Devido à grande incidência de pessoas com lesões de pele como queimaduras e úlceras e à baixa disponibilidade de doadores, houve a necessidade de desenvolvimento de biomateriais com a capacidade de mimetizar a pele. Para o desenvolvimento desses biomateriais, polímeros são utilizados na tentativa de alcançar características mais próximas as do órgão alvo. Neste sentido, nosso grupo vem desenvolvendo, há alguns anos, substitutos dermo-epidérmicos, particularmente membranas biodegradáveis e biocompatíveis constituídas de PVAl e quitosana. O PVAl, polímero sintético, foi utilizado para mimetizar a porção dérmica humana e a quitosana, polímero de origem natural, foi utilizada neste estudo para favorecer o crescimento e manutenção da porção epidérmica. Devido às variações destes polímeros obtidos comercialmente, o objetivo deste estudo foi caracterizar as suas propriedades físico-químicas, comparando-as com a membrana anteriormente obtida pelo nosso grupo, com o intuito de confirmar hipóteses de interferências ressaltadas nesse estudo. As membranas de PVAl em estudo (PVAl MP) que obtiveram características morfológicas mais semelhantes ao padrão, foram as irradiadas a 13 e 15 kGy, sendo esta última escolhida por atingir a dose mínima necessária para se obter um material estéril. Estas membranas também foram as que apresentaram maior porcentagem de poros entre 70 e 100 m2. Quanto à quitosana, as principais características estudadas foram o grau de acetilação (DA) e a massa molecular média, ambos os resultados indicaram características diferentes daquelas indicadas comercialmente. Diversos protocolos de preparações de membranas foram feitos a partir de solução de quitosana (2%). A membrana composta de solução de quitosana homogeneizada com glicerol (20%) e seca a temperatura ambiente, apresentou a melhor interação com os queratinócitos. Para a finalização do trabalho esta solução de quitosana foi vertida sobre a membrana de PVAl, liofilizada e intumescida com solução de quitosana (2%) e o conjunto foi mantido à temperatura ambiente até formação do filme de quitosana na face superior, obtendo-se assim uma membrana composta compatível com o sistema dermo-epidérmico. / Due to the frequent incidence of people with skin lesions such as burns and ulcers and the lack of available donors, biomaterials with the capacity to mimic skin must be developed. In order to develop these biomaterials, polymers are used in the attempt to achieve characteristics which are closer to the target organ. In this direction, for several years our group has been developing dermo-epidermic substitutes, specifically biodegradable and biocompatible membranes made up of PVAI and chitosan. PVAI, a synthetic polymer, was used to imitate part of the human dermis and chitosan, a polymer of organic origin, was used in this study to stimulate growth and maintenance of the epidermis. Due to the variations of these commercially obtained polymers, the objective of this study was to characterize their physical and chemical properties, comparing them with the membrane previously obtained by our group with the intention of confirming the hypotheses of interferences put forward in this study. The PVAI membranes in the study (PVAI MP) that obtained characteristics most similar to the standard were those irradiated with 13 and 15 kGy; this last was chosen because it was the minimum dose necessary to achieve sterility. These membranes were also those which had the largest percentage of pores between 70 and 100 m. For chitosan, the principal characteristics studied were the degree of acetylation (DA) and average molecular weight, both results demonstrated different characteristics than commercially indicated. Various membrane preparation protocols were carried out from the chitosan solution (2%). The membrane composed of the solution of chitosan homogenized with glycerol (20%) and dried at room temperature had the best interaction with keratinocytes. To finalize the study, this chitosan solution was poured over a PVAI membrane, lyophilized and impregnated with chitosan (2%) solution and the compound was kept at room temperature until a chitosan film formed on the upper surface, thus obtaining a composite membrane compatible with the dermo-epidermic system.

Devido à grande incidência de pessoas com lesões de pele como queimaduras e úlceras e à baixa disponibilidade de doadores, houve a necessidade de desenvolvimento de biomateriais com a capacidade de mimetizar a pele. Para o desenvolvimento desses biomateriais, polímeros são utilizados na tentativa de alcançar características mais próximas as do órgão alvo. Neste sentido, nosso grupo vem desenvolvendo, há alguns anos, substitutos dermo-epidérmicos, particularmente membranas biodegradáveis e biocompatíveis constituídas de PVAl e quitosana. O PVAl, polímero sintético, foi utilizado para mimetizar a porção dérmica humana e a quitosana, polímero de origem natural, foi utilizada neste estudo para favorecer o crescimento e manutenção da porção epidérmica. Devido às variações destes polímeros obtidos comercialmente, o objetivo deste estudo foi caracterizar as suas propriedades físico-químicas, comparando-as com a membrana anteriormente obtida pelo nosso grupo, com o intuito de confirmar hipóteses de interferências ressaltadas nesse estudo. As membranas de PVAl em estudo (PVAl MP) que obtiveram características morfológicas mais semelhantes ao padrão, foram as irradiadas a 13 e 15 kGy, sendo esta última escolhida por atingir a dose mínima necessária para se obter um material estéril. Estas membranas também foram as que apresentaram maior porcentagem de poros entre 70 e 100 m2. Quanto à quitosana, as principais características estudadas foram o grau de acetilação (DA) e a massa molecular média, ambos os resultados indicaram características diferentes daquelas indicadas comercialmente. Diversos protocolos de preparações de membranas foram feitos a partir de solução de quitosana (2%). A membrana composta de solução de quitosana homogeneizada com glicerol (20%) e seca a temperatura ambiente, apresentou a melhor interação com os queratinócitos. Para a finalização do trabalho esta solução de quitosana foi vertida sobre a membrana de PVAl, liofilizada e intumescida com solução de quitosana (2%) e o conjunto foi mantido à temperatura ambiente até formação do filme de quitosana na face superior, obtendo-se assim uma membrana composta compatível com o sistema dermo-epidérmico. / Due to the frequent incidence of people with skin lesions such as burns and ulcers and the lack of available donors, biomaterials with the capacity to mimic skin must be developed. In order to develop these biomaterials, polymers are used in the attempt to achieve characteristics which are closer to the target organ. In this direction, for several years our group has been developing dermo-epidermic substitutes, specifically biodegradable and biocompatible membranes made up of PVAI and chitosan. PVAI, a synthetic polymer, was used to imitate part of the human dermis and chitosan, a polymer of organic origin, was used in this study to stimulate growth and maintenance of the epidermis. Due to the variations of these commercially obtained polymers, the objective of this study was to characterize their physical and chemical properties, comparing them with the membrane previously obtained by our group with the intention of confirming the hypotheses of interferences put forward in this study. The PVAI membranes in the study (PVAI MP) that obtained characteristics most similar to the standard were those irradiated with 13 and 15 kGy; this last was chosen because it was the minimum dose necessary to achieve sterility. These membranes were also those which had the largest percentage of pores between 70 and 100 m. For chitosan, the principal characteristics studied were the degree of acetylation (DA) and average molecular weight, both results demonstrated different characteristics than commercially indicated. Various membrane preparation protocols were carried out from the chitosan solution (2%). The membrane composed of the solution of chitosan homogenized with glycerol (20%) and dried at room temperature had the best interaction with keratinocytes. To finalize the study, this chitosan solution was poured over a PVAI membrane, lyophilized and impregnated with chitosan (2%) solution and the compound was kept at room temperature until a chitosan film formed on the upper surface, thus obtaining a composite membrane compatible with the dermo-epidermic system.

Meduloblastoma é o tumor maligno intracranial mais comum em crianças. Receptores de peptídeos similares à bombesina, como o receptor de neuromedina B (NMBR), podem possuir um papel no crescimento de tumores. Neste estudo, examinamos a expressão de neuromedina B (NMB) e de NMBR em linhagens de meduloblastoma humano Daoy e D283 e a influência desse receptor na viabilidade celular. Além disso, NMBR e GRPR compartilham vias de sinalização, então a influência dessa comunicação na viabilidade celular também foi investigada. Mostramos que, apesar de expressarem NMBR e NMB, a viabilidade de meduloblastoma não é afetada pelo tratamento por 48 h com NMB ou com antagonista de NMBR ou com a combinação de antagonistas de NMBR e de GRPR. Uma vez que há evidências de que a superexpressão de receptores da família ErbB esteja relacionada ao pior prognóstico em meduloblastoma, avaliamos a expressão e o efeito do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR/ErbB1) sobre a viabilidade celular desse tumor. As duas linhagens estudadas expressam mRNA de EGFR, mas apenas a viabilidade de Daoy foi afetada pela inibição desse receptor. Avaliamos o efeito da inibição combinada de NMBR e EGFR sobre a viabilidade celular, uma vez que a ativação de receptores da família da bombesina é capaz de transativar EGFR em tumores. A inibição de NMBR parece facilitar a diminuição da viabilidade celular causada pela inibição de EGFR, indicando uma possível comunicação entre esses receptores. Assim, os resultados desse estudo demonstram a coexpressão de NMB e de NMBR e indicam uma possível relação desse receptor com EGFR. / Medulloblastoma is the most common brain tumor of childhood. The mammalian bombesin receptors, as neuromedin B receptor (NMBR), can play a important role in the growth of tumors. In this study, we evaluated the expression of neuromedin B (NMB) and NMBR in human medulloblastoma cell lines Daoy and D283 and the influence of this peptide in cellular proliferation. Besides that, NMBR and GRPR share common signaling pathways, so the influence of this possible crosstalking in medulloblastoma cells proliferation was investigated. We show that, despite expressing NMBR and NMB, the viability of medulloblastoma is not affected by the treatment for 48 h with NMB or antagonist of NMBR or the combination of NMBR and GRPR antagonists. Since there is evidence that the overexpression of ErbB receptors family is linked to worse prognosis in medulloblastoma, we evaluate the expression and effect of epidermal growth factor receptor (EGFR/ErbB1) on cell viability of this tumor. The two cell lines studied expressed mRNA of EGFR, but only the viability of Daoy was affected by the inhibition of this receptor. We evaluated the combined effect of inhibition of EGFR and NMBR on cell viability, since the activation of the bombesin receptor family is able to transactivate EGFR in tumors. The inhibition of NMBR may facilitate the reduction of cell viability caused by inhibition of EGFR, indicating a possible communication between these receptors. Thus, the results of this study demonstrate the coexpression of NMB and NMBR and indicate a possible relationship of this receptor with EGFR.

Meduloblastoma é o tumor maligno intracranial mais comum em crianças. Receptores de peptídeos similares à bombesina, como o receptor de neuromedina B (NMBR), podem possuir um papel no crescimento de tumores. Neste estudo, examinamos a expressão de neuromedina B (NMB) e de NMBR em linhagens de meduloblastoma humano Daoy e D283 e a influência desse receptor na viabilidade celular. Além disso, NMBR e GRPR compartilham vias de sinalização, então a influência dessa comunicação na viabilidade celular também foi investigada. Mostramos que, apesar de expressarem NMBR e NMB, a viabilidade de meduloblastoma não é afetada pelo tratamento por 48 h com NMB ou com antagonista de NMBR ou com a combinação de antagonistas de NMBR e de GRPR. Uma vez que há evidências de que a superexpressão de receptores da família ErbB esteja relacionada ao pior prognóstico em meduloblastoma, avaliamos a expressão e o efeito do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR/ErbB1) sobre a viabilidade celular desse tumor. As duas linhagens estudadas expressam mRNA de EGFR, mas apenas a viabilidade de Daoy foi afetada pela inibição desse receptor. Avaliamos o efeito da inibição combinada de NMBR e EGFR sobre a viabilidade celular, uma vez que a ativação de receptores da família da bombesina é capaz de transativar EGFR em tumores. A inibição de NMBR parece facilitar a diminuição da viabilidade celular causada pela inibição de EGFR, indicando uma possível comunicação entre esses receptores. Assim, os resultados desse estudo demonstram a coexpressão de NMB e de NMBR e indicam uma possível relação desse receptor com EGFR. / Medulloblastoma is the most common brain tumor of childhood. The mammalian bombesin receptors, as neuromedin B receptor (NMBR), can play a important role in the growth of tumors. In this study, we evaluated the expression of neuromedin B (NMB) and NMBR in human medulloblastoma cell lines Daoy and D283 and the influence of this peptide in cellular proliferation. Besides that, NMBR and GRPR share common signaling pathways, so the influence of this possible crosstalking in medulloblastoma cells proliferation was investigated. We show that, despite expressing NMBR and NMB, the viability of medulloblastoma is not affected by the treatment for 48 h with NMB or antagonist of NMBR or the combination of NMBR and GRPR antagonists. Since there is evidence that the overexpression of ErbB receptors family is linked to worse prognosis in medulloblastoma, we evaluate the expression and effect of epidermal growth factor receptor (EGFR/ErbB1) on cell viability of this tumor. The two cell lines studied expressed mRNA of EGFR, but only the viability of Daoy was affected by the inhibition of this receptor. We evaluated the combined effect of inhibition of EGFR and NMBR on cell viability, since the activation of the bombesin receptor family is able to transactivate EGFR in tumors. The inhibition of NMBR may facilitate the reduction of cell viability caused by inhibition of EGFR, indicating a possible communication between these receptors. Thus, the results of this study demonstrate the coexpression of NMB and NMBR and indicate a possible relationship of this receptor with EGFR.

Meduloblastoma é o tumor maligno intracranial mais comum em crianças. Receptores de peptídeos similares à bombesina, como o receptor de neuromedina B (NMBR), podem possuir um papel no crescimento de tumores. Neste estudo, examinamos a expressão de neuromedina B (NMB) e de NMBR em linhagens de meduloblastoma humano Daoy e D283 e a influência desse receptor na viabilidade celular. Além disso, NMBR e GRPR compartilham vias de sinalização, então a influência dessa comunicação na viabilidade celular também foi investigada. Mostramos que, apesar de expressarem NMBR e NMB, a viabilidade de meduloblastoma não é afetada pelo tratamento por 48 h com NMB ou com antagonista de NMBR ou com a combinação de antagonistas de NMBR e de GRPR. Uma vez que há evidências de que a superexpressão de receptores da família ErbB esteja relacionada ao pior prognóstico em meduloblastoma, avaliamos a expressão e o efeito do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR/ErbB1) sobre a viabilidade celular desse tumor. As duas linhagens estudadas expressam mRNA de EGFR, mas apenas a viabilidade de Daoy foi afetada pela inibição desse receptor. Avaliamos o efeito da inibição combinada de NMBR e EGFR sobre a viabilidade celular, uma vez que a ativação de receptores da família da bombesina é capaz de transativar EGFR em tumores. A inibição de NMBR parece facilitar a diminuição da viabilidade celular causada pela inibição de EGFR, indicando uma possível comunicação entre esses receptores. Assim, os resultados desse estudo demonstram a coexpressão de NMB e de NMBR e indicam uma possível relação desse receptor com EGFR. / Medulloblastoma is the most common brain tumor of childhood. The mammalian bombesin receptors, as neuromedin B receptor (NMBR), can play a important role in the growth of tumors. In this study, we evaluated the expression of neuromedin B (NMB) and NMBR in human medulloblastoma cell lines Daoy and D283 and the influence of this peptide in cellular proliferation. Besides that, NMBR and GRPR share common signaling pathways, so the influence of this possible crosstalking in medulloblastoma cells proliferation was investigated. We show that, despite expressing NMBR and NMB, the viability of medulloblastoma is not affected by the treatment for 48 h with NMB or antagonist of NMBR or the combination of NMBR and GRPR antagonists. Since there is evidence that the overexpression of ErbB receptors family is linked to worse prognosis in medulloblastoma, we evaluate the expression and effect of epidermal growth factor receptor (EGFR/ErbB1) on cell viability of this tumor. The two cell lines studied expressed mRNA of EGFR, but only the viability of Daoy was affected by the inhibition of this receptor. We evaluated the combined effect of inhibition of EGFR and NMBR on cell viability, since the activation of the bombesin receptor family is able to transactivate EGFR in tumors. The inhibition of NMBR may facilitate the reduction of cell viability caused by inhibition of EGFR, indicating a possible communication between these receptors. Thus, the results of this study demonstrate the coexpression of NMB and NMBR and indicate a possible relationship of this receptor with EGFR.

MONTENEGRO, Raquel Carvalho. Estudo de polimorfismos (germline) no gene EGFR (receptor do fator de crescimento epidermal) e possíveis associações com a resposta citotóxica em fibroblastos tratados com inibidores de tirosina quinase. 2006. 110 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2006. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-09-06T13:25:02Z No. of bitstreams: 1 2006_tese_rcmontenegro.pdf: 769765 bytes, checksum: f9a180cae6d35df9fcbd81fce1560af5 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-09-06T13:44:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_tese_rcmontenegro.pdf: 769765 bytes, checksum: f9a180cae6d35df9fcbd81fce1560af5 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-06T13:44:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_tese_rcmontenegro.pdf: 769765 bytes, checksum: f9a180cae6d35df9fcbd81fce1560af5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Only a small number of cancer patients benefit from therapy with EGFR inhibitors. It is therefore important to understand the mechanism of action of these drugs and to find predictive markers for drug response to guide the selection of patients who can benefits from these drugs. Although somatic mutations and gene amplification have been correlated with the efficacy of EGFR-targeting therapy, cancer cells and/or patients with normal EGFR expression are also sensitive to these drugs. We then aim to further understand the mechanism underlying the predisposition to sensitivity to EGFR inhibitors in germline cells. We chose 70 human normal fibroblasts cell lines as an in vitro model. Cytotoxicity studies were performed on these cells using two EGFR inhibitors, tarceva (T), gefitinib (G) and AG1478 (AG). Cells were incubated with serial concentrations of the drugs (10, 20, 40 and 60 µM for T and G and 5, 10, 15 and 20 µM for AG) dissolved in DMSO. Growth inhibition was measured by Alamar Blue. Four polymorphisms, -216G/T, R497K, 787C/T and intron 1 (CA)n, were genotyped in these cells. EGFR expression was measured with real-time PCR. There was considerable variability in drug response in a dose-dependent manner among these cells. No working concentration were found to be toxic for T. The other two drugs behaved quite differently. The fibroblasts had a much more variable response to G (mean of coefficient of variance of survival rates under all 4 concentrations, 61%) when compared to the response to AG (26%). Drug response was not correlated with EGFR expression. A significant correlation was observed between the R497K polymorphism and the survival rate of cells treated with AG at 5 μM (p<0.01) and 10 µM (p<0.05) with higher growth inhibition in K allele-carriers. No correlation was observed between any of the four EGFR polymorphisms and G cytotoxicity. These observations suggest that the cytotoxic effects of G and AG are due to different mechanisms, and that other genes such as transporters may also contribute to drug response. The R497K polymorphism may be useful as a predictive marker for response to AG and/or similar agents. Also, pathway studies should be done to clarifyed the relationship between response and cutaneous rash in patients treated with tirosine kinase inhibitors. / Apenas um pequeno número de pacientes beneficiam-se da terapia com inibidores de EGFR. Em razão disso, torna-se importante o entendimento dos mecanismos envolvidos na resposta a estas drogas a fim de encontrar marcadores preditores de eficácia terapêutica, auxiliando, então, na seleção de pacientes que podem se beneficiar com essas drogas. Apesar de mutações somáticas e amplificações gênicas terem sido correlacionadas à eficácia terapêutica dos inibidores de EGFR, foi demonstrado que células neoplásicas e/ou pacientes que possuem expressão de EGFR normal também são sensíveis à estas drogas. Assim, o objetivo deste trabalho foi entender os mecanismos envolvidos na predisposição à sensibilidade aos inibidores de tirosina quinases em células normais por meio de análise de polimorfismos (germline) no gene EGFR. Para isso, foi escolhido um modelo in vitro, utilizando-se 70 amostras de fibroblastos normais. Os estudos citotóxicos foram realizados com dois inibidores de EGFR Gefitinib (Ge) e AG1478 (AG). As células foram incubadas por 72 horas com diferentes concentrações (10, 20, 40 e 60 µM para Ge e 5, 10, 15 e 20 µM para AG) sendo dissolvidas em DMSO. Para a análise genotípica, foram avaliados quatro polimorfismos: -216G/T, R497K, 787C/T e intron 1 (CA)n. A expressão de EGFR foi analisada por PCR em tempo real. Já para as outras duas drogas, observou-se que estas se comportaram de forma diferente. Os fibroblastos tiveram uma maior variabilidade na resposta para Ge (coeficiente de variabilidade entre as quatro doses de 61%) quando comparado a resposta para AG (26%). A inibição do crescimento não foi correlacionada com o nível de expressão de EGFR. Observou-se, ainda, correlação significante entre o polimorfismo R497K e a sobrevida das células tratadas com AG na dose de 5 µM (p<0.01) e 10 µM (p<0.05) com uma maior inibição do crescimento celular nos alelos K. Nenhuma correlação foi observada entre os polimorfismos e a citotoxicidade de Ge. Essas observações sugerem que os efeitos citotóxicos de G e AG possuem mecanismos diferentes, e que outros genes tais como trasportadores podem contribuir para a resposta a essas drogas. O polimorfismo R497K pode ser útil como marcador de predição de resposta a AG e/ou agentes semelhantes. Mais estudos envolvendo vias de sinalização devem ser realizados para esclarecer a relação entre resposta e rash cutâneo em pacientes tratados com inibidores de tirosina quinase.

El Factor de Crecimiento Epidermal(FCE) encargado de estimular los procesos de división, migración y diferenciación de las células epiteliales. El tabaquismo principal factor de riesgo asociado a la formación de lesiones cancerígenas en boca, vías respiratorias, pulmón etc. El presente estudio se encargó de determinar la relación entre Tabaquismo y la Concentración del Factor de Crecimiento Epidermal en saliva, para lo cual se recolectó muestras de saliva total no estimulada y se evaluó los niveles de concentración del FCE mediante el inmunoensayo de ELISA de 40 pacientes no fumadores como grupo control y 39 pacientes fumadores como grupo de estudio, estos últimos divididos en subgrupos de fumadores leves(19), fumadores moderados(10) y fumadores severos(10) que acudieron al Servicio de Diagnóstico de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Se encontró que a mayor grado de tabaquismo los niveles de concentración de FCE eran más elevados encontrándose una diferencia estadísticamente significativa entre pacientes no fumadores, fumadores leves, fumadores moderados y fumadores severos(p=0.000). También se encontró que no hay relación del FCE con respecto a la edad, ni al género. / Tesis

Atualmente existe uma forte tendência mundial para o desenvolvimento de testes in vitro que supram o uso de animais em ensaios de avaliação de segurança. Em 1986 a Diretiva Europeia 86/609/EEC induziu a discussão mundial de redução de testes em animais e a 7ª emenda desta Diretiva, publicada em 2004, determinou a transferência dos ensaios para a avaliação de risco para sistema in vitro. Diferentes abordagens foram desenvolvidas para suprir essa necessidade como, por exemplo, a geração de equivalentes de epiderme, que foi considerada a mais promissora e extensamente investigada. Dois modelos de equivalentes de epiderme (EpiDermTM-MATTEK e EPISKINTM LORÉAL) comercialmente disponíveis foram validados pelo ECVAM (Centro Europeu para a Validação de Métodos Alternativos) e outros modelos de epiderme reconstruída estão sendo desenvolvidos em diferentes laboratórios de pesquisa do mundo. Esses dois modelos são recomendados no Guia 431 (Organização para cooperação e desenvolvimento econômico - OECD) que avalia in vitro a corrosão da pele. No Brasil esta prática ainda é inexistente, porém deverá ser implementada rapidamente para que atenda aos conceitos humanitários internacionais. Sendo assim, este projeto teve como objetivo criar, dentro dos princípios do Guia 431, um equivalente de epiderme e posterior otimização deste processo através da incorporação de uma membrana biopolimérica (PET e colágeno I) como suporte celular. O modelo de epiderme humana reconstruída consiste de um tecido epidérmico diferenciado tridimensionalmente a partir de queratinócitos humanos normais cultivados em um meio quimicamente definido na interface ar-líquido. A validação deste modelo para ensaios de avaliação do potencial corrosivo de substâncias foi realizada seguindo os princípios do Guia 431 da OECD, sendo que quatro substâncias da lista indicada pelo Guia foram testadas: duas corrosivas (Ácido Lático e Ácido Octanóico) e duas não corrosivas (2-bromo Etilbenzeno e Benzilacetona), assim como controles positivo (Acido acético) e negativo (NaCl 0,9%). Os resultados de viabilidade celular após 3 minutos e 1 hora de exposição às substâncias teste demostraram que o nosso modelo permite distinguir as substâncias entre corrosivas e não corrosivas, no entanto não permite a subcategorização das corrosivas em 1A ou 1B/C. Assim, nós demonstramos o potencial do nosso modelo como um método de teste relevante e confiável que pode ser usado para pesquisa e investigação de risco químico. Visando a otimização do modelo, testamos a incorporação de uma membrana biopolimérica eletrofiada de PET e colágeno tipo I como suporte para crescimento celular em substituição ao transwell. A análise histológica das membranas demonstrou que as mesmas são biocompativeis, permitindo adequada adesão e proliferação dos queratinócitos e dos fibroblastos, no entanto, não se observou uma diferenciação adequada com a formação de uma epiderme semelhante à humana (estratos basal, espinhoso, granuloso e córneo). Além disso, a falta de uniformidade e reprodutibilidade nos resultados indicam que é necessário uma otimização dos processos de fabricação das membranas e geração do equivalente epidérmico. Em perspectiva, este equivalente epidérmico poderá ser utilizado para pesquisa e avaliação de risco de fármacos, medicamentos, cosméticos, praguicidas, etc., contribuindo para a geração de métodos alternativos aos testes em animais e inserindo o Brasil na tendência internacional do desenvolvimento de testes para avaliação do risco. / Currently there is a strong global trend towards the development of in vitro tests that fulfill the use of animals in safety evaluation tests. In 1986, the European Directive 86/609/EEC led to the discussion of global reduction of animal testing and the 7th amendment of this Policy, published in 2004, ordered the transfer of the tests for risk assessment for in vitro system. Different approaches have been taking into account to achieve this goal, for example, the development of epidermal equivalents models, which have been considered the most promising and widely studied model. ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods) has validated two models of reconstructed epidermis (EpiDermTM - Mattek and EPISKINTM - L\'Oréal) that are commercially available and other models are being developed in different research laboratories in the world. These two models are recommended in Guide 431 (Organisation for Economic Cooperation and Development - OECD) for in vitro evaluation of skin corrosion. In Brazil, this practice is still lacking, but should be implemented quickly so that meets international humanitarian concepts. Therefore, this project aimed the creation, within the principles of Guide 431, of an epidermal equivalent and the optimization of this process through the incorporation of a biopolymer membrane (PET and collagen I) as cellular support. The reconstructed human epidermis (RHE) consists of a differentiated three-dimensional epidermal tissue reconstructed from normal human keratinocytes in a chemically defined medium and air liquid interface growth. The validation of this model for the assessment of skin corrosion potential of substances was performed following the principles of the OECD Guide 431, hereupon four substances from the list indicated by the Guide were tested: two corrosive (lactic acid and octanoic acid) and two non-corrosive (2-phenylethyl bromide and benzylacetone) and positive (acetic acid) and negative (NaCl 0.9%) controls. The cell viability results after 3 minutes and 1 hour of exposure to the test substances indicates that our model is capable of distinguishing the substances among corrosive and non-corrosive. Although they do not, allow the sub-categorization of corrosive in 1A or 1B/C. Thus, we have demonstrated that our model is a potentially relevant and a reliable test method that could be used in research and specifically for the investigation of chemical hazard. To optimize the model, we tested the incorporation of a biopolymer membrane composed of PET and type I collagen as support for cell growth, as a replacement of the transwell. Histological examination of membranes has shown that they are biocompatible, enabling adequate adhesion and proliferation of keratinocytes and fibroblasts. However, there was no adequate differentiation with the formation of a similar human epidermis (stratum basale, spinosum, granulosum and corneum). Moreover, the lack of uniformity and reproducibility of the results indicates that it is still necessary to optimize the membranes production process and the generation of the epidermal equivalent using the membranes as support. In perspective, the developed epidermal equivalent may be used for research and risk assessment of pharmaceuticals, medicines, cosmetics, chemicals, pesticides, among others. This directly contributes to the development of alternative methods able to substitute animal testing in Brazil and follows the international trend of development tests for risk assessment.

A família de Tumores de Ewing pode ser compreendida como um espectro de neoplasias de células neuroectodérmicas primitivas, dentre eles se inclui uma classe menos diferenciada chamada Sarcoma de Ewing (SE), no qual o diagnóstico é mais frequente entre 11 e 20 anos. O índice de sobrevida pode chegar em 70%; todavia, estima-se que apenas 55% dos pacientes recebam um tratamento efetivo. Alguns estudos sugerem relevância do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) no processo de tumorigênese e metátase em cânceres de cabeça e pescoço, pulmão e colorretal. Algumas vias de sinalização que poderiam explicar a relação do EGFR a estes processos incluem a MAPK/ERK e PI3K/AKT. No entanto, estes complexos de sinalização podem ser ativados por outras cascatas de transdução de sinal como do sistema BDNF/TrkB. As neurotrofinas, mais recentemente, estão sendo relacionadas ao processo tumoral. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a importância de EGF/EGFR na progressão tumoral do Sarcoma de Ewing, bem como o crosstalking entre este sistema e neurotrofinas. Linhagens celulares foram expostas a EGF ou ao inibidor da fosforilação do respectivo receptor (AG1478). A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas em hemocitômetro. A análise do ensaio clonogênico foi feita em software ImageJ®. Para análise do ciclo celular, após exposição ao AG1478, realizou-se a avaliação por citometria de fluxo e uma provável indução de senescência foi analisada com X-Gal. Western Blotting foi padronizado para avaliação das vias MEK/ERK, PI3K/AKT, Ciclina D1, p53 e BDNF quando da exposição ao AG1478. Análises de viabilidade celular também foram feitas usando inibidores de MEK ou PI3K em combinação ao AG1478 ou não. A exposição das linhagens SK-ES-1 E RD-ES ao EGF afeta positivamente a taxa de proliferação destas e, quando essas são tratadas com o inibidor AG1478, existe um decréscimo desta taxa além de um impacto da razão de viabilidade. O índice de citotoxicidade (IC50) resultante é de 12,8uM e 9,8uM para SK-ES-1 e RD-ES, respectivamente. Foi observado que a inibição de EGFR reduziu o número e tamanho de colônias, e que a sua ativação reflete em um aumento dos parâmetros. Alterações das porcentagens populacionais nas fases do ciclo celular foram observadas. O ensaio colorimétrico mostrou aumento da percentagem de células senescentes e sugere-se envolvimento da via da ERK; AKT; Ciclinas, P53 e BDNF no efeito mediante exposição ao AG1478. A exposição ao EGF, portanto, aumenta a proliferação e a clonogenicidade de células de SE, bem como a diminuição destas quando da inibição do receptor. Também, a inibição de EGFR resulta em alterações no ciclo celular, senescência e morte celular. / The family of Ewing's tumors may be understood as a spectrum of primitive neuroectodermal cell neoplasms, including a less differentiated class called Ewing's sarcoma (ES), wherein the diagnosis is most common between 11 and 20 years. The survival rate can reach 70%; however, it is estimated que only 55% of Patients receive effective treatment. Some published studies suggest relevance of epidermal growth factor receptor (EGFR) in tumorigenesis and metastatic process in head and neck, lung and colorectal tumors. Some signaling pathways, which could explain its relation with these processes, include MAPK / ERK and PI3K / AKT. However, other signal transduction cascades such as BDNF / TrkB system may activate these signaling complexes, the neurotrophins being related to the tumoral process. This study aims to assess the importance of EGF / EGFR in Ewing's Sarcoma tumor progression, and the crosstalking between this system and neurotrophins. Cell lines were exposed to EGF or the inhibitor of phosphorylation of its receptor (AG1478). The viability and cell proliferation were evaluated in hemocytometer. The analysis of the clonogenic assay was performed in ImageJ® software. For cell cycle analysis after exposure AG1478, the evaluation was performed by flow cytometry and a probable induction senescence was analyzed with X-Gal. Western Blott was standardized to evaluate the pathways MEK / ERK, PI3K / AKT, cyclin D1 and P53 when exposure to AG1478. Cell viability analyzes were also performed on exposure to MEK and PI3K inhibitor in combination or not with AG1478. Exposure of SK-ES-1 and RD-ES lines to EGF positively affects the rate of proliferation and when these are treated with the inhibitor AG1478, there is a decrease in this rate as well as an impact reason viability. The cytotoxicity index (IC50) is 12,8uM resulting 9,8uM and SK-ES-1 and RD-ES, respectively. We observed that inhibition of EGFR reduced the number and size of colonies, and their activation reflects an increase in the parameters. Changes in population percentages in the cell cycle phases were observed. The colorimetric assay showed an increased percentage of senescent cells and it is suggested involvement of the ERK pathway; AKT; Cyclin P53 and the effect upon exposure AG1478. Therefore, the EGF exposure increases the proliferation and clonogenicity of ES cells, as well as the reduction is observed when these receptor inhibited. Also, inhibition of EGFR results in changes in the cell cycle, senescence and cell death.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T00:43:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 296293.pdf: 595442 bytes, checksum: 4a44716096b914945e724217369d1213 (MD5) / A crista neural (CN) é uma população de células originadas das margens dorsais do tubo neural durante o desenvolvimento de vertebrados. Essas células possuem um alto potencial migratório e dão origem a múltiplos fenótipos como neurônios, células gliais, melanócitos e a diversos derivados mesenquimais. Sabe-se que essa diversificação de fenótipos é espacialmente e temporalmente influenciada por fatores do microambiente. Vários fatores de crescimento, incluindo o fator de crescimento epidermal (EGF), têm sido identificados como sendo capazes de direcionar a diferenciação de progenitores multipotentes da CN para tipos celulares específicos. Segundo Garcez e colaboradores (2009), o EGF é capaz de influenciar in vitro a diferenciação melanocítica das células da CN, aumentando o número de células pigmentadas em cultura. No presente trabalho investigamos os efeitos do EGF na potencialidade e diferenciação das células da CN de codornas (Coturnix coturnix japonica). Para isso culturas de massa e clonais de CN foram tratadas com EGF (10ng/mL). Nas células da CN truncal (CNT) os tratamentos foram realizados nas primeiras 20h, fase de migração das células a partir do tubo neural. Já para as células da CN cefálica (CNC) os tratamentos foram realizados após o período de migração, durante toda a cultura secundária. As células foram então fixadas e analisadas quanto à expressão do receptor de EGF (EGFR) e dos diferentes fenótipos celulares derivados da CN. Nossos resultados demonstram a expressão do EGFR pelas células da CNT 20h após o início da migração a partir do tubo neural, na cultura primária. O possível efeito do EGF na diferenciação condrocítica foi avaliado na CNC por apresentar o potencial mesectodermal. Em nossos resultados observamos frequência, número e tamanho dos nódulos de cartilagem equivalentes entre as condições controle e após tratamento com EGF, sugerindo que o EGF não influencia a diferenciação da CN para o fenótipo condrocítico. Para avaliar um possível efeito do EGF na potencialidade dos progenitores da CN, realizamos ensaios clonais, onde as células são plaqueadas individualmente sob controle microscópico. Identificamos progenitores comprometidos com as linhagens neuronal, glial, melanocítica ou muscular lisa, assim como progenitores bi, tri e tetrapotentes para diversas combinações destes fenótipos celulares. As proporções dos progenitores assim como a eficiência clonal (cerca de 60%) foram equivalentes nas duas condições experimentais, demonstrando que o EGF não interfere na proliferação nem na potencialidade dos progenitores da CN. Em trabalho anterior verificamos que o EGF promove aumento do número de melanócitos diferenciados identificados pela presença de melanina. Investigamos, então, se EGF influencia na diferenciação final dos melanócitos, avaliando a relação entre a expressão do marcador da linhagem melanocítica (melanocyte earlier marker, MelEM), que identifica tanto melanoblastos quanto melanócitos diferenciados, e a melanina. Observamos na condição controle que cerca de 20% das células da CN positivas para MelEM também apresentavam melanina, enquanto que após o tratamento com EGF essa proporção foi de 60%, correspondendo a um aumento de 3X. Esses resultados indicam que o EGF deva estar atuando sobre a etapa final do processo de diferenciação dos melanócitos, possivelmente envolvendo o processo da síntese de melanina. Entender o papel do EGF sobre a diferenciação melanocítica certamente contribuirá para avanços nos estudos de patologias que envolvam alterações no padrão de pigmentação, e as suas consequências, em organismos vertebrados.