Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:52:18Z No. of bitstreams: 1 2010_FelixGoncalvesSiqueira.pdf: 10129033 bytes, checksum: fa562cbd8a4ce2f241200fa978674cb8 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:53:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_FelixGoncalvesSiqueira.pdf: 10129033 bytes, checksum: fa562cbd8a4ce2f241200fa978674cb8 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-16T23:53:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_FelixGoncalvesSiqueira.pdf: 10129033 bytes, checksum: fa562cbd8a4ce2f241200fa978674cb8 (MD5) / A complexidade e heterogeneidade das estruturas de holoceluloses de diferentes resíduos agrícolas requerem a ação sinérgica de enzimas para a sua completa hidrólise, envolvendo: celulase, hemicelulase e poligalacturonase. Os fungos filamentosos, Penicillium corylophilum, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Aspergillus awamori, Emericella nidulans, Acrophialophora nainiana, Pleurotus ostreatus, Agaricus brasiliensis e Trichoderma reesei, produzem holocelulases, quando cultivados em meios líquidos e sólidos tendo como fonte de carbono diferentes materiais lignocelulósicos, tais como engaço de bananeira, bagaço de cana-deaçúcar, resíduos do beneficiamento de algodão, resíduos da colheita de milho, entre outros. A purificação parcial em cromatografia de filtração em gel Sephacryl-200 do extrato bruto de P. corylophilum crescido piolho-de-algodão-sujo em meio líquido mostrou um pico de atividade de xilanase com 0,340 UI.mL-1. O extrato bruto de A. flavus crescido em engaço de bananeira apresentou atividades relevantes para xilanase, poligacturonase, porém teve atividade de endoglucase cinco vezes menor que o T. reesei RUT C-30. O fracionamento do extrato bruto do A. flavus (engaço de bananeira) foi realizado por membranas de ultrafiltração (PM: 300, 100, 50 e 30), mostrando multiplicidade de endoglucanase e poligacturonase. Os extratos brutos dos cultivos de A. flavus foram submetidos a um processo de purificação (ultrafiltração, cromatografia de filtração em gel e troca iônica), destacando na produção de xilanase e pectinase. O extrato bruto de A. flavus crescido em engaço de bananeira mostrou no processo têxtil de biopurga resultados semelhantes aos apresentados pelos extratos enzimáticos comerciais Denimax Acid L e Viscozyme. No entanto os processos têxteis de biopolimento e bioestonagem tiveram baixo rendimento, provavelmente em função do manchamento causado pelos pigmentos do extrato bruto e pouca atividade de endoglicanase. A. oryzae, A. terreus e E. nidulans foram isolados de compostagem natural de resíduos do rebeneficiamento de algodão, os quais apresentaram atividades relevantes de holocelulases quando crescidos em engaço de bananeira e piolho-de-algodão-sujo. A cromatografia de filtração em gel S-400 do concentrado em PM 300 do extrato bruto de E. nidulans crescido em piolho-de-algodão mostrou para atividade de 0,509 UI.mL-1 para arabinofuranosidase, como também dois picos de xilanase que foram revelados por meio de zimograma. Os cultivos de A. brasiliensis CS1, P. ostreatus H1 e A. flavus apresentaram atividades de holocelulases relevantes quando cultivados em meio sólido, nas seguintes fontes de carbono: resíduos da colheita de milho, bagaço de cana-de-açúcar e engaço de bananeira. A. oryzae, A. terreus e E. nidulans apresentaram atividades de holocelulases usando fontes de carbono lignocelulósica em cultivo líquido ou sólido, apresentando efeito de temperatura (40 a 65C) e pH diversificado (ácido, neutro e alcalino), dependendo do fungo, tipo de substrato e forma de cultivo. O perfil proteômico desses fungos variou quanto ao tipo de substrato usado como fonte de carbono, presença ou não da enzima PNGase F no gel uni e bidimensional. O fitofissionoma cerradão-floresta mostrou uma diversidade de fungos filamentosos do solo, serrapilheira ou troncos em decomposição, quando isolados em meios de cultura e temperaturas diferentes. O uso de lacases e poli-etileno-glicol 4000 junto com enzimas comerciais em hidrólise enzimática de resíduos da colheita de milho (corn stover) após o pré-tratamento deste material lignocelulósico (Liquid Hot Water – LHW) mostrou um rendimento de 20% a mais quando comparado com a mesma condição sem a presença desses aditivos. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The complexity and heterogeneity of structures of holocellulose from different agricultural residues demand the synergistic action of enzymes for complete hydrolysis involving cellulase, hemicellulase and polygalacturonase. The filamentous fungi Penicillium corylophilum, Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Aspergillus awamori, Emericella nidulans, Acrophialophora nainiana, Pleurotus ostreatus, Agaricus brasiliensis and Trichoderma reesei produce holocellulases when grown on liquid and solid media containing as carbon source different lignocellulosic materials such as banana stem, sugarcane bagasse, cotton residues, and corn stover, among others. Partial purification by gel filtration chromatography on Sephacryl-200 of crude extract of P. corylophilum grown on dirty cotton residue and liquid medium showed a peak of xylanase activity with 0.340 UI.mL-1. The crude extract of A. flavus grown on banana stem showed relevant activities of xylanase and polygacturonase, although displayed an endoglucase activity five times smaller than observed from T. reesei RUT C-30. The fractionation of the crude extract of A. flavus (banana stem) was performed using ultrafiltration membranes (PM: 300, 100, 50 and 30), showing the multiplicity of endoglucanase and xylanase. Culture extracts of A. flavus underwent a process of purification (ultrafiltration, chromatography, gel filtration and ion exchange), especially in the production of xylanase and polygalacturonase. In the process of textile bioscouring, the crude extract of A. flavus grown on banana stem showed results similar to those observed with commercial enzyme extracts Denimax Acid L and Viscozyme. However, the processes of textile biostoning and biopolishing had only a low yield, probably as a result of staining by pigments. A. oryzae, A. terreus, and E. nidulans were isolated from natural waste compost-based re-beneficiation of cotton, and showed relevant activities of holocellulase when grown on banana stem and dirtycotton residue. Gel filtration chromatography in Sephacryl-400 of the crude extract of E. nidulans grown in dirty-cotton showed an arabinofuranosidase activity of 0.509 UI.mL-1, as well as two peaks of xylanase that were revealed by zymogram analysis. Cultures of A. brasiliensis CS1, P. ostreatus H1 and A. flavus showed relevant holocellulase activities when grown on solid medium containing corn crop residues, sugarcane bagasse and banana stem as carbon sources. A. oryzae, A. terreus, and E. nidulans showed holocellulase activities over varied temperatures (40-65C) and pH (acid, neutral and alkaline), depending on the substrate type and cultivation form. The proteomic profile in two dimensional gels of these fungi depended of the type of substrate used as carbon source, and the presence or absence of the enzyme PNGase F. The savanna forest phytofisionomy showed a diversity of filamentous fungi from soil, litter or decaying logs, when isolated in culture media and different temperatures. The use of laccases and poly-ethylene glycol 4000 together with commercial enzymes in the enzymatic hydrolysis of corn stover after pretreatment of lignocellulose (Liquid Hot Water - LHW) showed an increased yield of 20% when compared with the same condition without the presence of these additives.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As pesquisas acerca de fontes alternativas de combustÃveis tem se concentrado principalmente na biomassa composta de celulose, hemicelulose e lignina. Os carboidratos estruturais contidos na matriz celulÃsica representam o substrato que pode ser utilizado para produÃÃo de biocombustÃveis por processos fermentativos. A opÃÃo pela hidrÃlise enzimÃtica de biomassa vegetal, utilizando celulases, pode gerar uma opÃÃo de menor impacto ambiental frente a outros processos de hidrÃlise. Estudos sobre novas fontes microbianas e, anÃlises mais acuradas das etapas que compÃem a produÃÃo de celulases sÃo essenciais como estratÃgias para diminuir os custos gerados pelo uso de celulases nos processos de obtenÃÃo de aÃÃcares fermentescÃveis. Portanto, este trabalho tem como objetivo a seleÃÃo de fungos filamentosos, produtores de enzimas do complexo celulolÃtico, assim como a investigaÃÃo dos parÃmetros que envolvem a produÃÃo de celulases atravÃs do processo de fermentaÃÃo submersa. Em uma etapa inicial foram selecionados os micro-organismos por metodologia em placas, onde se averiguou o potencial celulolÃtico atravÃs do Ãndice enzimÃtico em meio especÃfico. Foram selecionadas as linhagens que atingiram um diÃmetro de crescimento de colÃnia de 150 mm, em placas de Petri, em menor tempo de incubaÃÃo (48 horas). Da etapa de seleÃÃo inicial, foram escolhidos os micro-organismos com maior potencial enzimÃtico que foram entÃo submetidos aos testes em fermentaÃÃo submersa. O primeiro teste consistiu em selecionar os micro-organismos como melhores produtores de celulases totais (FPase) em erlenmeyer nÃo aletados contendo 100 mL de meio de cultura especÃfico. O teste subsequente analisou as trÃs melhores linhagens da etapa anterior, que foram entÃo submetidos à fermentaÃÃo submersa em frascos contendo aletas. A etapa seguinte teve o intuito de investigar a produÃÃo enzimÃtica em fermentaÃÃo com quatro tipos de aÃÃcares solÃveis: glicose, lactose, sacarose e xilose. A linhagem fÃngica selecionada nas etapas anteriores foi utilizada nos testes em biorreator, onde foram analisados trÃs diferentes estratÃgias de inoculaÃÃo. Dentre os fungos analisados na etapa inicial, destacaram-se as linhagens Fusarium sp. SAP 09, Lasiodiplodia theobromae CNPAT 040, Trichoderma sp. LCB 79, Trichoderma, sp. INPA 666, Trichoderma sp. INPA 1014 e Trichoderma sp. INPA 1218. Na etapa de seleÃÃo por fermentaÃÃo submersa em frascos nÃo aletados, a melhor atividade de FPase foi apresentada pela linhagem Trichoderma sp. INPA 666 (48,0 FPU/L) e CMCase pelo fungo Lasiodiplodia theobromae CNPAT 040 (350,0 U/L). Na comparaÃÃo com erlenmeyers aletados, houve uma maior produÃÃo tanto de FPase quanto de CMCase em frascos sem a presenÃa de aletas, apontando que as forÃas de cisalhamento aplicadas nas culturas fÃngicas possivelmente foram deletÃrias para a produÃÃo enzimÃtica. O uso de sacarose mostrou-se ser a melhor opÃÃo dentre os aÃÃcares solÃveis testados, apresentando os maiores valores de atividade de FPase (49,9 FPU/L) e CMCase (119,7 U/L). A melhor estratÃgia de inoculaÃÃo para o biorreator foi uma suspensÃo de esporos obtidos a partir de uma fermentaÃÃo semi-sÃlida de farelo de trigo, no tempo de 72 horas de fermentaÃÃo. / The research about alternative sources of fuels has been mainly focused on biomass composed of cellulose, hemicellulose and lignin. The structural carbohydrates contained in the cellulosic matrix represent the substrate that can be used for biofuel production by fermentative processes. The choice of the biomass enzymatic hydrolysis of plants using cellulases, can generate an option less environmental impact compared to other processes of hydrolysis. Studies about microbial new sources, and more accurate analysis of the steps that make up the production of cellulases are essential as a strategy to reduce the costs generated by the use of cellulases in the process of obtaining fermentable sugars. This study aims at the selection of filamentous fungi producers of cellulolytic enzymes, as well as investigating the parameters of cellulase production by submerged fermentation process. In the initial stage were selected micro-organisms by methodology in plates. Was investigated the potential cellulolytic enzyme through the index in a specific medium and were selected strains that reached a diameter of colony growth of 150 mm in Petri dishes in a shorter time of incubation (48 hours). Were selected micro-organisms with the greatest potential enzymatic tests that were then tested in submerged fermentation. The first test consisted in selecting the best microorganisms as producers of FPase in non-baffled flask containing 100 mL of culture medium specific. In the subsequent test were examined the three best strains from the previous step, which were then subjected to submerged fermentation in baffled flasks. The next step was designed to investigate the enzyme production in fermentation with four types of soluble sugars: glucose, lactose, sucrose and xylose. The fungal strain was selected in the previous steps used in the tests in a bioreactor, which analyzed three different strategies of inoculation. The strains Fusarium sp. SAP 09, Lasiodiplodia theobromae CNPAT 040, Trichoderma sp. LCB 79, Trichoderma sp. INPA 666, Trichoderma sp. INPA 1014 and Trichoderma sp. INPA 1218 were selected from the first stage. In the selection stage by submerged fermentation in non-baffled flasks, the best FPase activity was achieved by the strain Trichoderma sp. INPA 666 (48.0 FPU /L) and CMCase by the fungus Lasiodiplodia theobromae CNPAT 040 (350.0 U /L). In comparison with baffled flasks, there was a greater production both FPase and CMCase in Erlenmeyer without baffles, indicating that the shear forces applied to the fungal cultures were potentially harmful for enzyme production. The use of sucrose proved to be the best option among soluble sugars tested, with higher rates of FPase activity (49.9 FPU / L) and CMCase (119.7 U / L). The best strategy for the inoculation was a spore suspension obtained from a solid state fermentation of wheat bran, in the time of 72 hours of fermentation.

Os volumes da produÃÃo de leite estÃo crescendo a uma taxa mÃdia de 2% ao ano em todo o mundo. Este aumento da quantidade de leite està sendo canalizado para a produÃÃo de queijo, caseÃna, caseinato e outros produtos lÃcteos, resultando no aumento do volume de soro de leite. Ele representa cerca de 85-95% do volume do leite e retÃm cerca de 55% de seus nutrientes, no entanto, seu alto poder poluente levou ÃrgÃos ambientais e outras autoridades reguladoras a proibir o descarte do soro de leite nÃo tratado no ambiente. A partir de estudos sobre os componentes do soro de leite e a descoberta das propriedades tecnolÃgicas e funcionais de suas proteÃnas, a visÃo de resÃduo poluidor mudou, sendo hoje, considerado um co-produto da produÃÃo de queijo. Um dos processos que promove a melhoria de suas propriedades consiste na hidrÃlise protÃica. Este tratamento pode ser realizado pelo emprego de Ãcidos, bases ou enzimas, contudo, a hidrÃlise enzimÃtica apresenta diversas vantagens sobre a quÃmica, como a especificidade, o controle do grau de hidrÃlise (GH), as condiÃÃes moderadas do processo e a formaÃÃo mÃnima de subprodutos. O objetivo deste trabalho foi promover a hidrÃlise das proteÃnas do soro de leite, atravÃs da aÃÃo de proteases sintetizadas pelo Aspergillus oryzae IV e a secagem deste por atomizaÃÃo. Avaliou-se o efeito da temperatura e tempo de incubaÃÃo, relaÃÃo enzima:substrato (E:S), e posteriormente do pH. Determinou-se os parÃmetros que permitiram maior grau de hidrÃlise. A faixa de temperatura de incubaÃÃo estudada foi entre 30 e 50 ÂC, a relaÃÃo E:S variou nas proporÃÃes de 0,5:100 a 3,0:100. A melhor condiÃÃo de hidrÃlise (GH = 70%) obtida à 50 ÂC por 12 horas, empregando a relaÃÃo E:S de 2,0:100. Avaliou-se a influÃncia da hidrÃlise no perfil peptÃdico realizando uma anÃlise eletroforÃtica, em que confirmou-se a necessidade de estudar a hidrÃlise em diferentes valores de pH. Desta forma o pH do soro de leite foi ajustado entre 4,0 e 8,0 antes da reaÃÃo para avaliar a influÃncia deste parÃmetro sobre o grau de hidrÃlise. A amostra hidrolisada foi concentrada atà um teor de sÃlidos entre 14 e 28 ÂBRIX antes do processo de atomizaÃÃo. NÃo houve diferenÃa significativa entre as amostras atomizados avaliados quanto ao rendimento, umidade e atividade de Ãgua. AtravÃs da anÃlise eletroforÃtica, a partir dos gÃis corados em soluÃÃo de prata, foi possÃvel confirmar a aÃÃo das proteases sobre proteÃnas de diversos pesos moleculares com exceÃÃo a β-lactoglobulina. / Worldwide milk production is growing at a average rate of 2% per year. This increased amount of milk has been related to the production of larger volumes of cheese, casein, caseinate and other milk products, resulting in increased volume of whey. It represents about 85-95% of milk volume and retains about 55% of its nutrients, however, its high power pollutant led environmental bodies and other regulatory authorities to prohibit the discharge of whey into the environment untreated. From studies about whey components and with the discovery of technological and nutritional properties the status of polluter waste changed, then, nowadays, whey is considered a co-product of cheese production. One processes that promote improvement of whey properties is protein hydrolysis, characterized by the disruption of bonds of molecules protein chains releasing different sizes peptides and free amino acids. The hydrolytic treatment can be done by acids, bases or enzymes, however, enzymatic hydrolysis show many advantages in relation to chemical processes, as specificity, control of hydrolysis degree, the moderated conditions of the process and minimal formation of residual products. The objective of this study was to promote whey protein hydrolysis through the action of proteases synthesized by Aspergillus oryzae IV and spray drying this product. We evaluated the effect of temperature and time of incubation, enzyme: substrate ratio (E: S), and subsequently the pH. The parameters which have enabled higher degree of hydrolysis were determined. The temperature range studied was incubated between 30 and 50  C, the ratio E: S ranged in the proportions of 0,5:100 3,0:100. The best condition of hydrolysis (DH = 70%) was obtained at 50  C for 12 hours, employing the ratio E: S 2,0:100. An electrophoretic analysis was performed to obtain the hydrolysis influence on the peptide profile, in which confirmed the need to study the hydrolysis at different pH values. Thus, the whey pH was adjusted between 4.0 and 8.0. The hydrolyzed sample was concentrated to a solids content between 14 and 28 Brix before the atomization process. There was no significant difference regarding yield, moisture and water activity between the spray dried samples. Through the eletrophoretic analysis, from gels stained with silver solution, was possible to verify the action of proteases on proteins of different molecular weights with exception β-lactoglobulin.

Orientadores: Mirna Lúcia Gigante, Carolina Merheb Dini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-22T15:56:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_LaisdeSouza_M.pdf: 3863466 bytes, checksum: 898c248c98187c8e24cc306b374d7b13 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi comparar o efeito do coagulante microbiano sobre o rendimento, características físico-químicas, sensoriais e firmeza do queijo Prato durante a maturação. Os queijos foram fabricados a partir de leite tratado termicamente usando como coagulantes a protease do fungo Thermomucor indicae-seudaticae N31, e coagulante comercial de Rhizomucor sp. O experimento foi do tipo fatorial 2 x 6, em blocos completamente aleatorizados com três repetições. Os resultados foram avaliados por Análise de Variância (ANOVA) e teste de médias de Tukey ao nivel de 5% de significância. O leite, o soro e os queijos foram avaliados quanto à composição centesimal e rendimento. Os queijos foram analisados após 2, 9, 16, 30, 40 e 50 dias de armazenamento com relação ao pH, acidez, umidade, proteólise, firmeza e degradação das frações de caseína por eletroforese em gel. A aceitação sensorial dos queijos foi realizada após 26 dias de fabricação. Os diferentes coagulantes não afetaram a composição dos queijos que apresentou, em média, 42,68% ± 1,87 de umidade, 28,58% ± 1,06 de gordura e 1,91% ± 0,021 de sal, conforme o esperado para queijo Prato. A recuperação de proteína e gordura e o rendimento dos queijos não foram afetados pelos diferentes coagulantes. Ambos os queijos apresentaram boa aceitação sensorial e apresentaram nota média para a aceitação global de 7,1 ± 0,05. Durante a maturação, a proteólise aumentou de maneira similar para ambos os queijos e houve redução de firmeza. A eletroforese em gel de ureia mostrou que o perfil de hidrólise proteica dos queijos foi muito semelhante. O conjunto de dados mostra que a nova protease apresentou comportamento similar à enzima comercial, sugerindo o potencial tecnológico da enzima do Thermomucor indicae-seudaticae N31 como agente coagulante para a fabricação de queijo Prato / Abstract: The aim of this study was to compare the effect of the microbial coagulant on Prato cheese yield and on the development of its physico-chemical, sensory and firmness characteristics during ripening. Cheeses were manufactured using the following coagulants: laboratory obtained protease, from the fungus Thermomucor indicae-seudaticae N31 and commercial coagulant from Rhizomucor sp. A 2 x 6 factorial design with 3 replications was performed and the results were evaluated by ANOVA and mean values were compared by Tukey¿s test at a 5% significance level. Milk, whey and cheese composition were evaluated and cheese yield was calculated. Cheeses were monitored after 2, 9, 16, 30, 40 and 50 days of storage regarding pH, acidity, moisture, proteolysis, firmness and degradation of casein fractions by gel electrophoresis. Sensory acceptance was evaluated after 26 days of manufacture. The different coagulants did not affect cheese composition, which exhibited average content of 42.68% ± 1.87 for moisture, 28.58% ± 1.06 for fat and 1.91% ± 0.02 for salt, as expected for Prato cheese. Protein and fat recovery and cheese yield were not affected by the coagulants as well. Both cheeses presented good sensory acceptance with overall liking scores of 7.1 ± 0.05 representing the `like moderately¿ category. For both cheeses, proteolysis increased and firmness decreased throughout ripening. Urea-PAGE showed that the protein hydrolysis profile was very similar. The gathered data suggest that ripening developed in the same way for both cheeses suggesting the technological potential of protease from Thermomucor indicae-seudaticae N31 as milk clotting agent for Prato cheese manufacture / Mestrado / Tecnologia de Alimentos / Mestra em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Heloiza Ferreira Alves Prado / Banca: Maria de Lourdes Texeira de Moraes Polizeli / Banca: Paulo Cezar Ceresini / Resumo: Cento e quarenta e oito linhagens fúngicas, mesofílicas e termofílicas, foram isoladas de amostras de solo e de matéria orgânica em decomposição de áreas de Cerrado no estado do Mato Grosso Sul. Essas linhagens tiveram suas capacidades de crescimento a 35 ºC e 45 °C analisadas em meios contendo palha de milho como fonte de carbono. Sessenta e seis fungos, com crescimento a 45 ºC foram selecionados para testes de produção enzimática. A maioria das linhagens isoladas produziram xilanase e celulases (avicelase e CMCase) por fermentação em estado sólido (FES), inicialmente utilizando o farelo de trigo como substrato. Posteriormente, foram realizados os estudos do efeito da fonte de carbono e do perfil de produção de enzimas, utilizando diferentes substratos como: farelo de trigo, bagaço de cana-de-açúcar, serragem, sabugo de milho e com misturas destes na proporção de 1:1. A produção mais elevada de CMCase, 18 U/g, foi obtida pelo fungo Penicillium sp 1IP4-A2, em farelo de trigo, após 48 horas de cultivo. As maiores produções de avicelase 13,1 U/g, e xilanase, 370 U/g, foram obtidas pelo fungo Aspergillus sp 1IP2B1, quando cultivado em farelo de trigo e sabugo de milho, após 24 horas e 96 horas de cultivo, respectivamente. A xilanase referida acima, produzida pelo fungo Aspergillus sp 1IP2B1, apresentou atividade máxima em 55 ºC com pH de 5,5 e se manteve estável até 55 °C / Abstract: One hundred forty-eight mesophilic and thermophilic fungal strains were isolated from samples of soil and decomposing organic matter from Cerrado in the state of Mato Grosso do Sul. These strains have had their capacity for growth at 35 °C and 45 °C analyzed in culture medium containing corn straw as the carbon source. Sixty-six fungi, growing at 45 °C, were selected for enzyme production testing. The most of the isolated strains produced xylanase and cellulase (CMCase and avicelase) by solid state fermentation (SSF), initially using wheat bran as substrate. Subsequently, studies of the effect of carbon source and enzyme production profile were performed using different substrates: wheat bran, sugar cane bagasse, sawdust, corn cobs and mixtures in a 1:1 ratio. The highest CMCase production, 18 U/g, was produced by fungi Penicillium sp 1IP4-A2 in wheat bran, after 48 hours of cultivation. The highest avicelase production, 13.1 U/g, and xylanase, 370 U/g, were obtained by fungi Aspergillus sp 1IP2B1, in wheat bran and corn cob, after 24 hours and 96 hours of culture on solid fermentation, respectively. The xylanase produced by fungi Aspergillus sp 1IP2B1 showed maximum activity at 55 °C at pH 5.5 and it was stable up to 55 °C / Mestre

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Márcia Luzia Rizzatto / Banca: Tatiane Iembo / Resumo: Os resíduos agroindustriais compostos por, em sua maior parte, lignocelulose, podem ser desestruturados em monômeros de açúcares e derivados fenólicos que, por sua vez, podem ser convertidos em bioprodutos com valor agregado como etanol de segunda geração, ácidos orgânicos, aditivos para alimentos, entre outros. O processo de desestruturação da lignocelulose envolve, geralmente, um tratamento químico e/ou físico, seguido de sacarificação enzimática, que requer um coquetel multi-enzimático composto por celulases, hemicelulases, ligninases e enzimas acessórias, como as oxidases e pectinases. Estas últimas, além de aumentar a eficiência das primeiras, com consequente aumento no rendimento, aumentam também a velocidade do processo, devido à degradação da pectina da parede celular vegetal. Considerando que o grupo de pesquisa ao qual esse trabalho está vinculado tem desenvolvido pesquisas com as ligninases, celulases, hemicelulases e pectinases, este estudo teve por objetivo a produção, caracterização físico-química e a purificação parcial de pectinases produzidas pelo fungo termofílico Rasamsonia emersonii BC, e a avaliação do efeito dessas enzimas quando adicionadas ao coquetel enzimático produzido pelo fungo Myceliophthora thermophila JCP 1-4, composto por celulases e hemicelulases, sobre a hidrólise da palha de cana-deaçúcar. Os resultados mostraram que, utilizando-se a mistura de bagaço de laranja e de cana-de-açúcar como substrato para cultivo em estado sólido para produção... / Abstract: Agroindustrial wastes whose composition mainly lignocellulose can be deconstruted into sugar monomers and phenolic derivatives, which can be converted into added value bioproducts such as second generation ethanol, organic acids, additives for food and others. The process of destruction of lignocellulose usually involves a chemical and/or physical treatment, followed by enzymatic saccharification. This process requires a multi-enzymatic cocktail composed of cellulases, hemicellulases, ligninases and accessory enzymes, such as oxidases and pectinases. The addition of the pectinases increases the efficiency of the saccarification, resultin in the higher yield and speed of the process, due to the degradation of pectin from the plant cell wall. Considering that the research group to which this work is linked, has developed researches with ligninases, cellulases, hemicelluloses and pectinase, this study had the objective of the production, physicochemical characterization and partial purification of pectinases produced by the thermophilic fungus Rasamsonia emersonii BC and the evaluation of the effect of the addition of this enzyme to the enzymatic cocktail produced by the fungus Myceliophthora thermophila JCP 1-4 containing cellulases and hemicellulases, on the hydrolysis of sugarcane straw. The results showed that, using a mixture of orange and sugarcane bagasses as a substrate for fungus cultivation by solid-state fermentation, 471.05 U g-1 of pectinase activity (evaluated as ... / Mestre

Orientador: João Cláudio Thoméo / Banca: Maria Aparecida Mauro / Banca: Waldir Barros Fernandes Jr. / Resumo: Este trabalho avaliou cenários econômicos de produção de enzimas celulolíticas por fermentação em estado sólido em uma planta anexa à unidade sucroenergética convencional, a qual estaria inserida em um processo integrado de produção de etanol de segunda geração. O substrato para fermentação em estado sólido usado seria composto do bagaço de cana e o farelo de trigo, na proporção 7:3, com umidade de 75%. As enzimas seriam sintetizadas pelo fungo termófilo Myceliophtora thermophila I1D3, à temperatura de 45ºC em 96 horas. A avaliação técnico-econômica para produção das enzimas em escala industrial considera a disponibilidade de bagaço em diferentes cenários. A estimação dos principais indicadores econômicos do projeto (payback, Valor Presente Líquido - VPL, retorno sobre investimento - ROI e a taxa interna de retorno - TIR), indica que, para um valor médio de venda da enzima no mercado atual, o projeto apresenta viabilidade técnico-econômica em função da facilidade de integração e do tempo de retorno. Entretanto, indicadores como TIR e ROI apresentaram valores abaixo daqueles normalmente aceitos pelos investidores do setor sucroenergético. A análise de sensibilidade indicou forte influência da atividade enzimática sobre os indicadores econômicos, sendo este fator preponderante para a rentabilidade do projeto. Considerando o cenário aqui apresentado e a alternativa de aumentar a cogeração de energia elétrica com o excedente de bagaço, a produção de celulases por fermentação em estado sólido ainda se apresenta como a alternativa mais competitiva / Abstract: This study evaluated different scenarios of cellulases production throw the conception of an industrial plant integrated with sugarmill unit which is able to produce second generation ethanol. For that, it is considerate sugarcane bagasse and wheat bran as substrates on the 7:3 proportion, 75% moisture content, fungi thermophilic Myceliophtora I1D3, 45ºC and 96h of fermentation process. Technical and economic evaluation were performed according to different sugarcane bagasse availability. The main economic indicators of this project (payback, net present value-NPV, return on investment-ROI and rate return intern-IRR) were evaluated and the results indicated the feasibility of this biotechnological process. However, indicators such as IRR and ROI had values below those normally accepted by investors of the sugarcane industry. The sensibility analysis also indicated the enzymatic activity an important factor of rentability of this project. Considering the scenario presented here and the alternative of increasing electricity cogeneration bagasse surplus, the production of cellulases by solid state fermentation still presented as more competitive alternative / Mestre

Orientadores: Sérgio Marangoni, Saulo Luis da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-10-31T14:37:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GasparJunior_PascoalJose_D.pdf: 6862970 bytes, checksum: 60c120eb2e9159656d5c493ee05eca1a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A triagem de fungos produtores de holocelulases é uma estratégia para a obtenção de enzimas capazes de hidrolisar o material lignocelulósico da biomassa vegetal, contribuindo para aumentar a viabilidade da produção de etanol celulósico Este trabalho avaliou o potencial enzimático dos fungos Penicillium corylophilum e Penicillium simplicissimum com relação às enzimas (endoglicanase, exoglicanase, ?-glicosidase, FPase, xilanase, pectinase e mananase) sobre substratos lignocelulósicos e comerciais como fonte de carbono. Além disso, avaliou-se também a influência da adição de diferentes fontes orgânicas e inorgânicas de nitrogênio sobre a atividade enzimática. Os fungos foram cultivados em triplicata em meio líquido suplementar com 1% de substrato lignocelulósico como fonte de carbono, em pH 7,0. A inoculação foi feita por suspensão de esporos (108 esporos/mL). O cultivo foi feito sob agitação a 120 rpm, a 28°C e os filtrados resultantes em 12, 24, 72 e 120 horas foram utilizados como fontes enzimáticas pelo método do DNS (ácido-3,5- dinitrosalicílico) em triplicata. De todas as atividades enzimáticas analisadas nas fontes lignocelulósicas, a atividade de xilanase do P. simplicissimum sobre a linhaça foi a mais expressiva (3,87 e 3,97 UI/ml), cultivados em 72 e 120 horas, respectivamente, e selecionada para os testes de purificação proteica. A atividade xilanásica específica aumentou consideravelmente após os passos cromatográficos de gel filtração e troca iônica (CTI), sendo inicialmente 3x10-3 atv/ µg de proteína no liofilizado e 19,2 atv/ µg de proteína na fração proveniente da CTI. Nos testes de pH, observou-se que a atividade de xilanase foi maior em pH=4,0 e temperatura de 50°C. Com relação à adição de substratos comerciais, a celulose microcristalina e a xilana apresentaram os resultados mais expressivos da indução da produção de xilanase, sendo que a concentração de 0,5% de xilana mostrou a melhor atividade enzimática em ambos os fungos estudados. A xilose apresentou uma concentração indutora mínima de 0,04% que foi suficiente para aumentar a atividade de xilanase do P. simplicissimum. Com relação à suplementação de fontes de nitrogênio no meio de cultivo para a produção de holocelulases, a adição de (NH4)2SO4 e caseína é uma alternativa importante para a potencialização das atividades de pectinase e de endoglicanase respectivamente pois foram fontes de nitrogênio que proporcionaram um aumento da atividade enzimática em ambos os fungos estudados como também nas duas fontes de carbono testadas. As frações contendo xilanases após cromatografia de gel filtração seguida de fase reversa, após análises por espectrometria de massas apresentam relação massa/carga de 18831,26 Da. A utilização do resíduo lignocelulósico da linhaça, como fonte de carbono para o cultivo submerso do Penicillium simplicissimum é uma opção ecologicamente correta, exequível e de baixo custo para a produção de xilanases. Diversas aplicações biotecnológicas como a utilização na ração animal, na indústria do papel e no etanol de segunda geração, dentre outros, possibilitam um acréscimo substancial do valor agregado desse substrato, permitindo uma ampliação da utilização da linhaça, além do aproveitamento do óleo, sem aumentar a área plantada / Abstract: Screening for producing fungi holocelulases is a strategy for obtaining enzymes that hydrolyze the lignocellulosic material from plant biomass, helping to increase the viability of cellulosic ethanol production This study evaluated the enzymatic potential of Penicillium simplicissimum and Penicillium corylophilum regarding enzymes (endoglicanase, exoglicanase, ?-glucosidase, FPase, xylanase, pectinase and mannanase) for commercial and lignocellulosic substrates as a carbon source. Furthermore, it was also evaluated the influence of the addition of different organic and inorganic nitrogen sources on enzyme activity. The fungus was grown in triplicate in a liquid medium supplement with 1% lignocellulosic substrate as carbon source, pH 7.0. The inoculation was done by the spore suspension (108 spores/ml). The cultivation was done with stirring at 120 rpm at 28 °C and the resulting filtered in 12, 24, 72 and 120 hours were used as enzyme sources for DNS (acid-3,5- dinitrosalicilic) method in triplicates. All enzymatic activities analyzed in lignocellulosic sources, the xylanase activity of P. simplicissimum about flaxseed was greater (3.87 and 3.97 IU/ml), grown at 72 and 120 h of cultivation, respectively, and selected for testing for protein purification. The specific xylanase activity increased considerably after the chromatographic steps of gel filtration and ion exchange (CTI), initially 3x10-3 atv/ mg of protein in lyophilized and 19.2 atv/ mg of protein in the fraction from the CTI. In pH testing, it was noted that the xylanase activity was higher at pH 4.0 and 50 °C. With respect to the addition of commercial substrates, microcrystalline cellulose and xylan showed the most significant results of induction of xylanase production, and the concentration of 0.5% xylan showed the best enzyme activity in both fungi studied. The xylose showed a minimal inducing concentration of 0.04% which was sufficient to increase the activity of xylanase from P. simplicissimum. With respect to supplemental nitrogen sources in the culture medium for the production of holocelulases, the addition of (NH4)2SO4 and casein can be an important tool for the enhancement of pectinase and endoglicanase activities respectively as alternative nitrogen sources that were provided an increase in enzyme activity in both fungi studied as well as the two carbon sources tested. The use of lignocellulosic residue of flaxseed as a source of carbon for submerged cultivation of Penicillium simplicissimum is an environmentally friendly, feasible and cost effective for the production of xylanases option. The fractions containing xylanases after gel filtration chromatography followed by reverse fase after analysis by mass spectrometry are related mass/charge of 18831 26 Da. The use of lignocellulosic waste of flaxseed as a source of carbon for submerged cultivation of Penicillium simplicissimum is an environmentally friendly, feasible and cost effective for the production of xylanases option. Various biotechnological applications such as use in animal feed, in the paper industry and in second generation ethanol, among others, allow a substantial increase in the value of this substrate, allowing an expansion of the use of flaxseed, plus the use of oil, without increasing acreage / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

CAPES / As lipases microbianas têm destaque comercial por apresentarem elevada especificidade e estabilidade em suas reações, permitindo assim, que a indústria de lipases seja composta por diversos segmentos, englobando a indústria alimentícia, farmacêutica, têxtil, tratamento de efluentes e reutilização de resíduos agrícolas. No presente estudo os subprodutos farelo de soja e okara foram avaliados quanto aos aspectos físico-químicos e morfológicos e tais características sugerem seu uso potencial como substrato em fermentações sólidas para a produção de lipase extracelular. Buscando a produção de enzimas lipolíticas a partir destes substratos, foram avaliadas quatro cepas selvagens de fungos filamentosos através de fermentações no estado sólido. O farelo de soja foi a biomassa que demonstrou maior potencial como substrato para a produção de lipase sem suplementação nutricional do meio. O isolado fúngico S4 (Penicillium sp) apresentou o maior potencial lipolítico entre os fungos avaliados. Um delineamento composto central rotacional 23 demonstrou que os parâmetros de cultivo concentração de conídios e umidade são variáveis que influenciam a produção da enzima pelo fungo. O tempo de cultivo não demonstrou ter efeito significativo sobre a produção da lipase e maior produção de lipase (73,85 U.L-1) foi obtida quando usando inóculo na concentração de 105 esporos / mL e meio de cultivo com umidade de 54%. A lipase bruta demonstrou condições ótimas de atividade a 35 ºC em pH 8,0 e foi ativa na faixa de pH entre 6 e 11. Apresentou atividade relativa superior a 50% entre as temperaturas 20 ºC e 40 ºC (30 minutos de aquecimento) e manteve 50 % de sua atividade quando aquecida a 40 ºC por 60 minutos. Os íons Ca2+, K+, Cu2+ (2 mM) e I- apresentaram efeito ativador sobre a atividade lipolítica da enzima, diferentemente do íon Fe2+, que apresentou forte inibição. A enzima bruta foi sensível à presença dos solventes orgânicos acetona, DMSO, metanol e propanol e foi ativada pelo solvente hexano. / Microbial lipases gain great commercial prominence because they have high specificity and stability in their reactions, allowing the lipase industry to be composed of several segments, such as food, pharmaceutical, textile, wastewater treatment and reuse of agricultural waste. Seeking for the production of lipolytic enzymes from these substrates, four wild strains of filamentous fungi was assessed by solid state fermentations. The soybean meal biomass showed higher potential as substrate for lipase production without nutritional supplementation of medium. The fungal isolated S4 (Penicillium sp) had the highest lipolytic potential among the evaluated fungi. A rotational central composite design 23 demonstrated that culture parameters spore concentration and moisture are variables that affect enzyme production by the fungus. The cultivation time demonstrated no significant effect on lipase production and increased production of lipase (73,85 UL-1) was obtained when using inoculum at a concentration of 105 spores / mL and culture medium with 54% moisture. Crude lipase showed optimum conditions of activity at 35 ° C at pH 8.0 and it was active in the pH range between 6 and 11. Enzymatic extract showed relative activity of 50% among the temperature of 20 ° C and 40 ° C (30 minutes of heating) and kept 50% of its activity when heated at 40 ° C for 60 minutes. The ions Ca2+, K+, Cu2+ (2 mM) and I- showed activating effect on the lipolytic activity of the enzyme, unlike ion Fe2+, which showed strong inhibition. The crude enzyme was sensitive to the presence of organic solvents as acetone, DMSO, methanol, propanol and the enzyme was activated by the hexane solvent.

Orientador: Eleni Gomes / Banca: Mirna Helena Regali Seleghim / Banca: Eduardo Alves de Almeida / Resumo: Os basidiomicetos são conhecidos por sua capacidade em degradar a madeira. Essa característica deve-se à sua habilidade em oxidar a lignina presente nas plantas. Essa molécula é um composto recalcitrante formado por sub-unidades de fenilpropanóides e as enzimas capazes de degradá-la são conhecidas conjuntamente como enzimas ligninolíticas. Tais enzimas são inespecíficas. Essa característica confere-lhes o seu emprego na oxidação de compostos que possuem estrutura molecular semelhante à da lignina, tais como pesticidas e hidrocarbonetos poli-aromáticos, que possuem anéis aromáticos em sua estrutura. Dessa forma, é possível utilizar tais enzimas na degradação desses xenobióticos. Alguns basidiomicetos possuem a habilidade de crescer em meio com baixa atividade de água. Assim, é possível usá-los em processos de biorremediação de ambientes que possuem uma alta concentração de solutos, como em meios com alta salinidade. Esse trabalho teve como objetivo o estudo da capacidade de crescimento em meio líquido agitado com baixa atividade de água do basidiomiceto Dacryopinax elegans SXS323, promovida pela adição de cloreto de sódio 0,5 M, manitol 0,5 M ou glicerol 0,5 M ao meio de cultura; a produção de enzimas ligninolíticas e o seu poder de degradação do herbicida diurom nessas condições. Verificou-se que o basidiomiceto foi capaz de crescer sob todos os meios testados, sendo este mais pronunciado quando manitol ou glicerol foram acrescentados ao meio, averiguando-se um estímulo de crescimento. O manitol e o glicerol serviram como fonte secundária de carbono. O cloreto de sódio inibiu seu crescimento. Outro fator de inibição do crescimento foi a adição de diurom. A produção de enzimas ligninolíticas foi muito baixa, com pico de atividade de 3,67 U . L -1 com 144 horas de cultivo em meio com glicerol 0,5M. Apesar disso, detectou-se degradação... (Resumo comp'leto, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The basidiomycetes are known for their ability to degrade wood. This feature is due to its ability to oxidize lignin of plants. This molecule is a compound formed by recalcitrant sub-units of phenylpropanoids and enzymes able to degrade it and are known as ligninolytic enzymes. These enzymes are nonspecific. This characteristic provides them the capability of oxidation of compounds that have molecular structures similar to lignin, such as pesticides and polyaromatic hydrocarbons, which possess aromatic rings in their structure. Thus, it is possible to use such enzymes in the degradation of xenobiotics. Some basidiomycetes have their ability to grow in media with low water activity. Thus, it can be used in bioremediation process in environments that have a high concentration of solutes, such as hypersaline environments. This work aimed to study the capability of the basidiomycete Dacryopinax elegans SXS323 to grow in liquid shaken with low water activity, promoted by the addition of sodium chloride 0.5 M, mannitol 0.5 M or glycerol 0.5 M to the medium culture, the production of ligninolytic enzymes and their degradation capability of the herbicide diuron in these conditions. It was found that the basidiomycete was able to grow in all media tested. The growth was most pronounced when mannitol or glycerol was added to the medium, probably working as a stimulus for growth, and were used as a secondary source of carbon. Sodium chloride inhibited its growth. Another factor inhibiting the growth was the addition of diuron. The ligninolytic enzyme production was very low, with peak activity of 3.67 U. L -1 with 144 hours in medium with glycerol 0.5 M. Nevertheless, we detected the degradation of the herbicide, registering 32.63% (glycerol 0.5 M, 192 hours), 25.47% (mannitol 0.5 M, 192 hours) 20.51% of reduction in medium with glucose 5.0 g . L -1 (240 hours)... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre