Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000324875-Texto+Completo-0.pdf: 462529 bytes, checksum: 0fcad9bdd0ab101f8e4e8660f680797c (MD5) Previous issue date: 2004 / The aim of this study was to analyze the association between inflammation and anemia in patients submitted to chronic haemodialysis (HD) in a high-complexity university hospital. The prevalence of the inflammatory pattern (IP) in patients submitted to hemodialysis, in distinct complexity centers, was observed. The characteristics of individuals in HD with functional iron deficiency(FID) and infflammatory iron blockade(IIB) were evaluated. Changes in clinic and laboratory aspects of the IP were studied before and after ultrapure water introduction in HD. This was a cross-sectional study. IP means a serum iron < 60 mg/dL, a total iron binding capacity < 250μg/dL and a ferritin > 100 ng/dL. The prevalence of the IP was compared in 284 individuals submitted to chronic HD in 4 distinct complexity hospitals. To study properly the IP patient´s clinic and laboratory characteristics, the data were derived from individuals submitted to dialysis exclusively in a high complexity university hospital. These patients were initially divided in 2 groups (GA and GB), according to the N high sensitivity C-reactive protein(CRP) serum levels. Subsequently, patients from GB were also divided in 2 other groups (GB1 and GB2), according to the absence or presence of proved infection or inflammation. Prevalence of the IP was augmented in high complexity hospitals. When the IP patients were divided in 2 groups according to CRP levels, nearly 1/4 had normal CRP determinations. Individuals with normal CRP levels had no identified infection or inflammation, had no temporary access and less hospitalizations were required. hematocrit(Htc), hemoglobin(Hgb) and iron(Fe) were augmented, they received less blood transfusions and the mortality rate was significantly decreased. This pattern corresponds to FID. In the individuals with increased CRP levels, the need for temporary catheters increased. Infections and inflammations were more frequently seen and the prevalence of patients admitted to the hospital was augmented. Htc, Hgb and Fe determinations were significantly decreased. Blood transfusions and mortality were increased. These patients belong to the IIB group. When patients with elevated CRP and no specific infection or inflammation were analyzed, it was seen that everyone was dialyzed before ultra pure water implementation. After its introduction CRP levels became within normal limits. / O objetivo deste trabalho foi estudar inflamação e anemia em pacientes realizando hemodiálise crônica (HD) em hospital de referência. Estabeleceu-se a prevalência do padrão inflamatório(PI) em centros de diversas complexidades quanto à gravidade de pacientes atendidos, descreveu-se o perfil dos indivíduos com Deficiência Funcional do Ferro(DFF) e Bloqueio Inflamatório do Ferro(BIF), e avaliou-se a evolução clínica e laboratorial do padrão inflamatório com a introdução de água ultrapura em hemodiálise. O estudo foi transversal e descritivo. O PI correspondeu a ferro sérico < 60 mg/dL, capacidade ferropéxica < 250 μg/dL e ferritina > 100 ng/dL. A prevalência deste padrão foi estudada em 284 pacientes que realizavam HD em quatro hospitais de diferentes complexidades. Para estudar as características clínicas e laboratoriais dos pacientes com PI foram exclusivamente utilizados os dados dos pacientes de um centro de referência, divididos inicialmente em 2 grupos (GA e GB), de acordo com o nível sérico de proteína C reativa ultra-sensível(PCR). Posteriormente, os doentes do GB também foram divididos em 2 subgrupos (GB1 e GB2), de acordo com ausência ou presença de infecção ou inflamação clinicamente identificada. A prevalência do PI foi aumentada em hospitais de referência e maior complexidade. Aproximadamente um quarto dos pacientes com PI tinham PCR normal. Estes não apresentaram infecção ou inflamação explícitas, não portavam acessos temporários, e hospitalizaram menos. Tinham níveis de hematócrito (Htc), hemoglobina(Hgb) e ferro(Fe) mais elevados, receberam significativamente menos transfusões, e a taxa de mortalidade foi menor. Preenchiam os requisitos que os definiam como DFF. Nos pacientes com PCR aumentado houve necessidade de maior quantidade de acessos temporários, mais infecção-inflamação, e a prevalência de hospitalizações foi maior. Os níveis de Htc, Hgb e Fe foram significativamente menores. A quantidade de transfusões de sangue e a taxa de mortalidade foram maiores. Estes pacientes parecem se enquadrar no perfil BIF. Quando se analisou exclusivamente os com aumento do PCR, sem infecção ou inflamação específica, verificou-se que as dosagens foram obtidas antes da instalação do sistema de tratamento para obtenção de água ultrapura. Nestes pacientes, após a introdução de água ultrapura houve normalização dos níveis de PCR.

Poteínas recombinantes simples, como a insulina e o hormônio de crescimento humano, podem ser produzidas em microorganismos como bactérias Entretanto, para a produção de proteínas que precisam de modificações pós-traducionais, que não se consegue em microorganismos, torna-se importante o uso de biorreatores com culturas de células eucarióticas. Este sistema de produção é caro e a quantidade de proteína produzida é pequena. Como alternativa surgiu o uso de animais transgênicos para reduzir os custos de produção. A Eritropoietina humana é uma proteina glicosilada e representa um dos maiores gastos para tratamento de doenças humanas. Já foi produzida em camundongos, coelhos e suínos transgênicos, com problemas na glicosilação ou alteração da higidez do animal pela falha da região promotora do vetor de transgene em limitar a expressão para a glâmdula mamária. Este estudo teve como objetivo a produção de (rhEPO) no leite de camundongas transgênicas sob ação de dois diferentes vetores, nunca utilizados na sua produção. Os vetores com os promotores da alfa-lactalbumina e beta-lactoglobulina bovinos tiveram o gene da eritropoietina humana inserido entre as regiões promotora e codificadora do leite, num processo trabalhoso e pouco eficiente. Não foi possível inserir os vetores serão nas células tronco-embrionárias (CTE) de camundongos (USP-1) por eleroporação, mas as condições (390V por 80µs) foram testadas com vetor de fluorescência. Futuramente as CTE transgênicas serão agregadas aos embriões colhidos de camundongas superovuladas e após 24 horas de cultivo in vitro serão transferidos para camundongas pseudo-gestantes. Os animais nascidos (quimeras) serão acasalados e seus descendentes terão o DNA analisado para verificar a presença do gene da eritropoietina humana. Os animais positivos (fundadores) serão acasalados e as fêmeas positivas nascidas serão acompanhadas quanto à produção da eritropoietina humana no leite. Será purificada do leite, quantificada e avaliada quanto a glicosilação por Western Blottin. / Recombinant proteins such as insulin and human growth hormone can be produced by microorganisms. Although, to produce proteins that need pos-traductional modifications that can not be done by microorganisms, and a eucariotic cell bioreactor is needed. This production system is expensive and the amount of protein produced is low. As an alternative, the transgenic animal technology came up to reduce production fees. The human eritropoetin is a glicosilated protein and it is one of the most expensive to human treatment. It was already produced in transgenic mice, rabbit and swine but with glicosilation problems or health alterations by transgene vectors promoter region failure that limits the expression on mammary gland. This study aimed to produce recombinant human erythropoetin (rhEPO) in transgenic mice milk by two different vectors, never had been used to produce it before. Vectors with bovine alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin promoters had the human erythropoetin gene inserted between promoter and milk coding regions by a hard working and low efficiency technique. It was not possible to insert our vectors on mice embryonic stem cells (ESC) (USP-1) by electroporation but its conditions (390V, 80µs) were tested with fluorescent vector. In the future, transgenic ESC will be aggregated into mice embryos and after 24 hours of in vitro culture will be transferred to pseudo-pregnant mices. The new borns (chimera) will be mated and its offspring will have their DNA evaluated to verify the human eritropoetin gene occurrence. The founder animals will be also mated and the positive female borned will be evaluated for human erythrpoetin production on milk. It will be purified, quantified and evaluated for glicosilation by western blottin techinique.

Poteínas recombinantes simples, como a insulina e o hormônio de crescimento humano, podem ser produzidas em microorganismos como bactérias Entretanto, para a produção de proteínas que precisam de modificações pós-traducionais, que não se consegue em microorganismos, torna-se importante o uso de biorreatores com culturas de células eucarióticas. Este sistema de produção é caro e a quantidade de proteína produzida é pequena. Como alternativa surgiu o uso de animais transgênicos para reduzir os custos de produção. A Eritropoietina humana é uma proteina glicosilada e representa um dos maiores gastos para tratamento de doenças humanas. Já foi produzida em camundongos, coelhos e suínos transgênicos, com problemas na glicosilação ou alteração da higidez do animal pela falha da região promotora do vetor de transgene em limitar a expressão para a glâmdula mamária. Este estudo teve como objetivo a produção de (rhEPO) no leite de camundongas transgênicas sob ação de dois diferentes vetores, nunca utilizados na sua produção. Os vetores com os promotores da alfa-lactalbumina e beta-lactoglobulina bovinos tiveram o gene da eritropoietina humana inserido entre as regiões promotora e codificadora do leite, num processo trabalhoso e pouco eficiente. Não foi possível inserir os vetores serão nas células tronco-embrionárias (CTE) de camundongos (USP-1) por eleroporação, mas as condições (390V por 80µs) foram testadas com vetor de fluorescência. Futuramente as CTE transgênicas serão agregadas aos embriões colhidos de camundongas superovuladas e após 24 horas de cultivo in vitro serão transferidos para camundongas pseudo-gestantes. Os animais nascidos (quimeras) serão acasalados e seus descendentes terão o DNA analisado para verificar a presença do gene da eritropoietina humana. Os animais positivos (fundadores) serão acasalados e as fêmeas positivas nascidas serão acompanhadas quanto à produção da eritropoietina humana no leite. Será purificada do leite, quantificada e avaliada quanto a glicosilação por Western Blottin. / Recombinant proteins such as insulin and human growth hormone can be produced by microorganisms. Although, to produce proteins that need pos-traductional modifications that can not be done by microorganisms, and a eucariotic cell bioreactor is needed. This production system is expensive and the amount of protein produced is low. As an alternative, the transgenic animal technology came up to reduce production fees. The human eritropoetin is a glicosilated protein and it is one of the most expensive to human treatment. It was already produced in transgenic mice, rabbit and swine but with glicosilation problems or health alterations by transgene vectors promoter region failure that limits the expression on mammary gland. This study aimed to produce recombinant human erythropoetin (rhEPO) in transgenic mice milk by two different vectors, never had been used to produce it before. Vectors with bovine alpha-lactalbumin and beta-lactoglobulin promoters had the human erythropoetin gene inserted between promoter and milk coding regions by a hard working and low efficiency technique. It was not possible to insert our vectors on mice embryonic stem cells (ESC) (USP-1) by electroporation but its conditions (390V, 80µs) were tested with fluorescent vector. In the future, transgenic ESC will be aggregated into mice embryos and after 24 hours of in vitro culture will be transferred to pseudo-pregnant mices. The new borns (chimera) will be mated and its offspring will have their DNA evaluated to verify the human eritropoetin gene occurrence. The founder animals will be also mated and the positive female borned will be evaluated for human erythrpoetin production on milk. It will be purified, quantified and evaluated for glicosilation by western blottin techinique.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000445402-Texto+Completo-0.pdf: 4168826 bytes, checksum: 12e5afbd895c8db20632ed4bc6ddacbf (MD5) Previous issue date: 2012 / Background: Erythropoietin (EPO) and granulocyte colony stimulating factor (GCSF) have generated interest as novel therapies after myocardial infarction (MI), but the effect of combination therapy has not been studied in the large animal model. Objetives: We investigated the impact of prolonged combination therapy with EPO and GCSF on cardiac function, infarct size, and vascular density after MI in a porcine model. Methods: MI was induced in pigs by a 90 min balloon occlusion of the left anterior descending coronary artery. 16 animals were treated with EPO+GCSF, or saline (control group). Cardiac function was assessed by echocardiography and pressure-volume measurements at baseline, 1 and 6 weeks post-MI. Histopathology was performed 6 weeks post-MI. Results: At week 6, EPO+GCSF therapy stabilized left ventricular ejection fraction, (41±1% vs. 33±1%, p<0. 01) and improved diastolic function compared to the control group. Histopathology revealed increased areas of viable myocardium and vascular density in the EPO+GCSF therapy, compared to the control. Despite these encouraging results, in a historical analysis comparing combination therapy with monotherapy with EPO or GCSF, there were no significant additive benefits in the LVEF and volumes overtime using the combination therapy. Conclusion: Our findings indicate that EPO+GCSF combination therapy promotes stabilization of cardiac function after acute MI. However, combination therapy does not seem to be superior to monotherapy with either EPO or GCSF. / Introdução: Recentemente, a eritropoetina (EPO) e o fator estimulante de colônia de granulócitos (GCSF) surgiram como potenciais terapias no tratamento do infarto agudo do miocárdio (IAM). Contudo, os efeitos da terapia combinada ainda estão por ser investigados. Objetivo: Investigar a eficácia e segurança da terapia combinada com EPO e GCSF pós-IAM em um modelo porcino.Métodos: IAM foi induzido em porcos domésticos através da oclusão por 90 minutos da coronária descendente anterior esquerda. Dezesseis animais foram tratados com análogo de longa ação da EPO a GCSF ou solução salina (grupo controle). Função cardíaca foi avaliada via ecocardiografia e medidas de pressão-volume no inicio do estudo, uma e seis semanas após o IM. Histologia foi realizada seis semanas após o IAM. Resultados: Seis semanas após o IAM, a terapia combinada com EPO e GCSF demonstrou estabilizar a fração de ejeção ventricular esquerda (41±1% vs. 33±1%, p<0. 01) e melhorar a função diastólica quando comparada com o grupo controle. Avaliação histopatológica revelou aumento de áreas de miocárdio viável e de densidade vascular no grupo tratado com EPO e GCSF quando comparada com o grupo controle. Apesar dos resultados encorajadores, em uma avaliação histórica comparando a terapia combinada com a monoterapia com EPO ou GCSF, a terapia combinada não demonstrou ter beneficio adicional na preservação da fração de ejeção ou volumes ventriculares ao longo do período em estudo. Conclusão: Os presentes achados sugerem que a terapia combinada com EPO e GCSF promove a estabilização da função cardíaca após o IAM. Contudo, a terapia combinada não aprece ser superior a monoterapia com EPO ou GCSF.

A lesão de isquemia e reperfusão (IRI) continua a ser um problema clínico e o estresse do retículo endoplasmático (ERS) parece ser um importante mediador desse processo. A presença da heme oxigenase-1 (HO-1) ou do monóxido de carbono (CO), parece proteger da IRI. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar a papel da HO-1 e CO na IRI renal. A indução da HO-1 em camundongos promoveu uma proteção na IRI renal, com melhora da função renal, menos inflamação e atenuação do ERS. Ao avaliarmos o papel do CO, verificamos que há também uma proteção, mediada por p38, vias purinérgicas, estabilização de HIF-1a e eritropoietina. Há ainda uma melhora do metabolismo energético celular após o tratamento com CO. Enfim, podemos concluir que, na presença da HO-1 ou do CO, há uma melhora da lesão isquêmica, através de uma maior ativação de vias citoprotetoras, com atenuação do ERS, redução da inflamação e consequente melhora da função renal. / Ischemia-reperfusion injury (IRI) remains a clinical problem and endoplasmic reticulum stress (ERS) seems to be an important mediator of this process. The presence of heme oxygenase-1 (HO-1) or carbon monoxide (CO) appears to protect from IRI. The aim of our study was to evaluate the role of HO-1 and CO in renal IRI. The induction of HO-1 in mice promoted protection in renal IRI with improved renal function, less inflammation and attenuation of ERS. When evaluating the role of CO, we found that there is also a protection mediated by p38, purinergic signaling, HIF-1a stabilization and erythropoietin. There is still an improvement of cellular energy metabolism after treatment with CO. Finally, we conclude that, in the presence of HO-1 or CO, there is an improvement of the ischemic lesion, through greater activation of cytoprotective pathways, with reduced ERS, reducing inflammation and consequent improvement in renal function.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 324875.pdf: 462529 bytes, checksum: 0fcad9bdd0ab101f8e4e8660f680797c (MD5) Previous issue date: 2004-08-30 / O objetivo deste trabalho foi estudar inflama??o e anemia em pacientes realizando hemodi?lise cr?nica (HD) em hospital de refer?ncia. Estabeleceu-se a preval?ncia do padr?o inflamat?rio(PI) em centros de diversas complexidades quanto ? gravidade de pacientes atendidos, descreveu-se o perfil dos indiv?duos com Defici?ncia Funcional do Ferro(DFF) e Bloqueio Inflamat?rio do Ferro(BIF), e avaliou-se a evolu??o cl?nica e laboratorial do padr?o inflamat?rio com a introdu??o de ?gua ultrapura em hemodi?lise. O estudo foi transversal e descritivo. O PI correspondeu a ferro s?rico < 60 mg/dL, capacidade ferrop?xica < 250 &#956;g/dL e ferritina > 100 ng/dL. A preval?ncia deste padr?o foi estudada em 284 pacientes que realizavam HD em quatro hospitais de diferentes complexidades. Para estudar as caracter?sticas cl?nicas e laboratoriais dos pacientes com PI foram exclusivamente utilizados os dados dos pacientes de um centro de refer?ncia, divididos inicialmente em 2 grupos (GA e GB), de acordo com o n?vel s?rico de prote?na C reativa ultra-sens?vel(PCR). Posteriormente, os doentes do GB tamb?m foram divididos em 2 subgrupos (GB1 e GB2), de acordo com aus?ncia ou presen?a de infec??o ou inflama??o clinicamente identificada. A preval?ncia do PI foi aumentada em hospitais de refer?ncia e maior complexidade. Aproximadamente um quarto dos pacientes com PI tinham PCR normal. Estes n?o apresentaram infec??o ou inflama??o expl?citas, n?o portavam acessos tempor?rios, e hospitalizaram menos. Tinham n?veis de hemat?crito (Htc), hemoglobina(Hgb) e ferro(Fe) mais elevados, receberam significativamente menos transfus?es, e a taxa de mortalidade foi menor. Preenchiam os requisitos que os definiam como DFF. Nos pacientes com PCR aumentado houve necessidade de maior quantidade de acessos tempor?rios, mais infec??o-inflama??o, e a preval?ncia de hospitaliza??es foi maior. Os n?veis de Htc, Hgb e Fe foram significativamente menores. A quantidade de transfus?es de sangue e a taxa de mortalidade foram maiores. Estes pacientes parecem se enquadrar no perfil BIF. Quando se analisou exclusivamente os com aumento do PCR, sem infec??o ou inflama??o espec?fica, verificou-se que as dosagens foram obtidas antes da instala??o do sistema de tratamento para obten??o de ?gua ultrapura. Nestes pacientes, ap?s a introdu??o de ?gua ultrapura houve normaliza??o dos n?veis de PCR.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:35:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 445402.pdf: 4168826 bytes, checksum: 12e5afbd895c8db20632ed4bc6ddacbf (MD5) Previous issue date: 2012-12-20 / Background: Erythropoietin (EPO) and granulocyte colony stimulating factor (GCSF) have generated interest as novel therapies after myocardial infarction (MI), but the effect of combination therapy has not been studied in the large animal model.Objetives: We investigated the impact of prolonged combination therapy with EPO and GCSF on cardiac function, infarct size, and vascular density after MI in a porcine model.Methods: MI was induced in pigs by a 90 min balloon occlusion of the left anterior descending coronary artery. 16 animals were treated with EPO+GCSF, or saline (control group). Cardiac function was assessed by echocardiography and pressure-volume measurements at baseline, 1 and 6 weeks post-MI. Histopathology was performed 6 weeks post-MI.Results: At week 6, EPO+GCSF therapy stabilized left ventricular ejection fraction, (41?1% vs. 33?1%, p<0.01) and improved diastolic function compared to the control group. Histopathology revealed increased areas of viable myocardium and vascular density in the EPO+GCSF therapy, compared to the control. Despite these encouraging results, in a historical analysis comparing combination therapy with monotherapy with EPO or GCSF, there were no significant additive benefits in the LVEF and volumes overtime using the combination therapy.Conclusion: Our findings indicate that EPO+GCSF combination therapy promotes stabilization of cardiac function after acute MI. However, combination therapy does not seem to be superior to monotherapy with either EPO or GCSF / Introdu??o: Recentemente, a eritropoetina (EPO) e o fator estimulante de col?nia de granul?citos (GCSF) surgiram como potenciais terapias no tratamento do infarto agudo do mioc?rdio (IAM). Contudo, os efeitos da terapia combinada ainda est?o por ser investigados.Objetivo: Investigar a efic?cia e seguran?a da terapia combinada com EPO e GCSF p?s-IAM em um modelo porcino.M?todos: IAM foi induzido em porcos dom?sticos atrav?s da oclus?o por 90 minutos da coron?ria descendente anterior esquerda. Dezesseis animais foram tratados com an?logo de longa a??o da EPO a GCSF ou solu??o salina (grupo controle). Fun??o card?aca foi avaliada via ecocardiografia e medidas de press?o-volume no inicio do estudo, uma e seis semanas ap?s o IM. Histologia foi realizada seis semanas ap?s o IAM.Resultados: Seis semanas ap?s o IAM, a terapia combinada com EPO e GCSF demonstrou estabilizar a fra??o de eje??o ventricular esquerda (41?1% vs. 33?1%, p<0.01) e melhorar a fun??o diast?lica quando comparada com o grupo controle. Avalia??o histopatol?gica revelou aumento de ?reas de mioc?rdio vi?vel e de densidade vascular no grupo tratado com EPO e GCSF quando comparada com o grupo controle. Apesar dos resultados encorajadores, em uma avalia??o hist?rica comparando a terapia combinada com a monoterapia com EPO ou GCSF, a terapia combinada n?o demonstrou ter beneficio adicional na preserva??o da fra??o de eje??o ou volumes ventriculares ao longo do per?odo em estudo.Conclus?o: Os presentes achados sugerem que a terapia combinada com EPO e GCSF promove a estabiliza??o da fun??o card?aca ap?s o IAM. Contudo, a terapia combinada n?o aprece ser superior a monoterapia com EPO ou GCSF

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000443023-Texto+Completo-0.pdf: 2231703 bytes, checksum: 8fa714244d8e44469edc5dc83e9b3038 (MD5) Previous issue date: 2012 / Injuries to the peripheral nervous system present a challenge for regenerative medicine. The study investigated the effects of platelet-rich plasma (PRP) and erythropoietin (EPO), alone or in combination, in the regeneration of peripheral nerve in rats. The work was developed in three phases using 70 rats. The first phase, evaluated the platelet concentration and growth factors production/release (TGF-β, PDGF, VEGF and αβ) in three protocols for obtaining PRP (A, B and C) obtained by aortic or cardiac puncture. Cardiac puncture in association with A protocol showed the best results. In the second stage, using best results methods at the first stage, was produced two PRP concentrations (1,000,000 and 2,000,000 platelets. μl-1; PRP1 and PRP2, respectively) for applying in the rats sciatic nerve. Comparison of concentrations with autologous nerve graft (ANG) and saline solution (SS) groups showed benefits in the use of PRP2. In the third phase (same experimental model) were added PRP2 + EPO and EPO groups. The animals of phases 1 and 2 were evaluated by walking track test and histomorphometric analysis (toluidine blue) and showed benefits in autologous nerve graft (ANG) with respect to tubulization (independent of regenerative factor). For tubularized animals, the study showed advantages for PRP and EPO simultaneous use followed by EPO group. Finally, it was observed that PRP 2,000,000 platelets. μl-1 has beneficial effects when compared to PRP 1,000,000 platelets. μl-1 for peripheral neuroregeneration rats. / Lesões ao sistema nervoso periférico representam um desafio para a medicina regenerativa. O estudo objetivou conhecer os efeitos do plasma rico em plaquetas (PRP) e da eritropoietina (EPO), isolados ou combinados, na regeneração do nervo periférico de ratos. O trabalho desenvolveu-se em três etapas utilizando 70 ratos. A primeira fase avaliou a concentração plaquetária e produção/liberação de fatores de crescimento (TGF-β, PDGF-αβ e VEGF) em três protocolos de obtenção do PRP (A, B e C) obtidos por punção aórtica ou cardíaca. A punção cardíaca em associação com protocolo A gerou os melhores resultados. Na segunda fase, usando os métodos com melhores resultados na primeira etapa, produziram-se duas concentrações de PRP (1. 000. 000 e 2. 000. 000 plaquetas. μl-1; PRP1 e PRP2, respectivamente) para aplicação no nervo ciático tubulizado de ratos. Comparação das concentrações entre si e com grupos auto enxerto (AE) e solução fisiológica (SF) evidenciaram benefícios no uso de PRP2. Na terceira fase (mesmo modelo experimental), foram adicionados os grupos EPO e EPO+PRP2. Os animais das fases 1 e 2 foram avaliados por teste de marcha e histomorfometria (azul de toluidina) e demonstraram que o auto enxerto apresentou benefícios sobre a tubulização (independente do fator regenerativo utilizado). Para os animais tubulizados, o estudo demostrou melhores resultados para o uso simultâneo de PRP e EPO, seguido do grupo EPO. Finalizando, observou-se que a aplicação de PRP na concentração de 2. 000. 000 plaquetas. μl-1 em comparação com 1. 000. 000 platelets. μl- 1 apresentou vantagens para neuroregeneração periférica de ratos.

A lesão de isquemia e reperfusão (IRI) continua a ser um problema clínico e o estresse do retículo endoplasmático (ERS) parece ser um importante mediador desse processo. A presença da heme oxigenase-1 (HO-1) ou do monóxido de carbono (CO), parece proteger da IRI. O objetivo do nosso trabalho foi avaliar a papel da HO-1 e CO na IRI renal. A indução da HO-1 em camundongos promoveu uma proteção na IRI renal, com melhora da função renal, menos inflamação e atenuação do ERS. Ao avaliarmos o papel do CO, verificamos que há também uma proteção, mediada por p38, vias purinérgicas, estabilização de HIF-1a e eritropoietina. Há ainda uma melhora do metabolismo energético celular após o tratamento com CO. Enfim, podemos concluir que, na presença da HO-1 ou do CO, há uma melhora da lesão isquêmica, através de uma maior ativação de vias citoprotetoras, com atenuação do ERS, redução da inflamação e consequente melhora da função renal. / Ischemia-reperfusion injury (IRI) remains a clinical problem and endoplasmic reticulum stress (ERS) seems to be an important mediator of this process. The presence of heme oxygenase-1 (HO-1) or carbon monoxide (CO) appears to protect from IRI. The aim of our study was to evaluate the role of HO-1 and CO in renal IRI. The induction of HO-1 in mice promoted protection in renal IRI with improved renal function, less inflammation and attenuation of ERS. When evaluating the role of CO, we found that there is also a protection mediated by p38, purinergic signaling, HIF-1a stabilization and erythropoietin. There is still an improvement of cellular energy metabolism after treatment with CO. Finally, we conclude that, in the presence of HO-1 or CO, there is an improvement of the ischemic lesion, through greater activation of cytoprotective pathways, with reduced ERS, reducing inflammation and consequent improvement in renal function.

Para produção de biofármacos protéicos, como a eritropoietina recombinante humana (EPOrh), são necessárias alterações pós-traducionais adequadas que garantam a sua especificidade e atividade biológica. Essas características são obtidas apenas em biorretores baseados em células eucarióticas, como as da glândula mamária. Sistemas baseados nesse tipo celular, tanto in vivo quanto in vitro, já são utilizados para produção estratégica e viável de proteínas recombinantes biologicamente ativas. Assim, tanto o estabelecimento de novas linhagens de células mamárias que apresentem boa expressão protéica quanto o desenvolvimento de sistemas in vivo que utilizem a estrutura da glândula mamária para essa produção de proteínas recombinantes são de grande valia. O presente trabalho teve como objetivo comparar dois métodos de estabelecimento de uma cultura de células de glândula mamárias ovinas, enzimático e não enzimático, e verificar sua capacidade de expressão das proteínas do leite &beta;-lactoglobulina, &alpha;-caseína, &beta;-caseína e &kappa;-caseína mediante o tratamento com SFB (soro fetal bovino) ou SOL (soro de ovelha lactante), na presença ou não de Matrigel. Para isso, foi realizado um experimento in vitro, no qual foi estabelecido o cultivo celular até a passagem 12 (P12) de duas linhagens celulares: digerida (LD) e não digerida (LND). Para a LD na P12 foi observado apenas um tipo celular, o qual era positivo para a marcação com vimentina. Essa linhagem apresentou expressão gênica de &beta;-caseína e &beta;-lactoglobulina apenas quando tratada com meio de cultivo acrescido de SFB, sendo a expressão inferior (P=0,001) ao grupo da LND submetido ao mesmo tratamento. Já a LND, quando tratada com meio adicionado com SFB expressou &kappa;-caseína além da &beta;-caseína e &beta;-lactoglobulina. A troca do SFB do meio de cultivo por SOL aumentou a expressão gênica de &beta;-lactoglobulina (P=0,001) para ambas linhagens. Foi realizada a curva de crescimento para LD e LND na P12 com o meio de cultivo acrescido com SFB ou SOL. Para a LND observou-se o efeito do meio na velocidade de crescimento celular, sendo que foi maior para o grupo tratado com SFB (P&lt;0,05). Para a LD, não ocorreu o efeito do meio na velocidade de crescimento celular (P&gt;0,05), não sendo observada diferença com a LND tratada com SOL (P&gt;0,05). A LND apresentou marcação positiva para a presença de vimentina e citoqueratina. Este trabalho visou, ainda, estabelecer um sistema de produção da EPOrh no leite de ovelhas não transgênicas pela técnica de infusão intra-mamária in vivo de dois plasmídeos diferentes e verificar a secreção qualitativa desta proteína por Western-blotting. Assim, foi feito um experimento in vivo no qual glândulas mamárias de ovelhas foram transfectadas com dois plasmídeos diferentes: ALAC (n=2), BGL (n=2) e controle negativo (n=2). Após a infusão dos plasmídeos, foi realizada a eletroporação de cada teto (3 choques de 500 volts com a duração de 15ms cada, sendo realizada a inversão da polaridade). Os animais foram ordenhados durante 20 dias após a transfecção, porém não foi possível detectar a presença de EPOrh nas amostras de leite analisadas. O limiar de detecção do teste utilizado foi de 67,5pg de EPOrh (Eritromax&reg;) em leite controle negativo de ovelha. Concluindo, foi possível estabelecer o cultivo in vitro das LD e LND com capacidade de expressar proteínas do leite, sendo a expressão da &beta;-lactoglobulina aumentada pelo tratamento com SOL. Ambas as linhagens apresentaram marcação positiva para vimentina, mas apenas LND para citoqueratina. Ainda, para o experimento in vivo, não foi possível detectar a expressão de EPOrh no leite das ovelhas transfectadas com os plasmídeos ALAC e BGL. / Some post-translational modifications are necessary for the production of biopharmaceutical proteins, such as recombinant human erythropoietin (rhEPO), with a good specific action and a high biological activity. These modifications are obtained only by bioreactors based on eukaryotic cell as mammary cells. Bioreactors, in vivo or in vitro, with this kind of cell have been used for a viable and strategic production of biologically active recombinant proteins. For this reason, the establishment of a new line of mammary cells with high milk protein expression and the development of systems for production of recombinant proteins by the mammary gland in vivo are essential studies. One of the main objectives of this study was to compare two methods, enzymatic and non-enzymatic, to establish ovine mammary cells culture and verify their gene expression of milk proteins such as &beta;-lactoglobulin, &alpha;-casein, &beta;-casein and &kappa;-casein with different treatments: LOS (lactating ovine serum) or FBS (fetal bovine serum) added to the culture medium, in the presence or absence of Matrigel&reg;. In this manner, an in vitro study was performed and the culture of two lines were established, digested (DL) and non-digested (NDL), of ovine mammary cell until the passage 12 (P12). In DL was observed just one cellular type that was positive for staining with vimentin. This cell line expressed &beta;-lactoglobulin and &beta;-casein genes with the FBS treatment and without Matrigel. The gene expression was lower (P=0,001) when compared to the NDL under the same conditions of culture. Then, the NDL expressed &beta;-lactoglobulin, &beta;-casein and &kappa;-casein genes when treated with FBS without Matrigel. The treatment with LOS in the culture medium increased the gene expression of &beta;-lactoglobulin for both cell lines. The growth curve was determined with both cell lines in P12 with FBS or LOS treatment. For the NDL, the type of medium had effect on the cell growth speed and was highest with the FBS treatment (P&lt;0,05). However, the medium did not have effect on growth speed of LD (P&gt;0,05) and no difference was observed at the NDL treated with LOS (P&gt;0,05). The NDL was positive for staining with vimentin and cytokeratin. The second main objective of this study was to establish an in vivo system for the production of rhEPO in milk of non-transgenic ewes by the intra-mammary infusion of two different plasmids and verify the qualitative milk secretion of this protein by western-blotting. In this way, in the in vivo experiment ovine mammary glands were transfected with two different plasmids: ALAC (n=2), BGL (n=2) and negative control (n=2). Each half udder was filled with plasmid solution and three 3 electric pulses of 500 volts were applied for 15ms each, followed by another three pulses with reversed polarity. The three animals were milked for 20 days after transfection, nevertheless it was not possible to identify rhEPO in any milk sample. The test threshold to identify rhEPO (Eritromax&reg;) in milk from a negative control animal was 67,5pg. In conclusion, the in vitro culture of NDL and DL was established up to the P12 with expression of milk protein and the LOS treatment increased the expression of &beta;-lactoglobulin. The two cell lines culture were positive for staining of vimentina but only NDL was positive for cytokeratin. In the in vivo experiment, rhEPO secretion was not detected in the milk from ewes transfected with ALAC and BGL plasmids.