Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Farmácia / Made available in DSpace on 2012-10-18T12:18:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-25T21:35:22Z : No. of bitstreams: 1 181630.pdf: 7926312 bytes, checksum: 532a80a4a414f58a8d2b2cf2fb87cfda (MD5)

Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. / Made available in DSpace on 2012-10-18T20:42:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2016-01-09T04:25:24Z : No. of bitstreams: 1 153220.pdf: 11551092 bytes, checksum: 4de6c027f096e2c07a8fb22811c8f52c (MD5) / As lipases de Chromobacterium viscosum, Pseudomonas sp, Microbial e Lipolase, imobilizadas em organo-gel (MBG) de hexano foram usadas como biocatalisadores na reação de transesterificação enantiosseletiva do laurato de p-nitrofenila com (±)-2-octanol e (±)-2-hexanol. Com objetivo de avaliar o efeito da atividade de diferentes lipases imobilizadas em MBG via reações de transesterificação em dois solventes, acetonitrila e hexano, uma série de ésteres foi sintetizado usando laurato de p-nitrofenila e álcoois alifáticos primários de cadeia linear e secundários racêmicos. Foi também estudado o grau de impedimento imposto pelas barreiras difusionais de ésteres quando estes passam do meio reacional para o organo-gel e vice-versa, através de medidas de coeficiente de difusão (D) dos benzoatos de alquilas e alcanoatos de p-nitrofenila. O efeito da temperatura para a difusão do laurato de p-nitrofenila em organo-gel de hexano, utilizando hexano como solvente externo, também foi avaliado. A partir destes resultados foi possível determinar os parâmetros termodinâmicos ( Ea, DH#, DG#, DS#).

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-04-03T13:42:18Z No. of bitstreams: 1 2017_DiandraAlbuquerqueLopesCosta.pdf: 2018214 bytes, checksum: 88c8592ed119ed5b759a9dd4c6a67077 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-04-18T13:29:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DiandraAlbuquerqueLopesCosta.pdf: 2018214 bytes, checksum: 88c8592ed119ed5b759a9dd4c6a67077 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-18T13:29:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DiandraAlbuquerqueLopesCosta.pdf: 2018214 bytes, checksum: 88c8592ed119ed5b759a9dd4c6a67077 (MD5) / As mananases microbianas são principalmente enzimas extracelulares, cuja produção é grandemente influenciada por fatores nutricionais e fisioquímicos, como fonte de nitrogênio, carbono, pH, temperatura, agitação e concentração de oxigênio dissolvido. Dada a propriedade de atuar em uma ampla faixa de pH e temperatura, as mananases microbianas apresentam uma variedade de aplicações, podendo ser empregadas na produção de etanol de segunda geração, indústrias têxteis, como também no melhoramento do valor nutricional de alguns alimentos. Neste trabalho, o fungo filamentoso Clonostachys byssicola foi utilizado para produção de mananases tendo a casca de soja como fonte de carbono. C. byssicola, foi cultivado em meio submerso contendo casca de soja 1% por sete dias. O extrato bruto, concentrado por ultrafiltração (EBC) com membrana de retenção de 30 kDa, apresentou atividade de mananase de 4,18 UI/mL. As amostras de mananases presentes no EBC foram semi-purificadas por dois tipos de cromatografia de troca aniônica: DEAE Sepharose Fast Flow (DEAE) e Q Sepharose Fast Flow (QFF). O EBC e a fração semi-purificada (ManQFF) apresentaram temperaturas com maior atividade à 55 e 45 ºC, respectivamente. Ambas as amostras enzimáticas foram mais ativas em pH 5,0. As amostras enzimáticas do EBC e ManQFF apresentaram termoestabilidade a 40ºC por um período de 192 horas e 50 min, respectivamente. O íon Co2+ aumentou as atividades de mananases do EBC (15%) e ManQFF (35%) quando incubado em uma concentração final de 10 mM. Contudo, os compostos fenólicos inibiram a atividade de mananase. A atividade de mananase do EBC apresentou um KM aparente de 12,73 ± 1,97 mg/mL e Vmáx de 7,65 ± 0,52 UI/mL, enquanto a presente na fração semi-purificada exibiu KM de 8,53 ± 0,31 mg/mL e Vmáx de 0,255 ± 0,0033 UI/Ml. A análise da eletroforese e zimografia, mostrou que C. byssicola produz proteoformas de mananases com massas moleculares variando de 36,6 a 53 kDa. Ademais, os ensaios de hidrólise enzimática da manana 1% e da casca de soja 1% com amostras do EBC, mostraram a produção de grandes quantidades de mano-oligossacarídeos, cujos principais produtos liberados foram manose e manobiose. / Microbial mannanases are mainly extracellular enzymes whose production is greatly influenced by nutritional and physicochemical factors such as nitrogen and carbon sources, pH, temperature, agitation and dissolved oxygen concentration. Given the property of acting in a wide range of pH and temperature, the microbial manannases present a variety of applications, being able to be used in the production of second generation ethanol, textile industries, as well in improving the nutritional value of some foods. In this work, the filamentous fungus Clonostachys byssicola was used to produce mannanases having the soybean hull 1% as carbon source C. byssicola, was cultivated in submerged medium containing soybean hull for seven days. The crude extract was concentrated by ultrafiltration (EBC) membrane with retention of 30 kDa and presented mananase activity of 4.18 IU/mL. The mannanase samples present in the EBC were semi-purified by two types of anion exchange chromatography: DEAE Sepharose Fast Flow (DEAE) and Q Sepharose Fast Flow (QFF). Both, EBC and semi-purified fraction (ManQFF) were more active at 55 and 45 ºC, respectively. Both enzymatic samples were also more active at pH 5.0. Regarding their thermostability, EBC and ManQFF enzymatic samples showed half-lives of 192 hours and 50 min at 40°C, respectively. The Co2+ ion increased mannanase activities of EBC (15%) and ManQFF (35%) when incubated at a final concentration of 10 mM. However, phenolic compounds inhibited the activity of mannanase. EBC mannanase activity had an apparent KM of 12.73 ± 1.97 mg/mL and Vmax of 7.65 ± 0.52 IU/mL, whereas the semi-purified fraction exhibited KM of 8.53 ± 0.31 mg / mL and Vmax of 0.255 ± 0.0033 IU/mL. Electrophoresis and zymogram studies showed that C. byssicola produces proteoforms of mannanases with molecular mass varying from 36.6 to 53 kDa. In addition, enzymatic hydrolysis experiments of mannan 1% and soybean hulls 1% with EBC samples showed the production of large quantities of mannooligosaccharides, mannobiose and mannose.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-06-23T18:43:23Z No. of bitstreams: 1 2015_DeboraLoSciuto.pdf: 2930905 bytes, checksum: 5a066e6e45c40ffdadd632e863375380 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-06-23T20:01:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_DeboraLoSciuto.pdf: 2930905 bytes, checksum: 5a066e6e45c40ffdadd632e863375380 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-23T20:01:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_DeboraLoSciuto.pdf: 2930905 bytes, checksum: 5a066e6e45c40ffdadd632e863375380 (MD5) / O fungo filamentoso Clonostachys byssicola foi cultivado por sete dias em meio líquido contendo casca de soja 1 % (m/v) como única fonte de carbono. A capacidade do fungo em secretar enzimas holocelulolíticas foi avaliada, sendo observadas atividades de CMCase, FPase, mananase, pectinase e xilanase no extrato bruto. CMCase (0,904 UI/mL) foi escolhida como principal alvo de investigação. O extrato bruto foi concentrado por ultrafiltração em membrana com retenção de 10 kDa, e CMCase presente no extrato concentrado foi parcialmente purificada utilizando coluna cromatográfica de exclusão molecular (Sephacryl S100) e de troca iônica (Q Sepharose e DEAE Sepharose Fast Flow). CMCase presente no extrato concentrado e frações reunidas oriundas das colunas de troca iônica foram caracterizadas. A enzima semi purificada apresentou maior atividade a 60-70 °C e pH 5,0, sendo termoestável a 40 °C e 50 °C e possui massa molecular de aproximadamente 48 kDa. Compostos fenólicos (vanilina, ácidos tânico, 4-hidroxibenzóico, ferúlico, ρ-coumárico e cinâmico) não tiveram efeito inibitório e de desativação sobre a atividade celulolítica. Os íons Cu2+, Fe2+, Fe3+ e Zn2+ na concentração de 10 mM inibiram atividade de CMCase em até 70 %, 94 %, 100 % e 44 %, respectivamente; o íon Co2+ (10 mM) ativou a atividade enzimática das frações Cel-QFF e Cel-DEAE em 21 % e 25 %, respectivamente. Os valores de kM e Vmáx de CMCase foram 24,93 mg/mL e 2,14 UI/mL (no extrato concentrado); e 15,81 mg/mL e 0,59 UI/mL (na fração Cel-DEAE), respectivamente. Foram realizados ensaios de hidrólise enzimática de avicel, CMC, papel de filtro, manana e xilana e substratos lignocelulósicos (casca de soja e bagaço de cana de açúcar) com enzimas do extrato concentrado e fração Cel-QFF. Os principais produtos de hidrólise enzimática de CMC e papel de filtro foram glicose, celopentaose e celohexaose. A hidrólise enzimática de casca de soja liberou maior quantidade de açúcar que a hidrólise de bagaço de cana de açúcar, sugerindo que as enzimas secretadas durante o crescimento de C. byssicola possuem atividade enzimática mais proeminente sobre o substrato utilizado como fonte de carbono. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The filamentous fungus Clonostachys byssicola was cultivated for seven days in liquid medium containing soybean hulls 1 % (w/v) as the sole carbon source. The fungus's ability to secrete holocellulolytic enzymes was evaluated and activities of CMCase, FPase, mannanase, pectinase and xilanase were observed in the crude extract. CMCase (0.904 IU/mL) was chosen as the main target of research. The crude extract was concentrated by ultrafiltration membrane with retention of 10 kDa, and CMCase present in the concentrated fraction was partially purified using molecular exclusion (Sephacryl S100) and ion exchange chromatography columns (Q Sepharose and DEAE Sepharose Fast Flow). CMCase present in the concentrated fraction and pooled fractions from the ion exchange columns were characterized. The semi purified enzyme exhibited higher activity at 60-70 °C and pH 5.0, being thermostable at 40 °C and 50 °C and has a molecular mass of approximately 48 kDa. Phenolic compounds (vanillin, tannic, 4-hydroxybenzoic, ferulic, ρ-coumaric and cinnamic acids) had no inhibitory and deactivation effects on cellulolytic activity. Cu2+, Fe2+, Fe3+ and Zn2+ at a concentration of 10 mM inhibited CMCase activity by 70 %, 94 %, 100 % and 44 %, respectively; Co2+ (10 mM) activated enzyme activity of the Cel-QFF and Cel-DEAE fractions by 21 % and 25 %, respectively. KM and Vmax values of CMCase were found to be 24.93 mg/mL and 2.14 IU/mL (concentrated fraction); and 15.81 mg/mL and 0.59 IU/mL (Cel-DEAE fraction), respectively. Enzymatic hydrolysis of avicel, CMC, filter paper, xylan and mannan and lignocellulosic substrates (soybean hulls and sugar cane bagasse) were performed with enzymes of the concentrated fraction and Cel-QFF fraction. The main enzymatic hydrolysis products of CMC and filter paper were glucose, cellopentaose and cellohexaose. Enzymatic hydrolysis of soybean hulls released higher sugar amount than the hydrolysis of sugarcane bagasse, suggesting that the enzymes secreted during the growth of C. byssicola have more prominent enzyme activity on the substrate used as a carbon source.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Tecnologias Química e Biológica, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-05-04T13:24:11Z No. of bitstreams: 1 2017_ElianedaSilvaSimplicio.pdf: 7450857 bytes, checksum: 6ffa56e1b72eb93822986ebc4afdf423 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-05-18T13:01:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_ElianedaSilvaSimplicio.pdf: 7450857 bytes, checksum: 6ffa56e1b72eb93822986ebc4afdf423 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-18T13:01:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_ElianedaSilvaSimplicio.pdf: 7450857 bytes, checksum: 6ffa56e1b72eb93822986ebc4afdf423 (MD5) / O desenvolvimento de novos materiais utilizando como matéria-prima resíduos lignocelulósicos tem sido alvo de inúmeras pesquisas, visto o potencial e a disponibilidade destas matrizes, além da oportunidade de diversificação de produtos de interesse em vários setores produtivos no país. Neste contexto, o isolamento de nanofibras de celulose (NFC) a partir da fração celulósica de diversas fontes vegetais propicia a obtenção de nanoestruturas com elevada área superficial, cristalinidade e razão de aspecto, o que é de interesse para a prospecção de produtos diferenciados. Desse modo, o objetivo deste trabalho consiste no isolamento e caracterização de nanofibras de celulose de bagaço de cana-de-açúcar e engaços de dendê. Para tanto, é necessário primeiramente purificar a celulose e então realizar a hidrólise enzimática. O bagaço de cana e os engaços de dendê in natura foram secos, moídos e tratados com solução de clorito de sódio (2%) acidificada com ácido acético e posteriormente com solução de hidróxido de potássio (6%). Também avaliou-se o tratamento das fibras in natura por autohidrólise em diferentes condições (180 e 200 °C entre 10 e 30 min) aliado ao uso do clorito de sódio (2%) com um número reduzido de extrações, a fim de minimizar o uso de produtos químicos, tempo e geração de resíduos. As polpas obtidas pelos tratamentos com NaClO2/KOH e por autohidrólise/NaClO2 foram hidrolisadas utilizando coquetel de celulases de Trichoderma reesei a 50 °C, pH = 5,0 e agitação de 200 rpm por 24, 48 e 72 horas. As NFC extraídas foram caracterizadas quanto a morfologia, dimensões, cristalinidade, estabilidade térmica e carga superficial. Os resultados evidenciaram a obtenção de nanofibras com morfologia fina, alongada e espessura inferior a 20 nm, a partir da hidrólise das polpas de celulose de bagaço de cana e engaços de dendê branqueadas pelo uso do NaClO2/KOH e autohidrólise (180 °C/20 minutos e a 200 °C/10 minutos) combinado ao uso do NaClO2 (2%). Os melhores resultados avaliados foram obtidos para as nanoestruturas extraídas a partir da celulose obtida por autohidrólise a 200 °C por 10 minutos/clorito de sódio (2%) devido a menor espessura das nanoestruturas e o decréscimo não acentuado da cristalinidade, além da redução do uso de produtos químicos e resíduos gerados. Para as NFC 4 de bagaço de cana-de-açúcar a espessura variou entre 9,81 e 7,08 nm, de acordo com o aumento do tempo de hidrólise, com uma cristalinidade estimada entre 63,67 e 50,41%. Para as NFC 9 de engaços de dendê observou-se a obtenção de nanoestruturas com espessura entre 10,8 e 7,92 nm. A cristalinidade desses sistemas também sofreu um descréscimo, entre 52,68 e 33,31%, em virtude da degradação da celulose pelas enzimas em um maior tempo de hidrólise. A carga superficial das NFC isoladas apresentou potencial zeta -11 e -22 mV, no entanto a dispersão diluída de NFC apresentou estabilidade após armazenamento por meses. A análise termogravimétrica evidenciou que as NFC são mais estáveis termicamente que as fibras lignocelulósicas in natura e apresentam comportamento térmico semelhantes, mas com a diminuição na estabilidade térmica em função da redução da cristalinidade com o aumento do tempo de hidrólise, tendo o início da degradação entre 186 e 220 °C. Os resultados obtidos indicam que a hidrólise enzimática é capaz de extrair NFC desde que sejam controlados os tempos de reação (inferiores a 48 horas), de forma a não comprometer a cristalinidade e a estabilidade térmica das nanoestruturas isoladas. A via enzimática consiste em uma rota promissora e alternativa ao uso tradicional de catalisadores ácidos, como o ácido sulfúrico e o ácido clorídrico, onde o uso de celulases apresenta vantagens relacionadas as condições mais brandas de reação (temperatura, pH, menor periculosidade e eliminação de problemas com corrosão de equipamentos), além da especificidade dos biocatalisadores. Desse modo, estudos vem sendo liderados de forma a avaliar novos coquetéis enzimáticos, carga enzimática e o estudo do tempo de reação quanto ao rendimento de nanofibras e a produção de açúcares. / The development of new materials using as raw material lignocellulosic residues has been the object of numerous researches, considering the potential and the availability of these matrices, besides the opportunity of diversification of the materials of interest in various productive sectors in the country. In this context, the isolation of cellulose nanofibers (NFC) from the cellulosic fraction of several vegetable sources leads to the production of nanostructures with high surface area, crystallinity and aspect ratio, which is interesting for prospection of differentiated products with high aggregate value. Therefore, the objective of this work consists in the isolation and characterization of nanofibers from sugarcane bagasse and oil palm empty-fruit bunch. Therefore, it is first necessary to purify the cellulose and then perform the enzymatic hydrolysis. The sugarcane bagasse and oil palm empty-fruit bunch in natura were dried, ground and treated with sodium chlorite solution (2%), acidified with acetic acid and then with potassium hydroxide solution (6%). The treatment of in natura fibers was also evaluated by autohydrolysis process under different conditions (180 and 200 °C between 10 and 30 minutes), followed by the use of sodium chlorite (2%) with a reduced number of extractions, in order to minimize the use of chemicals, time and waste generation. The pulps obtained by the NaClO2/KOH or autohydrolysis/NaClO2 treatments were hydrolyzed using the cocktail of cellulase of Trichoderma reesei, pH = 5,0 and stirring speed of 200 rpm for 24, 48 and 72 hours. The extracted NFC were characterized based on its morphology, dimensions, crystallinity, thermal stability and surface charge. The results evidenced the formation of fine and elongated nanofibers with thickness smaller than 20 nm, from the hydrolysis of sugarcane bagasse cellulose and oil palm empty-fruit bunch bleached by the use of NaClO2/KOH and autohydrolysis (180 °C/20 minutes at 200 °C/10 minutes) combined with the use of NaClO2 (2%). The best results were obtained for the nanostructures extracted from the cellulose obtained by autohydrolysis at 200 °C for 10 minutes/sodium chlorite (2%) due to the lower thickness of the nanostructures and the non-accentuated decrease in crystallinity, as well the reduced the use of chemicals and waste generated. For sugarcane bagasse NFC 4, the thickness varied between 9,81 and 7,08 nm, according to the increased hydrolysis time, with a crystallinity estimated between 63,67 and 50,41%. For the NFC 9 of oil palm empty-fruit bunch, nanostructures with thickness between 10,8 and 7,9 nm were observed. The crystallinity of these systems also decreased between 52,68 and 33,31%, due to the degradation of cellulose by enzymes in a longer hydrolysis time. The surface charge of the NFCs isolated showed negative zeta potential between -11 and -22 mV, however the diluted NFC dispersion showed stability after storage for months. The thermogravimetric analysis showed that NFC are more thermally stable than the in natura lignocellulosic fibers and presented similar thermal behavior, but there was a decrease of thermal stability as a function of the reduction of the crystallinity and increasing hydrolysis time, with an onset degradation temperature between 186 and 220 °C. The results indicated that the enzymatic hydrolysis is able to extracted the NFC by controlling the reaction time (less than 48 hours) in order to not compromise the crystallinity and the thermal stability of the isolated nanostructures. The enzymatic process is a promising route and alternative to the traditional use of acid catalysts, such as sulfuric acid and hydrochloric acid, where the use of cellulases has advantages related to the milder reaction conditions (temperature, pH, less danger and elimination of problems associated to equipment corrosion), as well as, the biocatalyst specificity. Thus, studies have been conducted in order to evaluate new enzyme cocktails, enzymatic loading and the study of the reaction time for nanofibers yield and sugar production.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências e Tecnologias e Saúde, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-05-09T16:36:49Z No. of bitstreams: 1 2017_GraziellaSantanaFeitosaFigueiredo.pdf: 2211740 bytes, checksum: c832f72056d451021bd4f1e9261611a2 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2017-05-10T10:16:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_GraziellaSantanaFeitosaFigueiredo.pdf: 2211740 bytes, checksum: c832f72056d451021bd4f1e9261611a2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T10:16:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_GraziellaSantanaFeitosaFigueiredo.pdf: 2211740 bytes, checksum: c832f72056d451021bd4f1e9261611a2 (MD5) / A doença de Chagas é endêmica da América Latina, tem como agente etiológico o parasito Trypanosoma cruzi. O tratamento da doença durante a fase crônica gera diversos efeitos colaterais. Nesse sentido, as proteases de tripanossomatídeos têm sido investigadas na busca de novos alvos terapêuticos. A dipeptidil peptidase 8 de Trypanosoma cruzi (DPP8Tc) é uma enzima que faz parte das prolyloligopeptidases, essa família possui membros com conhecida relevância médica, dentre elas está a enzima ortóloga DPPIV humana, cuja inibição é utilizada como uma das formas de tratamento da diabetes tipo II. A DPP8Tc, foi investigada neste trabalho por meio da caracterização bioquímica e por nocaute físico dos alelos do gene dpp8tc do parasito T. cruzi da cepa CL Brener. Os resultados obtidos indicam que a DPP8Tc é uma enzima dimérica, solúvel, ativa em tampão tris 50mM em pH situado entre 7,5 e 8,0 e melhora sua atividade com aditivos. A temperatura ótima para atividade enzimática situa-se em torno dos 28ºC e substrato específico, Gly-Pro-AMC. Com o uso deste substrato, foram obtidos os parâmetros KM de 10,78 μM, Kcat de 1,67x10-3 s-1, Vmax 4,6x10-5 μmol de AMC liberado/min e Kcat/KM:1,55x10μM-1s-1. Os inibidores clássicos de proteases exercem baixa inibição enzimática da DPP8Tc. Em contrapartida, os inibidores de DPPIV exercem maior taxa de inibição entre eles o IB-7, o mais potente, inibe em 96,59% da DPP8Tc, com constante de inibição (Ki) de 8,2 nM. Outros inibidores da DPPIV apresentaram os seguintes ICs-50: KS (IV) com 95,47 nM, IB-4 com 484,9 nM e por último, KAII-23 com 2,7μM. A inibição enzimática ocorre principalmente por inibidores que possuem o grupo adamantil na sua composição química, semelhante à composição do inibidor vidaglipitina da DPPIV humana. A atividade ótima ocorre em torno dos 28ºC, temperatura requerida à sobrevivência da forma epimastigota, indicando potencial função no barbeiro. O nocaute simples do gene dpp8tc, diminuiu em 50% a atividade enzimática, em 20% a fluorescência e aumentou 2,9% a taxa de infecção do parasito DPP8Tc+. As diferenças existentes nas regiões UTRs 5’ e 3’ dos alelos do gene DPP8Tc, impediu o sucesso do nocaute duplo, sendo necessária a construção específica de um cassete direcionado para o nocaute do segundo alelo, visando conhecer por completo a função da DPP8Tc de Trypanosoma cruzi. / Chagas disease is endemic in Latin America, and has the parasite Trypanosoma cruzi as its etiological agent. Treatment of the disease during the chronic phase generates several side effects. In this sense, trypanosomatid proteases have been investigated in the search for new therapeutic targets. The dipeptidyl peptidase 8 of Trypanosoma cruzi (DPP8Tc) is an enzyme that is part of the prolyloligopeptidases, this family has members with known medical relevance, among them is the human orthological enzyme DPPIV, whose inhibition is used as one of the forms of treatment of type diabetes II. DPP8Tc was investigated in this work through the biochemical characterization and physical knockout of the dpp8tc gene alleles of the T. cruzi parasite of the CL Brener strain. The results indicate that DPP8Tc is a soluble dimeric enzyme active in 50mM tris buffer at pH between 7.5 and 8.0 and improves its activity with additives. The optimal temperature for enzymatic activity is around 28ºC and specific substrate, Gly-Pro-AMC. With the use of this substrate, KM parameters of 10.78 μM, Kcat of 1.67x10-3 s-1, Vmax 4.6x10-5 μmol of released AMC / min and Kcat / KM were obtained: 1.55x10μM-1s -1. Classical protease inhibitors exert low enzymatic inhibition of DPP8Tc. In contrast, DPPIV inhibitors exert a greater inhibition rate among them, the more potent IB-7 inhibits in 96.59% of DPP8Tc, with inhibition constant (Ki) of 8.2 nM. Other DPPIV inhibitors showed the following ICs-50: KS (IV) with 95.47 nM, IB-4 with 484.9 nM and, finally, KAII-23 with 2.7 μM. Enzymatic inhibition occurs primarily by inhibitors that possess the adamantyl group in their chemical composition, similar to the composition of the human DPPIV vidagliptin inhibitor. The optimal activity occurs around 28ºC, temperature required to the survival of the epimastigote form, indicating potential function in the barber. The simple knockout of the dpp8tc gene, decreased enzyme activity by 50%, fluorescence by 20% and the infection rate of the parasite DPP8Tc+- increased by 2.9%. Differences in the 5 'and 3' UTRs regions of the DPP8Tc gene alleles prevented the success of double knockout, necessitating the specific construction of a cassette directed to the knockout of the second allele, in order to fully understand the function of DPP8Tc from Trypanosoma cruzi.

Mestrado (dissertação)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Saúde Coletiva, 2017. / Submitted by Gabriela Lima (gabrieladaduch@gmail.com) on 2017-12-01T11:46:31Z No. of bitstreams: 1 2017_DalilaFernandesGomes.pdf: 1067971 bytes, checksum: a46dc687ffab7bd0e0bd791da70c8ef3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-01-23T21:50:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_DalilaFernandesGomes.pdf: 1067971 bytes, checksum: a46dc687ffab7bd0e0bd791da70c8ef3 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-23T21:50:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_DalilaFernandesGomes.pdf: 1067971 bytes, checksum: a46dc687ffab7bd0e0bd791da70c8ef3 (MD5) Previous issue date: 2018-01-23 / Introdução: A mucopolissacaridose VI é uma doença rara caracterizada pela deficiência da enzima arilsulfatase B, responsável por diferentes manifestações clínicas. O tratamento consiste na terapia de reposição enzimática com administração intravenosa do medicamento galsulfase. Objetivo: Avaliar a efetividade da terapia de reposição enzimática com galsulfase no tratamento da mucopolissacaridose VI. Método: Trata-se de revisão sistemática de estudos observacionais. Os estudos foram pesquisados nas bases de dados PubMed, Cochrane Library, Lilacs e Journal of Inherited Metabolic Disease. As listas das referências bibliográficas dos estudos relevantes foram consultadas para identificar artigos potencialmente elegíveis. Não foram aplicadas restrições em relação à data de publicação, idioma ou status de publicação. Os estudos foram selecionados por duas avaliadoras independentes que também extraíram os dados e avaliaram a qualidade metodológica dos estudos. Resultados: Dezenove estudos preencheram os critérios de inclusão, dos quais nove foram série de casos, cinco relatos de caso, três coortes e dois transversais. Um total de 414 indivíduos com mucopolissacaridose tipo VI foram avaliados e quatorze desfechos diferentes relacionados ao efeito do tratamento foram identificados. Oito desfechos apresentaram resultados positivos, caracterizados como (1) redução de glicosaminoglicanos urinário, (2) melhora da função respiratória, (3) aumento da amplitude do movimento das articulações, (4) aumento da taxa de crescimento dos pacientes, (5) maior resistência física, (6) redução do tamanho do fígado e baço, (7) melhora da qualidade de vida e (8) normalização das dimensões cardíacas. Outros desfechos permaneceram estáveis, como o desenvolvimento cognitivo, acuidade visual, capacidade auditiva e apneia do sono. Quanto à segurança, reações adversas leves de hipersensibilidade como urticária e pirexia foram relatadas. Conclusão: Limitações metodológicas impossibilitaram a análise da efetividade do tratamento. No entanto, os achados do estudo indicam que a terapia de reposição enzimática tem efeito positivo na maioria dos desfechos associados à doença. Portanto, novos estudos devem ser fomentados a fim de melhorar a qualidade das evidências. / Introduction: Mucopolysaccharidosis VI is a rare disease characterized by the deficiency of the enzyme arylsulfatase B, responsible for different clinical manifestations. Treatment consists of enzyme replacement therapy with intravenous administration of the galsulfase drug. Objective: To evaluate the efficacy of enzyme replacement therapy with galsulfase in the treatment of mucopolysaccharidosis VI. Method: This is a systematic review of observational studies. The studies were searched in the PubMed, Cochrane Library, Lilacs and Journal of Inherited Metabolic Disease databases. The reference lists of relevant studies for consultation to identify potentially eligible articles. No restrictions were applied regarding publishing data, language, or publishing status. The studies were selected by two independent evaluators who also extracted the data and evaluated the methodological quality of the studies. Results: nineteen studies completed the inclusion criteria, of which nine were case series, five case reports, three cohorts and two cross-sectional. A total of 414 people with mucopolysaccharidosis VI were evaluated and fourteen different outcomes related to the treatment effect identified. Eight outcomes presented positive results, characterized as (1) reduction of urinary glycosaminoglycans, (2) improvement of respiratory function, (3) increased range of joint motion, (4) increased patient growth rate, (5) increased physical resistance, (6) reduction of liver and spleen size, (7) improvement of quality of life, and (8) normalization of cardiac dimensions. Other outcomes remained stable, such as cognitive development, visual acuity, hearing capacity and sleep apnea. About safety, mild adverse reactions of hypersensitivity such as urticaria and pyrexia have been reported. Conclusion: Methodological limitations made it impossible to analyze the effectiveness of the treatment. However, the study findings indicate that enzyme replacement therapy has a positive effect on most disease associated outcomes. Therefore, further studies should be fomented to improve the quality of the evidence.

Os linfócitos humanos apresentam na sua superfície a enzima NTPDase1 (ecto-apirase, ecto-difosfoidrolase; CD39; EC 3.6.1.5), responsável pela hidrólise do ATP e ADP extracelular e/ou outros nucleotídeos di ou tri fosfatados. A determinação da atividade da enzima foi padronizada através de método colorimétrico, o qual quantifica o fosfato livre liberado durante a reação. A NTPDase1 foi caracterizada através da demonstração de condições ótimas de incubação, como dependência de cálcio, pH, tempo de incubação e temperatura ótimos, além da obtenção de parâmetros cinéticos. Os resultados obtidos foram confirmados por uma baixa expressão de CD39 nos linfócitos humanos, verificada por análise citométrica, com utilização de anticorpo monoclonal correspondente. Este fato indica um baixo estado de ativação dos linfócitos, uma vez que o CD39 é considerado um marcador de ativação destas células. Posteriormente, foi determinada a atividade da NTPDase1 em linfócitos de pacientes imunodeprimidos pela infecção causada pelo HIV, os quais são acompanhados pelo monitoramento de sua carga viral no plasma e contagem de células T CD4+. A infecção pelo HIV resulta em alterações nas células imunes e na secreção de citocinas importantes na resposta patógenos. Nesta situação pode haver alterações bioquímicas na resposta imune, como por exemplo, alterações na hidrólise de nucleotídeos, ou seja, na atividade das enzimas que degradam nucleotídeos extracelulares. Os linfócitos encontram-se em estado de ativação crônica, o que faz com que até mesmo células não-infectadas pelo vírus, possam sofrer apoptose por ativação de caspases efetoras. Através da determinação da atividade da NTPDase nos linfócitos imunodeprimidos, verificou-se um aumento de sua atividade, acompanhado por uma maior expressão de CD39 na superfície destas células. Estes resultados sugerem que a NTPDase1 é importante para a manutenção da resposta imune, mantendo concentrações adequadas de ATP extracelular, o qual é essencial para certas funções imunes, mas também pode ser prejudicial no momento que induz apoptose nos linfócitos, o que poderia aumentar o estado de imunodepressão. Devido ao fato de que muitos dos pacientes HIV-positivos recebem terapia anti-retroviral, foi necessário verificar in vitro possíveis efeitos destas drogas sobre a atividade da NTPDase1. Neste caso, observou-se que as concentrações terapêuticas destas drogas não afetaram a atividade da enzima. Sendo assim, a atividade aumentada da NTPDase1 nestes pacientes, não é devida à interferência da terapia anti-retroviral.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-08-16T20:24:05Z No. of bitstreams: 1 2016_ClêniadosSantosAzevedo.pdf: 3228575 bytes, checksum: 52c4b5bc7aca2ec9b7980c243056f4d3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-05T22:01:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_ClêniadosSantosAzevedo.pdf: 3228575 bytes, checksum: 52c4b5bc7aca2ec9b7980c243056f4d3 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-05T22:01:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_ClêniadosSantosAzevedo.pdf: 3228575 bytes, checksum: 52c4b5bc7aca2ec9b7980c243056f4d3 (MD5) / Enzimas deubiquitinantes (DUBs) desempenham um papel importante na regulação da degradação de proteínas e de outros processos não-degradativos, por desconjugação de ubiquitina (Ub) de proteínas marcadas, como a modulação da resposta imune, a sinalização da quebra da dupla fita do DNA e endocitose. Explorar o papel de deubiquitinação em Leishmania infantum demonstra uma alternativa promissora para procurar novos alvos terapêuticos para a leishmaniose, já que a quimioterapia utilizada é onerosa, tóxica e tende a ser ineficiente. Este estudo teve como objetivo o estabelecimento de duas linhagem de L. infantum expressando uma cópia extra de otubaína (OtuLi), caracterização da atividade enzimática e funcional da OtuLi recombinante produzida em E. coli (rOtuLi). Com relação ao estabelecimento das linhagens, o gene otuli foi amplificado, clonado no vetor pLEXSY-hyg2 e linearizado. Os promastigotas de L. infantum foram transfectados com os cassetes e selecionados. A integração dos cassetes ao locus gênico da 18S rRNA foi confirmada por PCR e a expressão da OtuLi fusionada ao peptídeo FLAG ou a cauda de 6 histidinas foi verificada por western blot. A citolocalização da FLAG-OtuLi indica que a enzima encontra-se em pequenas vesículas no citoplasma da célula com fortes marcações perto da região do cinetoplasto, corroborando o resultado visto utilizando anticorpos específicos para a OtuLi. A OtuLi não co-localiza com a mitocôndria marcada por duas sondas diferentes e com o retículo endoplasmático imunomarcado pela Proteína Dissulfato Isomerase em promastigotas. A rOtuLi apresentou atividade em pH ácido com substrato de tetra-ubiquitina ligado pela lisina 48 e o perfil de inibição indica que os inibidores NEM e Ub-aldeído são capazes de inibi-la. Através de mutações sítio-dirigidas realizadas na OtuLi, foi observado que tanto os resíduos próximos ao sítio catalítico quanto aqueles envolvidos na interação com a ubiquitina ocasionaram mudanças estruturais, conforme dinâmica molecular, resultando na redução ou perda da atividade da enzima. A rOtuLi foi capaz de estimular a formação de corpúsculos lipídicos em macrófagos peritoniais e induzir a secreção de IL-6 e TNF-α, citocinas pró-inflamatórias. O estabelecimento das linhagens com a cópia extra de otuli representa o primeiro passo para futura identificação de proteínas capazes de interagir com a OtuLi e assim, elucidar seu mecanismo de ação no parasito. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Deubiquitylating enzymes (DUBs) play an important role in regulating protein degradation and other non-degradative processes, by deconjugation of ubiquitin (Ub) from marker proteins, such as immune response modulation, signalling of double strand breaks at DNA and endocytosis. Exploring the role of deubiquitination in Leishmania infantum demonstrates a promising alternative to search for new therapeutic targets for leishmaniasis, since its primary chemotherapy is expensive, toxic and tending to be inefficient. This study aimed to establish two L. infantum strains expressing an extra copy of otubain (OtuLi), characterization of enzymatic and functional activity of recombinant OtuLi (rOtuLi). Regarding the establishment of the strains, the otuli gene was amplified, cloned in pLEXSY-hyg2 and the vector was linearized. The promastigotes of L. infantum were transfected with the cassette and selected. The integration of the cassettes into the 18S rRNA gene locus was confirmed by PCR and the expression of OtuLi fused to the FLAG peptide or to a 6 histidine tail was accessed by western blot. The citolocalization of FLAG-OtuLi indicates that the enzyme is in small vesicles in the cytoplasm of the cell with strong markings near the kinetoplast region, confirming the results seen using antibodies specific for OtuLi. The OtuLi is not co-located with the mitochondria marked by two different probes and with the endoplasmic reticulum immunolabeled by protein disulfide-isomerase. The rOtuLi showed activity at acid pH with lysine 48-linked tetra-ubiquitin substrate and the inhibition profile indicates that NEM and Ub-aldehyde inhibitors are able to inhibit it. Through site-directed mutations in OtuLi, it was observed that the residues near the catalytic site or those involved in the interaction with the ubiquitin caused structural changes as shown by molecular dynamics, resulting in a reduction or loss of enzyme activity. The rOtuLi was able to stimulate the formation of lipid body in peritoneal macrophages and to induce the secretion of IL-6 and TNF-α, pro-inflammatory cytokines. The establishment of these strains with the extra copy of otuli is the first step for future identification of proteins that interact with OtuLi and thus elucidate its mechanism of action in the parasite.

Orientador : Dr. Carlos Ricardo Soccol / Co-orientador : Dra. Juliana Degenhardt-Goldbach / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Defesa: Curitiba, 23/02/2016 / Inclui referências : f.43-48;70-75;98-103 / Área de concentração: Saúde humana e animal / Resumo: Este trabalho teve por objetivos desenvolver um protocolo de regeneração por organogênese indireta e um protocolo de transformação genética para o clone BRS07-01 de E. urophylla, além de identificar e caraterizar uma bactéria endofítica isolada deste clone e avaliar sua interação com a Agrobacterium tumefaciens. Com relação a organogênese, a melhor taxa de regeneração (85.6%) foi observada quando os explantes foram primeiramente cultivados em meio de indução de calos WPM suplementado com 0.5 ?M de TDZ e 0.5 ?M de ANA e em seguida transferidos para o meio de indução de brotos com 5.0 ?M de BAP e 1.0 ?M de ANA. Após a regeneração dos brotos, a melhor taxa de enraizamento (84.0%) foi obtida em meio suplementado com 14.7 ?M de IBA. Com base na avaliação de 56 marcadores RAPD não foi observada variação somaclonal durante as fases da organogênese. Dois agentes seletivos foram testados para aumentar a eficiência de seleção, canamicina e geneticina, e a concentração mínima de 50 mgL-1 de canamicina foi selecionada para a transformação genética. Para o desenvolvimento de protocolo de transformação genética, vários fatores foram avaliados como dias de pré e co-cultivo, presença de Acetosyringona (AS), concentrações de agentes seletivos, tipo de explantes e tempo de sonificação. Quando usado o explante foliar, a maior eficiência de transformação genética (TE) foi de 2.67%, utilizando 50 ?M de AS no co-cultivo líquido e 100 ?M de AS no co-cultivo sólido. Entretanto, a maior TE de 20.83% foi observada com brotações como explantes submetidos a 2 min de sonificação e co-cultivados com 100 ?M de AS e selecionados em meio com 150 mgL-1 de Canamicina. Durante os experimentos, observamos a presença de bactérias endofíticas. Após isoladas, com base na análise filogenética, dois isolados foram identificados como Stenotrophomonas maltophilia, uma bactéria gramnegativa com sensibilidade a diferentes antibiótiocos, capaz de formar biofilme e sintetizar a auxina ácido indol-acético, que pode estar interferindo no processo e nos resultados de transformação genética. Palavras-chave: Agrobacterium tumefaciens, organogênese indireta, acetosseringona, GUS, nptII, Stenotrophomonas maltophilia / Abstract: This work aimed to develop an indirect organogenesis and a genetic transformation protocol for clone BRS07-01 of E. urophylla, as well as to isolate and characterize endophytic bacteria from this clone, which could be interfering in the Agrobacterium tumefaciens infection process during transformation of the clone. Regarding the organogenesis, the results showed that higher regeneration rate (85.6%) was observed when the leaves explants were first cultured on callus induction medium WPM supplemented with 0.5 ?M of TDZ and 0.5 ?M of NAA and then transferred to the shot induction medium with 5.0 ?M of BAP and 1.0 ?M NAA. The best adventitious root formation (80.0%) was observed when plantlets were cultured on medium supplemented with 14.7 ?M IBA. Based on 56 RAPD molecular markers we did not observe somaclonal variation during the organogenesis process. Two selective agents, kanamycin and geneticin, were tested to determine the best antibiotic and concentration for genetic transformation. Kanamycin at 50 mgL-1 showed to be the most effective. For genetic transformation, several factors were evaluated, as days on pre and co-culture, Acetosyringone (AS), concentrations of selective agents, explants type and sonication time. For leaf explants, higher transformation efficiency (TE) was 2.67% when the medium was supplemented with 50 ?M of AS on liquid co-culture and 100 ?M of AS on solid co-culture. However, the highest TE (20.83%) was observed when with microshoots were used as explants and they were submitted to 2 min of sonication, co-cultured with 100 ?M of AS and selected on medium with 150 mgL-1 of Kanamycin. Two isolates endophytic bacteria could be isolated and characterized as Stenotrophomonas maltophilia. This gramnegative bacteria, showed sensibility to different antibiotics and was able to form biofilm and synthetize the auxin indolacetic acid. For these reasons, we suggest that this endophytic can somehow be interfering in the genetic transformation of the BRS07-01 clone. Index terms: Agrobacterium tumefaciens, indirect organogenesis, Acetosyringone, GUS, nptII, Stenotrophomonas maltophilia