionexchange chromatography. The purified PG showed molecular weight of 69.7±0,07 kDa. The enzyme exhibited maximal activity at pH 6.0 and 55-60 °C, and was stable in neutral and alkaline medium. The half-live for PG at 40, 50 and 55 °C was 115, 18 and 6 min, respectively. The enzyme was active on substrates with any methyl-esterification degree, and hydrolysed better low esterified and not esterified substrates, showing Vmax 669.6 and 602.8 μmol. mg-1.min-1, Km 3.25 and 1.16 mg/mL, kcat 770 and 690 s-1 on 34 % esterified citrus pectin and polygalacturonic acid, respectively. The unique soluble product released in the reaction with pectin and polygalacturonic acid was monogalacturonic acid, and according to this results the enzyme can be classified as exoPG. PG activity enhanced in presence of 2-mercaptoethanol, DTT, Co2+, Mn2+, Mg2+, NH4 + and Na+, and was completely inhibited in presence of Hg2+. EDTA, sodium citrate, iodoacetic acid, SDS, Ba2+, Cu2+, Pb2+ and Zn2+ inhibited enzyme activity. The main PL from A. giganteus was called PL I and was purified after three steps: anion-exchange and cation-exchange chromatographies, and gel filtration. The purified PL I showed molecular weight of 55.7±1.4 kDa. The enzyme exhibited maximal activity at pH 8.5 and 50 °C, and was stable in neutral and acid medium. The half-live for PL I at 40, 45 and 50 °C was 19, 9 and 6 min, respectively. The enzyme was more active on citrus pectins with 34 and 72% of esterification, showing Vmax 1,488.1 and 1,129.8 U. mg-1.min-1, repectively, and Km 4.8 mg/mL on both substrates. The degradation pathern on 34% esterified...(Complete abstract click electronic access below)

Orientadora : Profª Drª Carmen Lúcia de Oliveira Petkowicz / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Defesa: Curitiba, 17/02/2011 / Inclui referências / Resumo: A Metagenômica permite a aplicação de técnicas de biologia molecular em organismos não cultiváveis e têm tido um grande impacto na descoberta de novas enzimas. Para identificação de novos genes de enzimas hidrolíticas foram analisadas duas bibliotecas metagenômicas: uma do solo da Mata Atlântica paranaense (MAF) e outra do solo contaminado por gordura de uma planta de tratamento de resíduos industriais (SLP). Essas bibliotecas foram estocadas na forma de conjuntos de clones contendo 100.000 e 500.000 clones, respectivamente, com um tamanho médio de inserto de 30 kb clonados no vetor osmidial pCC2FOS. A triagem funcional foi realizada em meio sólido LA contendo um substrato específico para proteases (1% leite em pó desnatado), amilases (1% amido), celulases (0.2% carboximetilcelulose) ou quitinases (2% quitina coloidal). Como resultado foram encontrados 23 clones positivos para protease e 17 para quitinase pertencentes às duas bibliotecas. Análise de restrição com as endonucleases BamHI e EcoRI revelou três padrões diferentes para os clones de protease e quatro padrões para os de quitinase. Todos os clones positivos foram retransformados e somente o clone CHI1 manteve atividade quitinolítica. Uma sub-biblioteca de CHI1 foi construída em pUC18 e os plasmídeos dos subclones com atividade foram purificados e submetidos a mutagênese por inserção de transposon. As extremidades dos insertos de DNA de todos os subclones e mutantes com inserção de transposon foram sequenciados para obtenção de sequências consenso estendidas. A comparação dessas sequências com o GenBank através da ferramenta BlastX revelou três genes de quitinase com identidades entre 78 e 93% com Chi1 de Aeromonas punctata (Chit1), um endoquitinase básica de A. hydrophila (Chit2) e uma quitodextrinase de A. hydrophila subsp. hydrophila (Chit3). No PDB poucas estruturas similares estão disponíveis e o programa Modeller foi utilizado para construir um modelo de estrutura por homologia somente para o gene da Chit1, que apresentou 75% de identidade com a sequência de aminoácidos da estrutura de ChiA de Serratia marcescens. Os outros genes apresentaram cerca de 30% de identidade com Chi2 de Carica papaya e ChiB de S. marcescens, respectivamente. Chit1 e 3 pertencem a família 18 das glicosil hidrolases e a análise de suas sequências identificou-as como exoquitinases secretadas. Chi2 pertence a família 19 das glicosil hidrolases, geralmente encontradas em plantas, e também possui um domínio de lisozima que pode fornecer uma atividade antibacteriana. Quitinases podem ter atividade antifúngica e antibacteriana, além de erem utilizadas na produção de quito-oligômeros e N-acetilglucosamina. Essas moléculas são aplicadas como promotores de crescimento em plantas, imunoestimuladores, agentes antitumorais e antibacterianos. Os três genes de quitinases são novos e possuem potencial de aplicação como agentes de biocontrole e na produção de derivados de quitina. / Abstract: Metagenomics allows the application of molecular genomics to consortia of noncultivable microbes and has had substantial impact on the discovery of novel industrial enzymes. In order to identify new genes of hidrolytic enzymes we screened two fosmid metagenomic libraries; one from Atlantic Forest soil (MAF) and another from an animal fat-contaminated soil from an industrial wastewater treatment plant (SLP). These libraries were stored as pools and have 100,000 and 500,000 clones, respectively, with an average insert size of 30 kb cloned into the pCC2FOS fosmid vector. Functional screening was carried out on LB agar plates containing specific substrates for proteases (1% skimmed milk), amylases (1% starch), cellulases (0.2% carboximethylcellulose) and chitinases (colloidal chitin). As a result, 23 protease positive and 17 chitinase positive clones were found in the SLP and MAF libraries. Restriction analysis with BamHI and EcoRI endonucleases revealed three different restriction patterns among the protease activity bearing fosmids nd four patterns mong those conferring chitinase activity. All positive clones were retransformed and only clone CHI1 retained chitinase activity. A plasmid sub-library of CHI1 was constructed in pUC18 and subclone plasmids with activity were purified and submitted to transposon insertion mutagenesis. All subclones and transposon insertions mutants were sequenced. Contigs obtained were analysed with BlastX and three chitinases genes were found revealing identities between 78 and 93% with chiti ase 1 from Aeromonas punctata (Chit1), basic endonuclease from A. hydrophila (Chit2) and chitodextrinase from A. hydrophila subsp. hydrophila (Chit3). On PDB few similar structures were available and the Modeller software was used to construct an homology structure model for Chit1 gene that presents 75% identity with ChiA from Serratia marcescens. Other genes had 30% similarity to structures of Chi2 from Carica papaya and ChiB from S. marcescens, respectively. Chit1 and 3 belong to glycosil hydrolases family 18, and sequence analysis identified them as secreted exochitinases. Chi2 belongs to glycosil hydrolases family 19, generally found in plants, and also have a lysozyme domain that can provide an antibacterial activity. Chitinases may have antifungal and antibacterial activity and are used on chitooligomers and GlcNAc production. These compounds are applied as growth promoters in plants, imunoenhancers, antitumoral and antibacterial agents. The hree chitinases are new genes with potential application as biocontrol agents and on chitin derivatives production.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-03-30Bitstream added on 2014-06-13T20:10:33Z : No. of bitstreams: 1 santos_lfj_me_jabo.pdf: 849764 bytes, checksum: f44b7996a2cb16332037d11523efd658 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Todos os seres vivos necessitam de um suprimento energético, que deve ser obtido de fontes externas. As substâncias simples da dieta dos animas, como a água, os sais minerais e as vitaminas (exceto a vitamina B12), podem ser absorvidas ao longo do trato digestório sem sofrer transformações físicas ou químicas. Entretanto, macromoléculas tais como carboidratos, proteínas e lipídeos, têm de ser convertidas em moléculas pequenas e menos complexas para serem absorvidas. A digestão química dos nutrientes é realizada por hidrólise enzimática, que consiste na cisão de uma ligação química e inserção de uma molécula de água, sendo este processo catalisado pela ação das enzimas digestivas. O objetivo deste estudo foi o de se analisar a variação nas atividades de cinco hidrolases do sistema digestório de rã-touro (Lithobates catesbeianus) durante o desenvolvimento larval, para fornecer subsídios a nutrição animal. Os girinos foram mantidos em aquários, à 27ºC e separados por estádios de desenvolvimento. Amostras de estômago, pâncreas e intestino foram retiradas de 100 animais de cada estádio, congeladas em nitrogênio liquido e armazenadas a -70ºC para posterior homogeneização e determinação da atividade enzimática. A atividade das enzimas tripsina, -amilase e lipase pancreáticas (44,30 U.mg-1, 3,17 U.mg-1, 2,99 U.mg-1 respectivamente), e da maltase intestinal (26,99 U.mg-1), foram detectadas desde o início da fase de alimentação (estádio 26) enquanto que a atividade de catepsina-E gástrica (13,82 U.mg-1), foi estudada a partir do estádio 28, devido a dificuldade de se obter de estômagos antes deste estádio. Durante a pré-metamorfose a catepsina-E não apresentou grande variação em sua atividade, sendo observado aumento ao final do período da prómetamorfose. A atividade das demais... / All living beings require energy supply, wich must be obtained from external sources. Simple substances in the diet of the animals, such as water, minerals and vitamins (except vitamin B12) can be absorbed along the digestive tract without undergoing chemical or physical changes. However, macromolecules such as carbohydrates, proteins and lipids, must be converted into smaller and less complex molecules to be absorbed. The chemical digestion of nutrients is accomplished through enzymatic hydrolysis, which means to break a chemical bond and inserti a water molecule. This process is catalysed by the action of digestive enzymes. The aim of this study was to analyze the activity variation of five hydrolases of the bullfrog’s (Lithobates catesbeianus) digestive system during larval development, to provide subsidies to animal nutrition. The tadpoles were kept in aquaria, at 27 °C and separated by stages of development. Samples of stomach, pancreas and intestine were taken from 100 animals of each stage, frozen in liquid nitrogen and stored at -70ºC for later homogenization and enzyme activity determination. The activity of trypsin, -amylase and pancreatic lipase (44.30 U.mg-1, 3.17 U.mg-1, 2.99 U.mg-1 respectively), and intestinal maltase (26.99 U.mg-1) were detected since the start of feeding (stage 26) while the gastric cathepsin E (13.82 U.mg-1) activity was studied since stage 28, due to difficulty in obtaining stomachs before this stage. During pre-metamorphosis cathepsin-E did not show great variation in its activity, but an increase was observed at the end of the period of prometamorphosis. The other enzymes activity increased significantly in periods that precede metamorphosis, with the highest activities in stage 38 (261.97 U.mg-1 for trypsin, 28.19 U.mg-1 for -amylase and... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-28Bitstream added on 2014-06-13T18:50:17Z : No. of bitstreams: 1 alves_tb_me_araiq_parcial.pdf: 359292 bytes, checksum: 9f6ee8f49467852ffe2fa5d3c89821e1 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-03-16T11:30:13Z: alves_tb_me_araiq_parcial.pdf,Bitstream added on 2015-03-16T11:31:00Z : No. of bitstreams: 1 000721783.pdf: 1028730 bytes, checksum: 803d805d48e76655a83c6f107b8d897b (MD5) / A classe dos triterpenos pentacíclicos apresenta uma diversidade de estruturas que é devida ao número de rearranjos que a molécula do precursor oxidoesqualeno sofre durante a ciclização, sendo a friedelina o derivado com maior número de rearranjos. As oxidoesqualeno ciclases (OSCs) são enzimas que catalizam a biossíntese dos triterpenos, gerando essa variedade de estruturas. O objetivo deste estudo foi clonar OSCs a partir de folhas de Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek, uma espécie medicinal brasileira, para posterior análise funcional dos seus triterpenos pentacíclicos e localização filogenética em relação às OSC já caracterizadas de outras espécies. Para esta finalidade, adotou-se a estratégia de RT-PCR. O RNA total foi extraído a partir das folhas de M. ilicifolia e utilizado na síntese de cDNA. A amplificação de fragmentos “core” de genes de OSCs foi realizada com iniciadores parcialmente degenerados desenhados para amplificar regiões conservadas entre enzimas dessa família. Os fragmentos clonados foram sequenciados e iniciadores específicos foram desenhados para as amplificações das extremidades 5’ e 3’. Posteriormente iniciadores específicos foram desenhados para clonagem dos cDNAs completos. Comparação com banco de dados revelou que uma das ORFs obtida possui alta identidade com cicloartenol sintases de outras espécies de plantas já caracterizadas e que outras três ORFs clonadas possuem alta identidade com triterpeno sintases como beta-amirina, lupeol e isomultiflorenol sintases. As ORFs clonadas serão utilizadas em estudos futuros para expressão por sistema heterólogo permitindo a identificação das oxidoesqualeno ciclases por meio de análise dos produtos gerados / The class of pentacyclic triterpenes presents a diversity of structures due to the number of rearrangements that the molecule of oxidosqualene undergoes during cyclization, being friedelin the derivative with maximum number of rearrangements. The oxidosqualene cyclases (OSCs) are enzymes that catalyze the biosynthesis of triterpenes, generating a wide variety of molecules. This study aims to clone OSC from leaves of Maytenus ilicifolia Mart. ex Reissek, a medicinal species from Brazil, for further functional analysis of its pentacyclic triterpenes and phylogenetic localization in comparison of OSCs characterized from other species. For this purpose, we adopted the strategy of RT-PCR. Total RNA was extracted from leaves of M. ilicifolia and used in the synthesis of cDNA. The PCR amplification of core fragments of OSC genes was performed with partially degenerated primers designed to amplify highly conserved regions among this class of enzymes. The cloned fragments were sequenced and specific primers were designed for amplification of 5’ and 3’ ends. Then, specific primers were designed for amplification of full-length cDNAs. Phylogenetic analyzes revealed that TS6 showed high identity with cycloartenol synthase of several other plant species already characterized, and CS4 exhibit high identity to triterpene synthases as beta-amyrin, lupeol and isomultiflorenol synthases from other plant species. The ORFs cloned will be used in future studies for expression in heterologous system allowing identification of the oxidosqualene cyclases by analysis of the products generated.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-04-20Bitstream added on 2014-06-13T19:29:01Z : No. of bitstreams: 1 riul_aj_me_araiq.pdf: 887543 bytes, checksum: cec5191b12ce838bc6e308cecf5c08c1 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A tanase (EC 3.1.1.20) é uma enzima capaz de hidrolisar ligações éster e depsídicas de taninos hidrolisáveis obtendo-se como produtos a glicose e o ácido elágico ou ácido gálico, sendo este último, um importante substrato para as indústrias farmacêutica e química. Entre os diferentes organismos capazes de produzir tanases, os microrganismos, de modo especial os fungos filamentosos, vêm se destacando uma vez que são mais versáteis na degradação de diferentes tipos de taninos. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho foi estudar a produção de tanases intra e extracelulares por Aspergillus phoenicis em Fermentação Submersa (FSbm) e em Fermentação em Substrato Sólido (FSS), melhorando as condições de cultivo para obtenção destas enzimas em altos níveis, purificando e caracterizando-as bioquimicamente. Os maiores níveis enzimáticos em FSS foram obtidos utilizando-se folhas de caju e chá verde como fonte de carbono umedecidas com solução de sais Khanna (1:1, m/v), a 30ºC por 6 dias e em FSbm tendo 2% de ácido tânico como fonte de carbono, por 3 dias a 30ºC para ambas as formas enzimáticas. Fontes de nitrogênio e fosfato aumentaram a produção de tanases quando adicionadas em baixas concentrações. As tanases extra e intracelular produzidas em FSbm foram purificadas 22 e 17 vezes com recuperação de 9% e 16%, respectivamente, após dois passos cromatográficos, DEAE-Celulose e Sepharose CL6B. A forma extracelular possui massa molar nativa de aproximadamente 218,8 kDa com 65,1% de carboidratos. Já a enzima intracelular apresentou massa molar nativa de 154,9 kDa e 43,2% de carboidratos. A temperatura ótima de atividade para ambas as enzimas purificadas foi de 60ºC e o pH ótimo de atividade ficou estabelecido na faixa de 5,0 a 6,0 para ambas as formas tanásicas. As tanases se mostraram... / (EC 3.1.1.20) is an enzyme able to hydrolize ester and depside bonds of hydrolysable tannins obtaining as products glucose and ellagic acid or gallic acid. This last one is an important substrate for the pharmaceutical and chemical industries. Among different organisms able to produce tannases, the microorganisms, especially filamentous fungi, have been highlighted since they are more versatile in the degradation of different types of tannins. In this context, the aim of this work was to study the production of intracellular and extracellular tannase from Aspergillus phoenicis under Submerged Fermentation (SbmF) and Solid Substrate Fermentation (SSF), improving culture conditions to obtain these enzymes at high levels, purifying and characterizing them biochemically. The highest enzyme levels were obtained in SSF using cashew and green tea leaves wetted with Khanna salt solution (1:1, w/v) as carbon source at 30°C for 6 days and SbmF with 2% tannic acid as carbon source, for 3 days at 30°C, for both enzymatic forms. Nitrogen and phosphate sources increased the production of tannase when added at low concentrations. The extra and intracellular tannase produced in SbmF were purified 22 and 17 times with recovery of 9% and 16%, respectively, after two chromatographic steps, DEAE-Cellulose and Sepharose CL6B. The extracellular form has native molecular mass of 218.8 kDa with 65.1% of carbohydrate content. The intracellular enzyme showed native molecular mass of 154.9 kDa and 43.2% of carbohydrate content. The optimum temperature for both purified enzymes was 60°C, and the optimum pH activity was established at a range from 5.0 to 6.0 for both enzymatic forms. Tannase proved to be quite stable at both temperature and pH and the activities remained constant for all ions tested, except for... (Complete abstract click electronic access below)

Nesse trabalho, foi estudada a produção de endo e exo-poligalacturonases (PG) por Aspergillus oryzae IPT 301, em biorreatores com agitação mecânica (STR) e airlift de circulação interna e externa em escala de bancada. Utilizando um planejamento experimental, foi definida uma formulação de meio isento de sólidos em suspensão (WBE), com o qual foram obtidas atividades máximas de endo e exo-PG comparáveis com as atingidas com um meio formulado com farelo de trigo integral. Com o meio WBE, a produção de PG foi comparada em STR e airlift de circulação interna. Nesses ensaios, foram alcançadas atividades superiores de endo-PG (91,3 unidades por mililitro de meio, U/mL) e exo-PG (65,2 U/mL) com o STR, enquanto que com o biorreator airlift as atividades máximas de endo-PG e exo-PG foram 86,2 U/mL e 60,6 U/mL, respectivamente. Esses resultados demonstram a viabilidade do emprego da configuração airlift na produção de poligalacturonases por A. oryzae. Em cultivos em STR, foi avaliada a influência da presença, no meio WBE, de diferentes concentrações de pectina (0, 10 e 20 g/L) e glicose (0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 g/L) sobre o processo. Adicionalmente, em meios contendo 20 g/L de pectina e 20, 30 e 50 g/L de glicose, o pH foi controlado em um valor mínimo de 2,7. Nos testes em que o pH foi controlado nesse valor mínimo, foi observado um forte incremento das atividades de endo e exo-PG, destacando-se a concentração de glicose de 30 g/L com a qual atividades enzimáticas de 175,0 U/mL de endo-PG e 103,0 U/mL de exo-PG foram obtidas. Em STR, foram ainda testados meios de cultivo formulados com pectina em sua forma normal (WBE) e pectina que sofreu hidrólise enzimática parcial, com o fim de promover a redução da viscosidade do meio e, dessa forma, favorecer a transferência de oxigênio para o cultivo. Numa das condições testadas (WBE5), o meio foi formulado com metade da pectina parcialmente hidrolisada e com a outra metade não tratada. Nessa condição, atividades de endo-PG de 149,0 U/mL e de exo-PG de 82,2 U/mL foram obtidas, enquanto que com o uso do meio com a pectina integral atividades estatisticamente inferiores 130,0 e 78,0 U/mL, respectivamente foram determinadas. A produção de PG foi avaliada na condição WBE5 e na condição WBE6, com pectina não hidrolisada, em que os sais nutrientes foram adicionados parceladamente ao meio durante o cultivo, em biorreatores STR e airlift de circulação interna e externa. Após 96 h de processo, atividade superior de endo-PG (145,0 U/mL) foi atingida no STR, na condição WBE5, seguindo-se a condição WBE6 (140,0 U/mL) no mesmo reator. Em biorreatores airlift, títulos superiores de endo-PG (116,0 U/mL) e exo-PG (80,4 U/mL) foram atingidos no sistema de circulação externa, na condição WBE6, observando-se, para exo-PG, atividade semelhante à obtida no STR. O processo foi avaliado em meios com diferentes concentrações de KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4. Em análises individuais de cada um desses sais, em ensaios em frascos agitados, evidenciou-se a influência nas concentrações de sulfatos de NH4+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ sobre a produção de poligalacturonases. Em STR, sob condições controladas, foi comparada a produção enzimática no meio padrão WBE e com diferentes condições de adição dos sais ao cultivo. Entre as condições avaliadas em STR, as mais altas atividades de endo-PG (175 U/mL) e de exo-PG (86,5 U/mL) foram atingidas quando KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4 foram adicionados parceladamente ao meio durante o processo, com ganho significativo em relação ao meio WBE em que essas atividades alcançaram 130,0 e 78,6 U/mL, respectivamente. Os resultados do presente trabalho demonstram o alto potencial dos biorreatores airlift, como um sistema de relativa simplicidade de construção e operação, para a produção de poligalacturonases em grande escala. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-23T18:29:35Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Roselei Claudete Fontana.pdf: 2842746 bytes, checksum: 81128a000dba545ee34696c43a9146fb (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-23T18:29:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Roselei Claudete Fontana.pdf: 2842746 bytes, checksum: 81128a000dba545ee34696c43a9146fb (MD5) / In this work, the production of endo and exo-polygalacturonase (PG) by Aspergillus oryzae IPT 301 was studied in a stirred tank bioreactor (STR) and in airlift bioreactors with internal and external circulation loop. Using a factorial experimental design, a soluble culture medium (WBE) was defined which allowed the production of exo and endo-PG comparable to that obtained in a medium containing suspended wheat bran. With the WBE medium, the production of PG was compared in STR and internal-circulation-airlift bioreactor. In these tests, superior enzymatic activities for both endo-PG (91.3 units per mL of medium, U/mL) and exo-PG (65.2 U/mL) were obtained in the STR, whereas in the airlift reactor the maximum activities were 86.2 U/mL and 60.6 U/mL, respectively. These results indicate the feasibility of airlift reactors for producing polygalacturonases by A. oryzae. In STR cultivations, the influence of different concentrations of pectin (0, 10, and 20 g/L) and glucose (0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 g/L), in WBE medium, on the process was assessed. Furthermore, in media containing 20 g/L pectin and 20, 30, and 50 g/L glucose, tests where pH was controlled to a minimum value of 2.7 were carried out. In tests where pH was controlled to this minimum value, strong improvement of both endo and exo-PG activities was attained, especially in the run with 30 g/L glucose in which enzyme activities of 175.0 U/mL for endo-PG and 103.0 U/mL for exo-PG. In STR, cultivation media formulated with regular pectin (WBE) and with partially enzyme-hydrolysed pectin to reduce the viscosity of medium and as such to improve the oxygen transfer to the culture were evaluated. In one condition (WBE5), the medium was formulated with half of the pectin partially hydrolysed and half of the pectin untreated. In this condition, activities of endo-PG of 149.0 U/mL and exo-PG of 82.2 U/mL were achieved, whereas with the non-hydrolysed-pectin medium statistically inferior activities 130.0 and 78.0 U/mL, respectively were measured. PG production was compared in STR and in both airlift bioreactors (internal and external circulation loop), using the condition WBE5 and a further condition (WBE6), with non-hydrolysed pectin medium, in which the nutrient salts were fed to the medium in lots during the cultivation. After 96 h of process, a higher activity of endo-PG (145.0 U/mL) was attained in STR followed by the condition WBE6 in the same reactor (140.0 U/mL). In airlift bioreactors, superior titres of endo-PG (116.0 U/mL) and exo-PG (80.4 U/mL) were obtained in the condition WBE6, with the external loop configuration, the activity of exo-PG being similar to that measured in STR. The process was evaluated in media with different concentrations of KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4. In individual analysis of each salt, performed in shake-flasks experiments, the influence of the concentrations of NH4+, Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ sulphates on the production of polygalacturonases was evidenced. In STR, under controlled conditions, the enzyme production in WBE medium was compared with different conditions of salt feeding to the culture. Among the conditions tested in STR, the highest activities for endo-PG (175.0 U/mL) and exo-PG (86.5 U/mL) were achieved when KH2PO4, (NH4)2SO4, FeSO4, MnSO4, MgSO4 e ZnSO4 were fed to the medium in lots, with a significant improvement in comparison to the use of WBE medium that resulted in activities of 130.0 and 78.6 U/mL, respectively. The results of this work reveal the high potential of airlift bioreactors as a relatively simple building operating system to be used in large-scale polygalacturonase production.

Na presença de lactose e frutose, ácido lactobiônico e sorbitol são formados equimolarmente em reações catalisadas por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glicono--lactonase (GL), enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis. O ácido lactobiônico tem alto valor comercial e, como o sorbitol, importantes aplicações industriais. Este trabalho objetivou estudar a cinética de produção de ácido lactobiônico e sorbitol por células de Z. mobilis permeabilizadas com brometo de cetil trimetil amônio, livres ou imobilizadas em alginato de cálcio. As constantes de saturação de Michaelis-Menten de GFOR/GL para lactose e frutose foram estimadas em 0,39 e 0,050mol/L, respectivamente, e Vmáx em 7,69 unidades de GFOR/GL por grama de células secas (U/g), em que U corresponde a mmol de produto formado por hora. A imobilização de Z. mobilis foi avaliada com suspensões celulares de 30, 50 e 70g/L, observando-se redução do fluxo de massa dos solutos através das esferas de alginato de cálcio com maiores massas de células. Como na bioconversão de lactose/frutose em ácido lactobiônico/sorbitol, um considerável volume do reator é ocupado pelas esferas, o uso da suspensão celular de 70g/L para a imobilização se mostrou favorável devido à menor quantidade do suporte para ter-se a concentração de células/enzimas desejada para o processo. Assim, os problemas operacionais associados à mistura e ao controle de pH foram minimizados. No processo de bioconversão, concentrações de biocatalisador, livre ou imobilizado, entre 5 a 20g/L resultaram em teores de ácido lactobiônico semelhantes, em torno de 170g/L, com rendimento de cerca de 70% e produtividades proporcionalmente crescentes. A velocidade específica de formação de produto calculada nas primeiras horas de processo com células imobilizadas ( 0,76g/g/h) foi menor que a medida com células livres (  2,0g/g/h) em razão de o suporte de imobilização atuar como uma barreira física para o transporte de massa. Na sequência, porém, constatou-se uma maior estabilidade do sistema imobilizado e, em consequência, produtividades semelhantes ( 7,1g/L/h) foram alcançadas em ambas as condições. Para avaliar-se possibilidade de reutilização das células imobilizadas, foram realizadas oito bioconversões seguidas – 193h de operação –, constatando-se a preservação de 85% da atividade inicial. Na bioconversão, o pH foi controlado em 6,4 com NaOH, sendo formado lactobionato de sódio. Este sal foi precipitado com etanol e, em seguida, convertido à forma ácida – ácido lactobiônico por cromatografia de troca iônica. O produto purificado apresentou características físico-químicas semelhantes às da substância padrão comercial. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-12T11:58:51Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Sabrina Carra.pdf: 1781083 bytes, checksum: 30af4ac69fa2741ab8e210ae702e0a55 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-12T11:58:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Sabrina Carra.pdf: 1781083 bytes, checksum: 30af4ac69fa2741ab8e210ae702e0a55 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Na presença de lactose e frutose, ácido lactobiônico e sorbitol são formados equimolarmente em reações catalisadas por glicose-frutose oxidorredutase (GFOR) e glicono--lactonase (GL), enzimas periplasmáticas de Zymomonas mobilis. O ácido lactobiônico tem alto valor comercial e, como o sorbitol, importantes aplicações industriais. Este trabalho objetivou estudar a cinética de produção de ácido lactobiônico e sorbitol por células de Z. mobilis permeabilizadas com brometo de cetil trimetil amônio, livres ou imobilizadas em alginato de cálcio. As constantes de saturação de Michaelis-Menten de GFOR/GL para lactose e frutose foram estimadas em 0,39 e 0,050mol/L, respectivamente, e Vmáx em 7,69 unidades de GFOR/GL por grama de células secas (U/g), em que U corresponde a mmol de produto formado por hora. A imobilização de Z. mobilis foi avaliada com suspensões celulares de 30, 50 e 70g/L, observando-se redução do fluxo de massa dos solutos através das esferas de alginato de cálcio com maiores massas de células. Como na bioconversão de lactose/frutose em ácido lactobiônico/sorbitol, um considerável volume do reator é ocupado pelas esferas, o uso da suspensão celular de 70g/L para a imobilização se mostrou favorável devido à menor quantidade do suporte para ter-se a concentração de células/enzimas desejada para o processo. Assim, os problemas operacionais associados à mistura e ao controle de pH foram minimizados. No processo de bioconversão, concentrações de biocatalisador, livre ou imobilizado, entre 5 a 20g/L resultaram em teores de ácido lactobiônico semelhantes, em torno de 170g/L, com rendimento de cerca de 70% e produtividades proporcionalmente crescentes. A velocidade específica de formação de produto calculada nas primeiras horas de processo com células imobilizadas ( 0,76g/g/h) foi menor que a medida com células livres (  2,0g/g/h) em razão de o suporte de imobilização atuar como uma barreira física para o transporte de massa. Na sequência, porém, constatou-se uma maior estabilidade do sistema imobilizado e, em consequência, produtividades semelhantes ( 7,1g/L/h) foram alcançadas em ambas as condições. Para avaliar-se possibilidade de reutilização das células imobilizadas, foram realizadas oito bioconversões seguidas – 193h de operação –, constatando-se a preservação de 85% da atividade inicial. Na bioconversão, o pH foi controlado em 6,4 com NaOH, sendo formado lactobionato de sódio. Este sal foi precipitado com etanol e, em seguida, convertido à forma ácida – ácido lactobiônico por cromatografia de troca iônica. O produto purificado apresentou características físico-químicas semelhantes às da substância padrão comercial.

O cultivo de Aspergillus oryzae IPT-301 em meio líquido foi estudado para avaliar a influência do pH e do suprimento de oxigênio sobre o crescimento fúngico e a formação de pectinases. Definiuse um meio limitante para o crescimento com as seguintes concentrações: farelo de trigo em extrato aquoso, 40g/L; glicose, 5g/L; sulfato de amônio, 5g/L; pectina cítrica (indutor), 20g/L. O indutor foi estudado quanto ao momento de adição ao meio. Com adição em 24h de cultivo, a máxima concentração de biomassa foi atingida em cerca de 70h, quase 48h depois do observado no ensaio controle. A atividade enzimática máxima (27U/mL) foi semelhante à condição de referência (24U/mL), mas a ausência da pectina no início do processo facilitou a mistura e o controle do pH e do oxigênio dissolvido. No caso, reduziram-se a máxima frequência dos agitadores do biorreator (650 para 600rpm) e o período de tempo em que este nível de agitação precisou ser mantido para possibilitar a oxigenação do meio (30h para 12h), o que favoreceria a preservação do micélio. Valores constantes e variáveis de pH do meio foram comparados em ensaios com adição de pectina em 24h e sem controle de oxigênio dissolvido. Verificou-se que o pH constante de 4,0 favoreceu o crescimento, que atingiu 4,5g/L, porém a atividade enzimática foi insignificante (1,4U/mL). Quando o pH decresceu naturalmente até o mínimo de 2,7, foram atingidos concentração de biomassa de 4,0g/L e atividade de pectinases de 24U/mL; na sequência, porém, a atividade baixou para 2U/mL, acompanhando o aumento do pH após 96h de processo. Entretanto, em cultivo em que o pH foi controlado em 2,7 nas horas finais do processo, a atividade enzimática foi preservada. Estes resultados, juntamente com os de ensaios enzimáticos, demonstraram que as pectinases de A. oryzae perdem a estabilidade à medida que o pH aumenta. O ensaio com pH constante em 2,7 foi o único em que a atividade pectinolítica foi superior quando a pectina esteve presente desde o início do cultivo. Possivelmente, a limitação do crescimento celular (máximo de 3,5g/L) favoreceu os mecanismos de transferência e mistura, prolongando a viabilidade celular. Cultivos com pH controlado em 4,0 no período de intenso crescimento celular e em 2,7 para a produção de pectinases (Ensaios T5 e T10) resultaram em elevadas atividades enzimáticas, especialmente quando a pectina foi adicionada em 24h (43U/mL). No caso, as mais efetivas condições de transferência de oxigênio e mistura, aliadas ao pH adequado ao crescimento, permitiram que a biomassa atingisse 6,3g/L e, após a redução do pH a 2,7, a atividade pectinolítica foi incrementada. Ensaios com oxigênio dissolvido em mínimo de 30% da saturação foram conduzidos em duas condições: Ensaio B5 - pH inicial 4,0 e controlado em 2,7 após atingir este valor; Ensaio B6 - pH constante em 4,0 até 24h, seguido de redução para 2,7 e controle neste valor. As concentrações celulares atingidas em B5 (6,0g/L) e em B6 (6,8g/L) foram semelhantes à de T10, mas suas máximas atividades pectinolíticas – 106 e 120U/mL, respectivamente – foram as maiores deste estudo. Estes resultados se deveram, provavelmente, à intensificação do metabolismo fúngico associado à disponibilidade ilimitada de oxigênio. Apesar de o tempo para atingir os picos de biomassa e atividade enzimática ter sido aumentado, a produtividade do Ensaio B6 foi 3,7 vezes maior que a do controle. Os resultados deste trabalho confirmaram que o pH e o suprimento de oxigênio em cultivos de A. oryzae afetam decisivamente tanto o crescimento quanto a produção de pectinases. As condições operacionais definidas possibilitaram a redução do crescimento celular – permitindo, entretanto, a obtenção de atividades enzimáticas elevadas – e, em decorrência, um controle eficiente dos parâmetros estudados. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-16T13:00:04Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lenara Meneghel Santa Catharina.pdf: 2002637 bytes, checksum: 6291a4802d64eabed73c3db13116f5b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-16T13:00:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Lenara Meneghel Santa Catharina.pdf: 2002637 bytes, checksum: 6291a4802d64eabed73c3db13116f5b5 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The cultivation of Aspergillus oryzae IPT-301 in liquid medium was studied to assess the influence of pH and oxygen supply on the fungal growth and the formation of pectinases. A growthlimiting medium was defined with the following concentrations: wheat bran in aqueous extract, 40g/L; glucose, 5g/L; ammonium sulphate, 5g/L; citric pectin (inducer), 20g/L. The inducer was evaluated with respect to the time of addition to the medium. With the addition in 24h of cultivation, maximum biomass concentration was achieved in 70h, almost 48h after reaching the cell growth peak of the control experiment. The maximum enzyme activity (27U/mL) was similar to that of the reference run (24U/mL), but the absence of pectin at the beginning of the process favoured mixing and the control of pH and dissolved oxygen concentration. In this case, the maximum impeller speed in the bioreactor (650 to 600rpm) and the time period that this level of agitation was maintained to provide the best possible medium oxygenation were reduced (30 to 12h), a condition that could favour the preservation of mycelium. Constant and varied medium pH values were evaluated in experiments with the addition of pectin in 24h and without dissolved oxygen concentration control. It was found that a constant pH of 4.0 favoured biomass growth, but the enzyme activity was insignificant (1.4U/mL). When the pH naturally decreased up to a minimum of 2.7, biomass concentration of 4.0g/L and pectinase activity of 24U/mL were attained; in the sequence, however, the activity fell to 2U/mL following the increase of pH observed after 96h. Nevertheless, in the cultivation in which the pH 2.7 was maintained though the final hours of process, the enzyme activity was preserved. These results together with those from enzymatic tests have shown that A. oryzae pectinases loose stability as pH rises. The experiment with constant pH at 2.7 was the only that results in superior pectinase activity with pectin present in the medium from the beginning of the cultivation. Possibly, cell growth limitation (maximum of 3.5g/L) favoured mass transfer and mixing mechanisms and the biomass viability was extended. Cultivations with the pH controlled at 4.0 when the cell growth was more intense and, afterwards, at 2.7 for pectinase production (Experiments T5 and T10) result in high enzyme activities, especially when pectin was added in 24h (43U/mL). In the case, the more effective conditions of oxygen transfer and mixing, allied to the adequate pH for cell growth, allowed that biomass concentration achieved 6.3g/L and, after reducing the pH to 2.7, pectinolytic activity as increased. Experiments with dissolved oxygen concentration at a minimum of 30% of saturation were carried out at two conditions: Experiment B5 - initial pH 4.0 and controlled at 2.7 after reaching this value; Experiment B6 – constant pH up to 24h, followed by reduction to 2.7 and control at this value. The cell concentrations achieved in B5 (6.0g/L) and in B6 (6.8g/L) were similar to that of T10, but their maximum pectinase activities – 106 and 120U/mL, respectively – were the largest in this study. Such results were probably due to the raising fungal metabolism which is associated to the unlimited oxygen availability. Although the time to reach the peaks of biomass and enzyme activity has been increased, the productivity of Experiment B6 was 3.7 times larger than that of the control run. The results of this work have confirmed that, in cultivations of A. oryzae, the pH and the oxygen supply decisively affect both cell growth and pectinase production. The defined operational conditions provided the reduction of cell growth – allowing, however, the achievement of high enzyme activities – and, consequently, an efficient control of the studied parameters.