Der Transkriptionsfaktor NF-κB ist von großer Bedeutung, da er verschiedene zelluläre Prozesse wie Proliferation, Apoptose, Invasion oder Inflammation beeinflusst. Im Gegensatz zu den meisten anderen Zelltypen ist in der humanen Epidermis ein wachstumsinhibierender Effekt mit der Aktivierung von NF-ĸB assoziiert. Die epidermale Homöostase dient der Aufrechterhaltung der intakten Hautbarriere und beschreibt das Gleichgewicht zwischen proliferierenden und differenzierenden epidermalen Keratinozyten. Schädliche äußere Einflüsse wie übermäßige Sonnenlichtexposition können die epidermale Homöostase stören, was zur Entstehung epidermaler Neoplasien wie aktinischer Keratosen oder Plattenepithelkarzinomen beiträgt. Das Ziel dieser Arbeit war die Expressions- und Funktionsanalyse der einzelnen NF-κB Proteinuntereinheiten in humanen Keratinozyten in vitro. Die siRNA-vermittelte transiente Reduktion von c-Rel beeinflusste deutlich das Zellschicksal von Keratinozyten. Obwohl vorangegangene Experimente durch eine stärkere Zellproliferation nach Inhibierung der NF-ĸB Proteine p50 und p65 das Gegenteil suggerierten, konnte für die Reduktion von c Rel ein inhibierender Effekt auf das Zellwachstum festgestellt werden. Außerdem zeigten sich eine veränderte Zellzyklusphasenverteilung sowie eine Akkumulation mitotischer Zellen mit aberranter, hauptsächlich monopolarer Spindelformation. Die zusätzlich detektierte Apoptose-Induktion könnte aus dem verlängerten mitotischen Arrest der c-Rel Knockdown Keratinozyten resultieren. Insgesamt lässt sich ein regulatorischer Effekt von c-Rel beim Eintritt in die Mitose oder der mitotischen Progression vermuten, wobei die beteiligten Zielgene noch zu identifizieren sind. Des Weiteren bewirkte der c-Rel Knockdown phänotypische Veränderung von HaCaT Keratinozyten mit tendenziell spindelzellartiger Elongation und einem insgesamt veränderten Wachstumsmuster. Die Adhäsion und besonders die Wundheilung von c-Rel reduzierten HaCaT Zellen war vermindert, möglicherweise bedingt durch ein reduziertes Stressfaservorkommen. Dieser Effekt zeigte sich allerdings nicht in c Rel herunter regulierten primären Keratinozyten, was auf Mutationen der spontan immortalisierten HaCaT Keratinozytenzelllinie zurückzuführen sein könnte. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein neuer Aspekt der einzelnen NF-ĸB Proteine aufgezeigt werden, besonders in Bezug auf die Proteinuntereinheit c-Rel. Hieraus resultiert ein besseres Verständnis der vielfältigen und komplexen Regulation von NF-κB abhängigen Funktionen und deren Effekte auf die epidermale Homöostase.

Les microARNs sont de petits ARN non codants régulant négativement l'expression génique au niveau post-transcriptionnel. Ils interviennent dans de nombreux processus biologiques et leur rôle dans la régulation de l'homéostasie cutanée est clairement démontrée. Cependant, leur fonction durant le vieillissement épidermique n'a jamais été étudiée. Nous avons donc réalisé une analyse exhaustive du miRnome épidermique durant son vieillissement afin d'identifier les microARNs différentiellement exprimés avec l'âge dans ce tissu. Plusieurs microARNs significativement modulés dans des kératinocytes âgés, nous ont permis d'établir une signature du vieillissement épidermique. Parmi eux, les deux brins du microARN miR-30a sont induits dans les épidermes âgés. La construction d'un lentivirus permettant la surexpression stable et inductible de ce microARN a facilité son étude fonctionnelle dans un modèle organotypique d'épiderme reconstruit. Nous avons observé que la surexpression de ce microARN dans un modèle de culture tridimensionnelle induit un phénotype épidermique présentant des similitudes avec celui observé durant son vieillissement chronologique et caractérisé par une forte altération de la différenciation des kératinocytes, par une perturbation de sa fonction barrière et par une augmentation de l'abondance des cellules apoptotiques. Ce projet de thèse a permis l'identification de 3 cibles directes de miR-30a dans les kératinocytes. Il s'agit de LOX, codant pour la lysyl oxydase qui intervient dans la balance prolifération/différenciation des kératinocytes, d'AVEN, un inhibiteur de caspase et d'IDH1, codant pour l'isocitrate déshydrogénase, enzyme du métabolisme énergétique. Ainsi, ce projet de thèse a révélé un nouveau microARN acteur du vieillissement épidermique et a permis de de mettre à jour de nouveaux mécanismes moléculaires expliquant certaines altérations phénotypiques observées dans l'épiderme avec l'âge / MicroRNAs are small non-coding RNA that negatively regulate gene expression at the post-transcriptional level. There are involved in many biological processes and play a key role in the regulation of skin homeostasis. However, their function during epidermal aging has never been studied. We performed an exhaustive analysis of the epidermal miRnome during its aging in order to identify microRNAs differentially expressed with age in this tissue. Several microRNAs significantly modulated in elderly keratinocytes, allowed us to establish a signature of epidermal aging. Among them, the two strands of the microRNA miR-30a are induced in aged epidermis. The construction of a lentivirus allowing inducible and stable overexpression of this microRNA facilitated its functional study in an organotypic model of reconstructed epidermis. We observed that the overexpression of this microRNA in a three-dimensional culture model induces an epidermal phenotype similar of those observed during its chronological aging characterized by a strong alteration of keratinocyte differentiation, by a disturbance of its barrier function and by an increase in the abundance of apoptotic cells. This thesis project allowed the identification of three miR-30a targets in keratinocytes : LOX encoding lysyl oxidase, which plays a role in proliferation/differentiation balance of keratinocytes, AVEN encoding a caspase inhibitor and IDH1 encoding isocitrate deshydrogenase, a key enzyme of cellular metabolism.Our work revealed a new miRNA actor and deciphered new molecular mechanisms to explain some alterations observed in epidermis during aging, especially those concerning keratinocytes differentiation and apoptotic death

Polycomb repressive complex 2 (PRC2) catalyses the methylation of ‘Lys-27’ of histone H3, leading to transcriptional repression of target genes through its catalytic subunit Enhancer of zeste homolog 1/2 (EZH1/2). PRC2 functions as a critical regulator of stem cells in mouse embryonic and adult tissues. However, the role of PRC2 in human skin remains largely unknown. This study investigated the role of PRC2 in human epidermal homeostasis and hair growth. The expression of EZH2 was elevated in differentiating suprabasal layers of the human epidermis. Consistently, EZH1/2 expression and enzymatic activity was upregulated in differentiating primary human keratinocytes (NHEKs) in vitro. Inhibition of EZH2 and Embryonic ectoderm development (EED) in NHEKs stimulated the expression of differentiation-associated genes, therefore leading to their premature differentiation; while inhibition of EZH1/2 reduced cell proliferation and promoted apoptosis. Silencing of EZH2 in NHEKs induced complex changes in gene expression programmes, including the upregulation of terminal differentiation genes, such as Filaggrin. EZH2 expression was downregulated in aged keratinocytes accompanied with upregulation of senescence-associated genes, p16INK4A and p19INK4D, suggesting EZH2 involvement in epidermal aging. In human anagen hair follicle (HF), EZH2 was detected in stem and progenitor cells; and hair matrix keratinocytes. Silencing EZH2 in HFs accelerated anagen-catagen transition and retarded hair growth accompanied by decreased proliferation and increased apoptosis. Silencing EZH2 in outer root sheath keratinocytes resulted in upregulation of p14ARF and K15, suggesting EZH2 involvement in regulating proliferation and stem cell activity. Thus, this study demonstrates that PRC2-mediated repression is crucial for epidermal homeostasis and hair growth. Modulating the activities of PRC2 in skin might offer a new therapeutic approach for disorders of epidermal differentiation and hair growth.