Abstract Local adaptation is important evolutionary process leading to adaptive population differentiation. Currently, examining its genetic basis is a major goal of evolutionary and ecological genetics. In my thesis I studied local adaptation and its genetic basis in populations of a perennial outcrossing model plant Arabidopsis lyrata by combining common garden experiments at the native field sites and in controlled conditions with quantitative trait locus mapping. Estimates of fitness in the field – both at the level of multiple components as well as hierarchical total fitness – showed that populations of A. lyrata were locally adapted. The studied populations were also phenotypically differentiated in ecologically relevant traits. Different components of fitness were important for the advantage of the locals depending on the environment. Local alleles were associated with high fitness in the field, suggesting that differing directional selection pressures have been involved in phenotypic differentiation. Mostly different genomic regions governed local adaptation in different environments, but the results also suggested that some of these regions could involve rarely documented fitness tradeoffs (antagonistic pleiotropy). Loci governing flowering time differentiation differed between the studied environments, highlighting the need to conduct experiments both in the wild and in controlled conditions. In contrast to most existing studies, F2 hybrids in general had surprisingly high fitness at one study site, largely due to beneficial dominance effects at loci governing survival in that environment. In addition to nuclear genes, cytoplasmic genomes also were found to have a role in local adaptation. / Tiivistelmä Luonnonvalinta saa aikaan paikallista sopeutumista ja adaptiivista erilaistumista. Paikallisen sopeutumisen perinnöllisen taustan selvittäminen on tällä hetkellä yksi tärkeimpiä evolutiivisen ja ekologisen genetiikan tavoitteita. Tässä väitöskirjatyössä tutkin paikallista sopeutumista ja sen geneettistä taustaa monivuotisella, ristipölytteisellä mallikasvilla, idänpitkäpalolla (Arabidopsis lyrata). Käytin työssäni geenikartoitusta kasveilla joita kasvatettiin yhdenmukaisissa oloissa sekä populaatioiden luontaisilla kasvupaikoilla että kontrolloiduissa olosuhteissa. Kenttäolosuhteissa arvioitu kelpoisuus osoitti idänpitkäpalkopopulaatioiden olevan paikallisesti sopeutuneita sekä yksittäisten kelpoisuuteen vaikuttavien ominaisuuksien että hierarkkisen kokonaiskelpoisuuden tasolla. Tutkitut populaatiot olivat myös erilaistuneita ekologisesti tärkeissä ominaisuuksissa. Kelpoisuuteen vaikuttavat ominaisuudet myös poikkesivat ympäristöjen välillä. Paikalliset alleelit olivat yhteydessä korkeaan kelpoisuuteen luonnossa, minkä perusteella voitiin päätellä erisuuntaisen luonnonvalinnan vaikuttaneen populaatioden erilaistumiseen. Kromosomiston eri alueet olivat tärkeitä sopeutumisessa eri ympäristöihin, mutta myös joidenkin samojen genomin alueiden havaittiin mahdollisesti vaikuttavan vastakkaisesti kelpoisuuteen eri ympäristöissä. Myös kukkimisajan erilaistumiseen vaikuttavat genomin alueet poikkesivat eri ympäristöjen välillä erityisesti verrattaessa kenttäkokeita kasvatushuone- ja kasvihuonekokeisiin. Toisin kuin useimmissa tutkimuksissa on havaittu, F2-sukupolven jälkeläistön kelpoisuus oli yllättävän korkea yhdessä kenttäkoeympäristössä. Tähän vaikuttivat kelpoisuuden kannalta suotuisat dominoivat geenivaikutukset, jotka paransivat kasvien selviytymistä kyseisessä ympäristössä. Tumassa sijaitsevien geenien lisäksi myös soluelimien perimällä havaittiin olevan yhteys paikalliseen sopeutumiseen.

Abstract Adaptation to local environment is important for all organisms to guarantee survival and to maximize reproduction. Populations of the same species may live in environments that differ markedly. Due to differential selection pressures this can lead to population differentiation, which can be studied both at the phenotypic and at the gene level. The growing season cued by long days is typically short in the north, whereas southern populations have long growing seasons and are adapted to short days. Seasonal fluctuations in temperature also differ between northern and southern environments. Daylength and temperature regulate the timing of flowering in plants. Environmental regulation of flowering and its genetic basis has been extensively studied in the annual model species Arabidopsis thaliana. The perennial growth and flowering habit has been studied especially in trees, but studies on herbaceous plants species have been lacking. In this thesis, I have studied adaptation to growing season length in a perennial herbaceous model species Arabidopsis lyrata. Individuals from populations adapted to northern and southern environments in Europe were grown in same conditions in the growth chambers and in the field. Differentiation between the populations was studied by observing their flowering phenotypes and by studying the expression of genes that are candidates for governing the phenotypic differentiation. The main result in the thesis was that adaptation to short growing season in north can be seen as long daylength requirement for flowering and as fast developmental rate. Critical daylength for flowering likely regulates especially the timing of flowering cessation in the end of the growing season. Flowering time of individuals from northern populations also responded more strongly to cold treatment (representing winter) than that of the southern population. The cold requirement for flowering guarantees that the plants only flower after the winter in the spring with suitable conditions. Expression studies indicated that population differentiation in flowering could be at least partly governed by the expression variation in a few candidate genes. The results in this thesis are valuable for instance for understanding perennial species in general, including tree and crop species, and for predicting how plants response to changing climate. / Tiivistelmä Ympäröiviin oloihin sopeutuminen on tärkeää kaikille organismeille selviytymisen ja jälkeläistuoton kannalta. Saman lajin eri populaatiot saattavat elää ympäristöissä, joiden olosuhteet poikkeavat toisistaan huomattavasti. Tällöin populaatioihin kohdistuvat erilaiset valintapaineet ja populaatiot erilaistuvat. Erilaistuminen havaitaan tarkastelemalla yksilöiden ilmiasuja ja geenejä. Kasvukauden pituus määrittää eteläisten ja pohjoisten kasvuympäristöjen valintapaineita. Pohjoisessa kasvukausi on lyhyt ja sen alkamisesta ja loppumisesta kertoo pitkä päivänpituus. Etelässä on pitkä kasvukausi ja siellä elävät populaatiot ovat sopeutuneet lyhyeen päivänpituuteen. Myös vuodenaikaiset lämpötilavaihtelut eroavat pohjoisten ja eteläisten alueiden välillä. Muutokset päivänpituudessa ja lämpötilassa säätelevät kasveilla kukkimisen ajankohtaa. Kukkimiseen vaikuttavia ympäristötekijöitä ja kukkimista sääteleviä geenejä on tutkittu paljon yksivuotisella mallilajilla lituruoholla (Arabidopsis thaliana). Monivuotisten kasvien kasvun ja kukkimisen säätelyä on tutkittu etenkin puilla, mutta hyvin vähän ruohovartisilla kasveilla. Tässä väitöskirjatyössä tutkin kasvukauden pituuteen sopeutumista monivuotisella ruohovartisella lajilla, idänpitkäpalolla (Arabidopsis lyrata). Pohjoisiin ja eteläisiin ympäristöoloihin sopeutuneiden eurooppalaisten populaatioiden yksilöitä kasvatettiin samanlaisissa olosuhteissa kontrolloiduissa kasvatushuoneissa ja kenttäolosuhteissa. Populaatioiden erilaistumista tarkkailtiin kukkimiseen liittyvissä ominaisuuksissa sekä eroja selittävien kandidaattigeenien ekspressiossa. Tutkimuksen päätulos oli, että pohjoisen populaation lyhyeen kasvukauteen sopeutuminen voidaan havaita pitkän päivän vaatimuksena kukkimiselle ja nopeana kehityksenä. Kenttäolosuhteissa päivänpituus sääteli etenkin kukkimisen lopetusta kasvukauden lopussa. Pitkä kylmäkäsittely nopeutti kukkimista etenkin pohjoisessa populaatiossa. Kukkimista edeltävä kylmävaatimus takaa, etteivät kasvit kuki syksyllä epäsuotuisissa olosuhteissa, vaan vasta keväällä talven jälkeen. Populaatioiden erilaistuminen kukkimisen päivänpituus- ja kylmävaatimuksessa selittyy todennäköisesti ainakin osittain kandidaattigeenien ekspressioeroilla. Tämän väitöskirjatyön tuloksia voidaan soveltaa monivuotisten viljelykasvien jalostuksessa tai ennustettaessa kasvipopulaatioiden sopeutumista ilmastonmuutokseen.

Abstract The study of speciation has been an area of primary interest in evolutionary biology from Darwin to the present day. Understanding the processes that give rise to new species requires knowledge on how reproductive isolation develops between diverging populations. An irreversible and therefore important component of reproductive isolation is intrinsic postzygotic isolation. Postzygotic incompatibilities often manifest themselves through hybrid inviability or sterility, and distort allelic transmission ratios in hybrid progenies. The genetic basis of such incompatibilities has often been found to be negative interactions between two or more loci, also known as Bateson-Dobzhansky-Muller incompatibilities. During the last decade some genes involved in this type of incompatibilities have been identified, but especially in plants our knowledge remains scarce. In this thesis I examined whether intrinsic postzygotic isolation had developed between allopatric populations of a perennial, outcrossing plant; Arabidopsis lyrata. The studied populations of A. lyrata were found to be genetically highly differentiated. In F2 progenies of crosses between populations many molecular markers reveal non-Mendelian genotype ratios, that is, show transmission ratio distortion (TRD). By contrast, TRD was found to be nearly absent in progenies of within population crosses. The degree of TRD clearly increased with genetic distance between the crossed populations, and origin for TRD was often in F1 gamete formation, instead of F2 zygotic level. The genetic basis of TRD appeared due to interactions between nuclear loci, and between nuclear and cytoplasmic factors. In addition to transmission ratio distortion, reduced male fertility and cytoplasmic male sterility was found in the F2 hybrids between A. lyrata subspecies petraea and lyrata. Quantitative trait loci for reduced male fertility were polymorphic within populations, and dependent on cytoplasm. Thus, the findings in this thesis underline the role of cytonuclear interactions, and the possibility of development of genic incompatibilities through genomic conflicts due to divergence likely unrelated to local adaptation. / Tiivistelmä Lajiutumistutkimus on ollut yksi evoluutiobiologian suurimmista kiinnostuksen kohteista Darwinin ajoista nykypäivään. Jotta voisimme ymmärtää uusien lajien syntymiseen johtavia prosesseja, on ensin ymmärrettävä, miten lisääntymisisolaatio kehittyy erilaistuvien populaatioiden välille. Lajien välisten risteytysten jälkeläiset ovat usein steriilejä tai elinkyvyttömiä. Tämä perustuu kahden erilaistuneen populaation perimän yhteensopimattomuuteen. Tällaiset sisäsyntyiset hedelmöityksen jälkeiset yhteensopimattomuudet ovat tärkeä osa lisääntymisisolaatiota, sillä ne ovat peruuttamattomia. Ne aiheuttavat vääristymiä genotyyppien lukusuhteissa risteytysjälkeläistöissä. Posttsygoottisen yhteensopimattomuuden taustalla on usein kahden tai useamman geenilokuksen välinen negatiivinen interaktio, jota kutsutaan myös Bateson-Dobzhansky-Muller -inkompatibiliteetiksi. Viime vuosikymmenen aikana on tunnistettu muutamia geenejä, jotka ovat mukana negatiivisissa interaktioissa, mutta kasveista tietoa geneettisistä tekijöistä on vielä vähän. Väitöstutkimuksessa selvitettiin onko geneettisiä posttsygoottisia yhteensopimattomuuksia kehittynyt kasvilajin sisällä (Arabidopsis lyrata) allopatristen populaatioiden välille. Tutkitut kasvipopulaatiot olivat geneettisesti hyvin erilaistuneita. Näiden populaatioiden välisten jälkeläistöjen genotyypeissä havaittiin yleisesti paljon mendelistisistä lukusuhteista poikkeavia lukusuhteita. Genotyyppejä tarkasteltiin myös populaation sisäisissä risteytyksissä, joiden jälkeläistöissä periytyminen oli lähes mendelististä. Väitöstutkimuksessa havaittiin, että mitä geneettisesti erilaisemmat populaatiot risteytettiin, sitä suurempi oli ei-mendelistisen periytymisen osuus. Tutkimukset osoittivat lukusuhteiden vääristyvän jo F1-hybridin tuottaessa sukupuolisoluja, eikä niinkään muodostuneissa uusissa F2-tsygooteissa. Taustalla olevien geneettisten yhteensopimattomuuksien havaittiin vaikuttavan tuman geenien välillä, mutta myös tuman ja soluliman geneettisten tekijöiden välillä. Mendelistisistä lukusuhteista poikkeamisen lisäksi tutkimuksessa havaittiin siitepölyn alentunut elinkyky ja solulimaan liittyvä koirassteriliteetti F2-jälkeläistössä A. lyrata alalajien petraea ja lyrata välillä. Lokukset, jotka vaikuttivat siitepölyn alentuneeseen elinkykyyn, olivat polymorfisia populaatioiden sisällä ja vuorovaikutuksessa soluliman geneettisten tekijöiden kanssa. Nämä tutkimustulokset korostavat tuman ja soluliman geenien vuorovaikutuksen tärkeyttä lajien välisten lisääntymisesteiden synnyssä. Ne myös osoittavat, että yhteensopimattomuus voi kehittyä mahdollisesti ilman luonnonvalinnan vaikutusta.

Abstract 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases (2-OGDDs) are an enzyme family that contains many enzymes that modify chromatin in extensive ways. These enzymes include several histone lysine demethylases (KDMs) and TET enzymes that convert methylated cytosine (5-mC) to 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) ultimately leading to DNA demethylation. Disturbed DNA and histone methylation are found in many cancers. However, the role of KDMs and TETs behind these oncogenic changes has so far not been fully investigated. This study focused on the role of these chromatin-modifying enzymes in cancers with special emphasis on enzyme kinetic studies. Cancers with inactivating fumarate hydratase (FH), succinate dehydrogenase (SDH) and isocitrate dehydrogenase (IDH) mutations accumulate fumarate, succinate and R-2-hydroxyglutarate, respectively. In this study we showed how these cancer-associated 2-oxoglutarate (2-OG) analogues can inhibit the TET enzymes and many of the KDMs leading to lower 5-hmC levels and increased H3K27 and H3K9 methylation on chromatin, respectively. We also characterized kinetic properties of acute myeloid leukaemia (AML)-associated TET2 mutants and found that their ability to bind 2-OG or iron was impaired leading to diminished catalytic activity. Tumours are often hypoxic due to inadequate vasculature and blood supply. The TET enzymes and KDMs require oxygen for the reactions they catalyse. We determined the oxygen affinity of TETs and many KDMs and found that a H3K27 demethylase KDM6A has a remarkably low affinity for oxygen indicating that it is inactivated in hypoxic tumours and tissues. H3K27 methylation was found to be increased in hypoxic cells and this blocked cell differentiation. Altogether, these studies shed light on the mechanisms behind the altered DNA and histone methylation found in several cancers with hypoxic conditions or FH, SDH and IDH mutations. Altered DNA and histone methylation has previously been associated with progression of cancer, such as epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). We now linked catalytic inhibition of 2-OGDDs to disturbed DNA and histone methylation that can account for altered cell differentiation, EMT and increased aggressiveness and invasiveness of cancers. / Tiivistelmä 2-oksoglutaraatista riippuvaiset dioksygenaasit ovat entsyymiperhe, johon kuuluu useita entsyymejä, jotka muokkaavat kromatiinin epigeneettisiä merkkejä monin tavoin. Näitä entsyymejä ovat mm. DNA:n demetylaatioon vaikuttavat TET-entsyymit sekä useat histonidemetylaasit. Vaikka muutoksia DNA:n ja histonien metylaatiotasoissa on havaittu useissa syövissä, ei näiden entsyymien roolia muutosten taustalla ole vielä tutkittu. Tämä tutkimus kohdistui näiden epigenetiikkaan vaikuttavien entsyymien roolin ymmärtämiseen syövissä keskittyen erityisesti kyseisten entsyymien kinetiikkaan. Useissa syövissä on havaittu fumaraattihydrataasin, sukkinaattidehydrogenaasin ja isositraattidehydrogenaasien aktiivisuuteen vaikuttavia mutaatioita, jotka johtavat fumaraatin, sukkinaatin ja R-2-hydroksiglutaraatin kertymiseen syöpäsoluihin. Tässä tutkimuksessa osoitimme, kuinka nämä karsinogeeniset 2-oksoglutaraattianalogit voivat inhiboida TET-entsyymejä ja histonidemetylaaseja, mikä alentaa 5-hydroksimetyylisytosiinitasoja ja lisää histonien metylaatiota. Näytämme myös, kuinka tietyillä akuutissa myelooisessa leukemiassa esiintyvillä TET2-mutanteilla on heikentynyt kyky sitoa 2-oksoglutaraattia tai rautaa, mikä johtaa entsyymien aktiivisuuden laskuun. Kasvainkudoksissa happipitoisuudet ovat usein matalia nopean kasvun ja puutteellisen verisuonituksen vuoksi. TET-entsyymit ja histonidemetylaasit vaativat happea katalysoimissaan reaktioissa. Määritimme TET-entsyymien ja monien histonidemetylaasien riippuvuutta hapesta ja osoitimme, että H3K27-histonidemetylaasi KDM6A on erittäin riippuvainen hapesta, mikä osoittaa, ettei se pysty toimimaan kasvaimissa ja kudoksissa, joissa happipitoisuudet ovat matalia. Huomasimme, että vähähappisissa olosuhteissa solujen H3K27 metylaatio on lisääntynyt, mikä johti erilaistumisen estymiseen soluissa. Tämä tutkimus paljasti uusia mekanismeja useista syövistä löytyneiden muuntuneiden DNA:n ja histonien metylaatiotasojen taustalla. Häiriintynyt DNA:n ja histonien metylaatio on aiemmin yhdistetty syöpien etenemiseen, erityisesti solujen erilaistumisen häiriintymisen kannalta. Tässä tutkimuksessa yhdistimme 2-oksoglutaraatista riippuvaisten entsyymien inhibition häiriintyneeseen DNA:n ja histonien metylaatioon, joka voi johtaa muuntuneeseen solujen erilaistumiseen ja lopulta lisääntyneeseen syöpien aggressiivisuuteen ja invasiivisuuteen.

Abstract Pulmonary fibrosis, lung cancer and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are severe diseases and common death causes worldwide. Due to the lack of an effective therapy, the investigation of cell biological mechanisms behind these diseases is essential. An activation of stromal cells, including myofibroblasts, is a main feature found in the pathogenesis of lung diseases. Myofibroblasts express alpha-smooth muscle actin (α-SMA), have specific ultrastructure, produce extracellular matrix proteins and possess contractile capacity. Detailed structure and function of myofibroblasts and their roles in healthy and diseased lung are not yet wholly understood. The investigation of the myofibroblasts may further offer novel tools for the acquisition of proper diagnosis, prognosis and medical treatment. The study aimed to characterize the ultrastructural, functional and disease-specific features of stromal cells, particularly myofibroblasts, in interstitial and malignant lung diseases. The functional properties evaluated here were differentiation, invasive and contractile properties. The study material included in vitro stromal cells cultured from bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. The appearance and location of myofibroblasts in different lung compartments of non-smokers and the COPD-patients were examined in vivo. The cells were investigated by light and electron microscopy. The α-SMA expression was analysed by gene or protein assays. The study demonstrated that stromal cells could be cultured from diagnostic BAL fluid samples and lung tissues. Cultured cells were a mixture of fibroblasts and myofibroblasts. A small proportion of cells exhibited progenitor-like features. Myofibroblasts revealed differential features in electron microscopy and invasive or contractile assays. When studying tissues from healthy and COPD lungs, myofibroblasts were located both in alveoli and airways. In alveoli myofibroblasts localized in widened alveolar tips which were newly described structures and locations of myofibroblasts in healthy and diseased lung. The amount of myofibroblasts in large airways, but not in peripheral lung, was increased in COPD. We concluded that myofibroblasts have several locations in normal and COPD lung, which suggests a function both in pulmonary regeneration and the pathogenesis of COPD. Smoking altered the phenotype of myofibroblasts regardless of its origin. / Tiivistelmä Keuhkofibroosi, keuhkosyöpä ja keuhkoahtaumatauti (COPD) ovat kansallisesti ja maailmanlaajuisesti yleisiä ja kuolemaan johtavia sairauksia. Taudinmääritys ja hoito ovat vaativia, eikä kaikille potilaille ole parantavaa hoitoa. Keuhkosairauksien kaikkia solubiologisia mekanismeja ei vielä tunneta, mikä on yksi syy lääkekehityksen ongelmiin. Interstitiaaleissa ja pahanlaatuisissa keuhkosairauksissa esiintyy paljon aktiivisia sidekudossoluja, kuten muuntuneita fibroblasteja eli myofibroblasteja. Ne tunnistetaan hienorakenteesta, jota voidaan tutkia elektronimikroskoopilla. Myofibroblastit ilmentävät myös solun sisäistä sileän lihaksen alfa-aktiinia (α-SMA), tuottavat sidekudoksen proteiineja ja kykenevät supistumaan. Myofibroblastien hienorakenteen ja toiminnan selvittäminen voi antaa lisätietoa keuhkosairauksien syntymekanismeista, jolloin diagnostiikkaa, ennustetta sekä hoitoja voidaan arvioida paremmin. Väitöskirjassa selvitettiin myofibroblastien hienorakennetta ja toimintaa eri keuhkosairauksissa. Tutkitut toiminnalliset ominaisuudet olivat erilaistumispotentiaali, invasiivisuus ja supistumiskyky. Sairauksien kliinistä käyttäytymistä ja potilaiden tupakointitottumuksia tarkasteltiin suhteessa solubiologiatason havaintoihin. Tutkimusmateriaali kerättiin taudinmäärityksen yhteydessä interstitiaalisia keuhkosairauksia, keuhkoahtaumatautia tai keuhkosyöpää sairastavilta potilailta. Tulosten mukaan bronkoalveolaarihuuhtelunesteestä (BAL) ja keuhkokudospaloista voidaan soluviljelymenetelmin kasvattaa ja ylläpitää solulinjoja. Viljellyt solut muodostivat sekasolupopulaatiota, joissa esiintyi pääosin fibroblasteja ja vaihteleva osuus myofibroblasteja. Pieni osa soluista ilmensi kantasoluille tyypillisiä piirteitä. Myofibroblastien tyyppipiirteet ja toiminnalliset ominaisuudet vaihtelivat taudeittain. Kudoksessa myofibroblasteja ilmentyi sekä keuhkorakkuloissa että ilmateissä. Keuhkorakkulatasolla myofibroblastit sijoittuivat irrallisten alveoliseinämien laajentuneisiin päihin, joita ei ole aiemmin tutkittu tieteellisessä kirjallisuudessa myofibroblastien yhteydessä. Keuhkoahtaumatauti ja tupakointi vähensivät näiden rakenteiden määrää perifeerisessä keuhkossa, kun taas suurissa ilmateissä keuhkoahtaumatauti lisäsi myofibroblasteja. Päättelimme, että myofibroblastit edistävät keuhkoahtaumataudin syntyä isoissa ilmateissä, mutta saattavat osallistua keuhkojen korjaukseen keuhkorakkuloissa ja pienissä ilmateissä.