Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de pós-graduação em Saúde Animal, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-05-23T13:41:25Z No. of bitstreams: 1 2014_ReginaldoBomfimAzevedo.pdf: 604936 bytes, checksum: 40713c4e255a3c18cfc64f671c1344dd (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-05-23T15:57:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ReginaldoBomfimAzevedo.pdf: 604936 bytes, checksum: 40713c4e255a3c18cfc64f671c1344dd (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-23T15:57:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ReginaldoBomfimAzevedo.pdf: 604936 bytes, checksum: 40713c4e255a3c18cfc64f671c1344dd (MD5) / Foram estudadas a origem e distribuição dos nervos isquiáticos direito e esquerdo em 30 natimortos, 12 machos e 18 fêmeas, de ovinos da raça Santa Inês. Os animais foram fixados com solução aquosa de formaldeído a 10% através de injeções intramusculares e intracavitárias. Por meio de dissecação verificou-se que o nervo isquiático direito foi formado pelos ramos ventrais de L6, S1 e S2 em todas os animais. O nervo isquiático esquerdo apresentou a mesma formação do direito em 29 indivíduos e em um animal teve também a participação de S3 na sua formação. Os nervos isquiáticos distribuíram-se nos músculos da região glútea, caudal e lateral da coxa. Os ramos terminais foram identificados como nervos tibial, fibular comum e cutâneo lateral da sura. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / We studied the origin and distribution of right and left isquiadic nerves in fetuses, males and females, from Santa Inês sheep breed. The animals were fixed with formaldehyde aqueous solution of 10% was used syringe needle and 60 ml of 40/12 to carry out the application of the solution in all muscles, cavities: thoracic, abdominal and pelvic, and intracranial. By means of dissection it was found that the right sciatic nerve was formed by the ventral branches L6, S1 and S2 for all samples. The left sciatic nerve showed the same formation on the right 29 animals and one animal had also the participation of S3. Distribution occurred in the muscles of the gluteal region, caudal and lateral thigh. The terminal branches were identified as nerve tibial, fibular and lateral cutaneous sura.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000437576-Texto+Completo-0.pdf: 3153412 bytes, checksum: 4288c104a29a899cfdb4c5faac9a5303 (MD5) Previous issue date: 2012 / Objective: This study evaluates the effect of Platelet Rich Plasma (PRP) and Platelet Rich Fibrin (PRF) on peripheral nerve repair, comparing the results to the gold-standard (autologous nerve graft) and to the control group with saline solution. Materials and Methods: Thirty six Wistar rats were used in the study, and four of these were blood donors to obtain the PRP and the PRF. The Injuries were made on the sciatic nerve from the left paw with 10mm long gap and they were repaired with one of the four treatments: Autologous nerve grafts (ANG); tubulization with saline solution (TS); tubulization with PRP; tubulization with PRF. Walking track analysis were performed at pre-operative period, 30, 60 and 90 days after surgery. On the 90 postoperative day, the rats were euthanized and histomorphometric analysis were made measuring the fiber diameter, axonal diameter and the myelin sheath thickness. Results: On 90 days post-operative, the ANG, PRF and PRP groups presented a significant functional improvement in relation to the TS group (p = 0. 000), which showed functional deficit. On the histomorpometric test, the ANG group presented a better structural organization, with a regular distribution among the myelinated fibers, and little conjunctive tissue between the fibers. The TS, PRP and PRF groups had a larger endoneural tissue between the nerve fibers and presented degenerative process. The ANG group achieved a larger nerve fiber diameter at the proximal segment while comparing with the TS (p = 0. 037), and also comparing with the PRF (p = 0. 001) and the PRP (p = 0. 002) while analyzing the medial segments. About the axonal diameter and the myelin sheath thickness, no statistical significant difference has been found between the groups. Conclusion: This research data suggests that PRP and PRF have positive effects on functional nerve recovery, presenting results similar to the ANG group. However, the PRP and PRF don’t achieve a significant improvement on the histomorphometric analysis. / Objetivo: Avaliar o efeito do uso de Plasma rico em plaquetas (PRP) e de Plaqueta rica em fibrina (PRF) no reparo de nervos periféricos, comparando com os resultados do padrão-ouro (enxerto autólogo) e com grupo controle (solução salina).Materiais e Métodos: Trinta e seis ratos Wistar foram utilizados no estudo, sendo quatro ratos utilizados apenas como doadores de sangue para obtenção de PRP e PRF. Foram criadas lesões de 10mm nos nervos ciáticos da pata esquerda dos ratos, e estas foram reparadas com um dos 4 tipos de tratamentos: enxerto autólogo (AE); tubulização com solução salina (TS); tubulização com PRP; tubulização com PRF. Foram realizados Testes de marcha no período pré-operatório, 30, 60 e 90 dias pós-operatórios. Após 90 dias, os ratos foram eutanásiados e foram realizadas análises histomorfométricas avaliando diâmetro das fibras, diâmetro axonal e espessura de bainha de mielina. Resultados: Com 90 dias pós-operatórios, os grupos AE, PRF e PRP demonstraram uma melhora funcional significativa em relação ao grupo TS (p = 0,000), que continuou apresentando déficit na marcha. Na histomorfometria, o grupo AE apresentou uma melhor organização estrutural, com distribuição regular das fibras mielinizadas, com pouco tecido conjuntivo entre as fibras. Os grupos TS, PRP e PRF demonstraram maior espaço endoneural entre as fibras nervosas e a presença de processos degenerativos. O grupo AE demonstrou maior diâmetro de fibra nervosa no segmento proximal quando comparado ao grupo TS (p = 0,037), e também apresentou maior diâmetro de fibra em relação ao grupo PRF (P = 0,001) e PRP (P = 0,002), quando comparados os segmentos medianos. Quanto ao diâmetro axonal e espessura da bainha de mielina, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre nenhum dos grupos. Conclusão: Os dados deste estudo sugerem que tanto o PRP quando o PRF possuem efeito positivo na recuperação funcional nervosa, apresentando resultados funcionais similares aos encontrados pelo grupo AE. Porém, não apresentam melhora significativa nas análises histomorfométricas.

A dor neuropática ocorre como resultado de uma lesão ao sistema nervoso. Clinicamente, sua causa está relacionada, na maioria dos casos, ao comprometimento dos nervos periféricos, por isso a utilização de modelos animais de lesão nervosa periférica é amplamente aceita para o seu estudo. A medula espinal representa o centro de processamento primário da informação nociceptiva e a fisiopatologia da dor neuropática envolve principalmente o mecanismo de sensibilização central. Esse fenômeno é caracterizado pelo aumento na resposta das células do corno dorsal espinal aos estímulos aferentes. Diversas moléculas estão envolvidas nesse mecanismo e, recentemente, as espécies ativas do oxigênio (EAO) têm sido sugeridas como possíveis mediadores da dor neuropática. Para verificar essa relação, o presente estudo avaliou os efeitos temporais da secção do nervo ciático sobre marcadores de estresse oxidativo e nitrosativo e de defesas antioxidantes na medula espinal lombossacral de ratos, bem como a ativação da Akt. Os animais foram dividos nos grupos denervado (secção do nervo ciático), sham (o nervo foi exposto, porém, não seccionado) e controle (sem nenhum procedimento cirúrgico). Inicialmente os animais foram testados quanto à hiperalgesia térmica através do teste da placa quente. Foi demonstrado que 3 dias após a lesão, os animais sham e denervados apresentaram-se hiperalgésicos, mas aos 7 dias apenas os denervados ainda exibiam esta resposta. Aos 15 dias após a lesão, a hiperalgesia já havia sido revertida em todos os grupos estudados. As defesas antioxidantes enzimáticas foram avaliadas pela medida da atividade e da expressão das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase. A atividade da catalase reduziu aos 3 e 7 dias após a cirurgia nos animais sham e denervados, e a atividade da SOD diminuiu apenas nos animais denervados no período de 7 dias após a lesão. A expressão dessas enzimas, medida por Western blot, não apresentou variações. Para a determinação de lipoperoxidação foi realizada a medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a qual não apresentou diferenças entre os grupos estudados. Esses resultados iniciais sugerem que o procedimento cirúrgico, por estimular os aferentes nociceptivos dos tecidos relacinados, é suficiente para diminuir a atividade antioxidante enzimática da medula espinal, porém, essas alterações são mais expressivas nos animais submetidos à axotomia. Após, foi realizado o estudo de outras enzimas antioxidantes, a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa-S-transferase (GST), e também do principal antioxidante não-enzimático, a glutationa (GSH). A atividade da GST na medula não foi alterada pela lesão nervosa, e a atividade da GPx aumentou 3 dias após a cirurgia nos grupos sham e denervado, juntamente com a redução do conteúdo de glutationa. A queda da glutationa deve ser atribuída à maior atividade da GPx, que a utiliza como substrato na redução do peróxido de hidrogênio (H2O2) a água. Nessa etapa, foi determinada ainda a expressão da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e a medida dos metabólitos do óxido nítrico (NOx). A expressão da nNOS mostrou-se aumentada 7 dias após a lesão nos animais denervados. A formação de NOx foi maior nos períodos de 1, 7 e 15 dias após a axotomia. Esses resultados sustentam o envolvimento do óxido nítrico na dor neuropática. Na última parte deste trabalho foi realizada a medida da concentração do H2O2 na medula espinal, que apresentou aumento nos animais sham e denervados 1, 7 e 15 dias após a cirurgia. Também foi avaliada, por Western blot, a expressão dos adutos de Michael formados pelo 4- hidroxinonenal (HNE) e da Akt total e fosforilada. Aos 7 dias após a lesão nervosa houve um aumento na expressão da Akt total e dos adutos de Michael formados pelo HNE. A Akt fosforilada apresentou um aumento na sua expressão 1, 3 e 7 dias após a axotomia. Como o HNE é um produto da lipoperoxidação, pode-se afirmar que a lesão nervosa estimula este processo na medula espinal. A ativação da Akt, entretanto, pode ser um indicativo de proteção para as células nervosas, pois esta proteína participa de cascatas de sinalização relacionadas à sobrevivência celular. A partir do presente trabalho pode-se concluir que a estimulação nociceptiva induzida pela cirurgia causa alterações em sistemas antioxidantes como a catalase, a GSH e a GPx, bem como na produção de H2O2 na medula espinal, o que não é específico da lesão neuropática. Contudo, a dor neuropática está relacionada com a redução da atividade da SOD e o aumento na produção de HNE e de NO. Assim, após a lesão nervosa ocorre formação de EAO, as quais podem atuar como sinalizadores na modulação do processamento nociceptivo na medula espinal e, talvez, interferir em mecanismos neuroprotetores, como, por exemplo, pela ativação da Akt. / Neuropathic pain occurs as result of nervous system injury. Clinically, in almost all cases, its etiology is related to impairment of peripheral nerves. Thus, animal models of peripheral nerve injury are widely accepted to neuropathic pain studies. The spinal cord is the center of primary processing of the nociceptive information and the pathophysiology of the neuropathic pain involves mainly a central sensitization mechanism. This phenomenon is characterized by an increased response of spinal dorsal horn cells to afferent stimulus. Many molecules are involved in this mechanism and, recently, reactive oxygen species (ROS) have been suggested as putative mediators of neuropathic pain. In order to verify this relationship, the present study evaluated the temporal effects of sciatic nerve transection on oxidative and nitrosative stress markers, antioxidant defenses and Akt activation in the lumbossacral spinal cord of rats. Animals were divided in three groups: naïve, sham and sciatic nerve transection (SNT). Initially, hot plate test was performed to evaluate hyperalgesia. It was demonstrate hyperalgesia 3 days after injury in sham and SNT groups. At 7 days, only SNT animals exhibited this response and 15 days after injury the hyperalgesia was reverted in all groups. The enzymatic antioxidant defenses were evaluated by means of superoxide dismutase (SOD) and catalase activities and expression. The catalase activity was decreased at 3 and 7 days after surgery in sham and SNT group, and SOD activity was reduced only in SNT rats at 7 days after injury. No changes were observed in SOD and catalase expression, measured by Western blot. In order to evaluate lipid peroxidation (LPO), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were analyzed, and no differences among the groups were shown. These results demonstrated that the injury modifies antioxidant enzymatic activity in spinal cord. Afterwards, other antioxidant enzymes, glutathione peroxidase (GPx) and glutathione-S-transferase (GST) and the main non-enzymatic antioxidant, glutathione (GSH), also were studied. GST activity was not changed after nerve injury. There was an increase in GPx activity and a decrease in GSH content 3 days after surgery in both sham and SNT groups. The decrease in GSH may be attributed to the increase in GPx activity, since GSH is necessary to reduction of hydrogen peroxide (H2O2) to water catalyzed by GPx. The expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and the determination of nitric oxide metabolites (NOx) also were conducted. nNOS expression increased 7 days after SNT. NOx production was higher at 1, 7 and 15 days after axotomy. These results emphasize the involvement of nitric oxide in neuropathic pain. In the last part of this study, the measurement of H2O2 in spinal cord was conducted, showing an increase in sham and SNT animals at 1, 7 and 15 days after surgery. It was also evaluated, by Western blot, the 4-hydroxy-2-nonenal (HNE)-Michael adducts and the total and phospho-Akt. At 7 days, there was an increase in total-Akt expression and HNE-Michael adducts. Phospho-Akt expression increased 1, 3 and 7 days after axotomy. HNE is a lipid peroxidation product, thus, may be suggested that nerve injury stimulates this process in spinal cord. However, the Akt activation may be a means of protection to nerve cells, since this protein participate of signal cascades related to cell survival. In summary, the results of present study show that the peripheral nerve injury interferes in the systems related to oxidative stress, besides activate cell survival mechanisms. In conclusion, nociceptive stimulation induced by surgery causes changes in antioxidants systems such as catalase, GSH and GPx, as well in H2O2 production in spinal cord, which is not specific to neuropathic injury. However, neuropathic pain is related with SOD activity decrease and HNE and NO production increase. Thus, after nerve injury occur ROS formation which can act as signaling molecules in nociceptive processing modulation in spinal cord and, maybe, interferes in neuroprotection mechanisms, such as Akt activation.

A dor neuropática ocorre como resultado de uma lesão ao sistema nervoso. Clinicamente, sua causa está relacionada, na maioria dos casos, ao comprometimento dos nervos periféricos, por isso a utilização de modelos animais de lesão nervosa periférica é amplamente aceita para o seu estudo. A medula espinal representa o centro de processamento primário da informação nociceptiva e a fisiopatologia da dor neuropática envolve principalmente o mecanismo de sensibilização central. Esse fenômeno é caracterizado pelo aumento na resposta das células do corno dorsal espinal aos estímulos aferentes. Diversas moléculas estão envolvidas nesse mecanismo e, recentemente, as espécies ativas do oxigênio (EAO) têm sido sugeridas como possíveis mediadores da dor neuropática. Para verificar essa relação, o presente estudo avaliou os efeitos temporais da secção do nervo ciático sobre marcadores de estresse oxidativo e nitrosativo e de defesas antioxidantes na medula espinal lombossacral de ratos, bem como a ativação da Akt. Os animais foram dividos nos grupos denervado (secção do nervo ciático), sham (o nervo foi exposto, porém, não seccionado) e controle (sem nenhum procedimento cirúrgico). Inicialmente os animais foram testados quanto à hiperalgesia térmica através do teste da placa quente. Foi demonstrado que 3 dias após a lesão, os animais sham e denervados apresentaram-se hiperalgésicos, mas aos 7 dias apenas os denervados ainda exibiam esta resposta. Aos 15 dias após a lesão, a hiperalgesia já havia sido revertida em todos os grupos estudados. As defesas antioxidantes enzimáticas foram avaliadas pela medida da atividade e da expressão das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase. A atividade da catalase reduziu aos 3 e 7 dias após a cirurgia nos animais sham e denervados, e a atividade da SOD diminuiu apenas nos animais denervados no período de 7 dias após a lesão. A expressão dessas enzimas, medida por Western blot, não apresentou variações. Para a determinação de lipoperoxidação foi realizada a medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a qual não apresentou diferenças entre os grupos estudados. Esses resultados iniciais sugerem que o procedimento cirúrgico, por estimular os aferentes nociceptivos dos tecidos relacinados, é suficiente para diminuir a atividade antioxidante enzimática da medula espinal, porém, essas alterações são mais expressivas nos animais submetidos à axotomia. Após, foi realizado o estudo de outras enzimas antioxidantes, a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa-S-transferase (GST), e também do principal antioxidante não-enzimático, a glutationa (GSH). A atividade da GST na medula não foi alterada pela lesão nervosa, e a atividade da GPx aumentou 3 dias após a cirurgia nos grupos sham e denervado, juntamente com a redução do conteúdo de glutationa. A queda da glutationa deve ser atribuída à maior atividade da GPx, que a utiliza como substrato na redução do peróxido de hidrogênio (H2O2) a água. Nessa etapa, foi determinada ainda a expressão da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e a medida dos metabólitos do óxido nítrico (NOx). A expressão da nNOS mostrou-se aumentada 7 dias após a lesão nos animais denervados. A formação de NOx foi maior nos períodos de 1, 7 e 15 dias após a axotomia. Esses resultados sustentam o envolvimento do óxido nítrico na dor neuropática. Na última parte deste trabalho foi realizada a medida da concentração do H2O2 na medula espinal, que apresentou aumento nos animais sham e denervados 1, 7 e 15 dias após a cirurgia. Também foi avaliada, por Western blot, a expressão dos adutos de Michael formados pelo 4- hidroxinonenal (HNE) e da Akt total e fosforilada. Aos 7 dias após a lesão nervosa houve um aumento na expressão da Akt total e dos adutos de Michael formados pelo HNE. A Akt fosforilada apresentou um aumento na sua expressão 1, 3 e 7 dias após a axotomia. Como o HNE é um produto da lipoperoxidação, pode-se afirmar que a lesão nervosa estimula este processo na medula espinal. A ativação da Akt, entretanto, pode ser um indicativo de proteção para as células nervosas, pois esta proteína participa de cascatas de sinalização relacionadas à sobrevivência celular. A partir do presente trabalho pode-se concluir que a estimulação nociceptiva induzida pela cirurgia causa alterações em sistemas antioxidantes como a catalase, a GSH e a GPx, bem como na produção de H2O2 na medula espinal, o que não é específico da lesão neuropática. Contudo, a dor neuropática está relacionada com a redução da atividade da SOD e o aumento na produção de HNE e de NO. Assim, após a lesão nervosa ocorre formação de EAO, as quais podem atuar como sinalizadores na modulação do processamento nociceptivo na medula espinal e, talvez, interferir em mecanismos neuroprotetores, como, por exemplo, pela ativação da Akt. / Neuropathic pain occurs as result of nervous system injury. Clinically, in almost all cases, its etiology is related to impairment of peripheral nerves. Thus, animal models of peripheral nerve injury are widely accepted to neuropathic pain studies. The spinal cord is the center of primary processing of the nociceptive information and the pathophysiology of the neuropathic pain involves mainly a central sensitization mechanism. This phenomenon is characterized by an increased response of spinal dorsal horn cells to afferent stimulus. Many molecules are involved in this mechanism and, recently, reactive oxygen species (ROS) have been suggested as putative mediators of neuropathic pain. In order to verify this relationship, the present study evaluated the temporal effects of sciatic nerve transection on oxidative and nitrosative stress markers, antioxidant defenses and Akt activation in the lumbossacral spinal cord of rats. Animals were divided in three groups: naïve, sham and sciatic nerve transection (SNT). Initially, hot plate test was performed to evaluate hyperalgesia. It was demonstrate hyperalgesia 3 days after injury in sham and SNT groups. At 7 days, only SNT animals exhibited this response and 15 days after injury the hyperalgesia was reverted in all groups. The enzymatic antioxidant defenses were evaluated by means of superoxide dismutase (SOD) and catalase activities and expression. The catalase activity was decreased at 3 and 7 days after surgery in sham and SNT group, and SOD activity was reduced only in SNT rats at 7 days after injury. No changes were observed in SOD and catalase expression, measured by Western blot. In order to evaluate lipid peroxidation (LPO), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were analyzed, and no differences among the groups were shown. These results demonstrated that the injury modifies antioxidant enzymatic activity in spinal cord. Afterwards, other antioxidant enzymes, glutathione peroxidase (GPx) and glutathione-S-transferase (GST) and the main non-enzymatic antioxidant, glutathione (GSH), also were studied. GST activity was not changed after nerve injury. There was an increase in GPx activity and a decrease in GSH content 3 days after surgery in both sham and SNT groups. The decrease in GSH may be attributed to the increase in GPx activity, since GSH is necessary to reduction of hydrogen peroxide (H2O2) to water catalyzed by GPx. The expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and the determination of nitric oxide metabolites (NOx) also were conducted. nNOS expression increased 7 days after SNT. NOx production was higher at 1, 7 and 15 days after axotomy. These results emphasize the involvement of nitric oxide in neuropathic pain. In the last part of this study, the measurement of H2O2 in spinal cord was conducted, showing an increase in sham and SNT animals at 1, 7 and 15 days after surgery. It was also evaluated, by Western blot, the 4-hydroxy-2-nonenal (HNE)-Michael adducts and the total and phospho-Akt. At 7 days, there was an increase in total-Akt expression and HNE-Michael adducts. Phospho-Akt expression increased 1, 3 and 7 days after axotomy. HNE is a lipid peroxidation product, thus, may be suggested that nerve injury stimulates this process in spinal cord. However, the Akt activation may be a means of protection to nerve cells, since this protein participate of signal cascades related to cell survival. In summary, the results of present study show that the peripheral nerve injury interferes in the systems related to oxidative stress, besides activate cell survival mechanisms. In conclusion, nociceptive stimulation induced by surgery causes changes in antioxidants systems such as catalase, GSH and GPx, as well in H2O2 production in spinal cord, which is not specific to neuropathic injury. However, neuropathic pain is related with SOD activity decrease and HNE and NO production increase. Thus, after nerve injury occur ROS formation which can act as signaling molecules in nociceptive processing modulation in spinal cord and, maybe, interferes in neuroprotection mechanisms, such as Akt activation.

A dor neuropática ocorre como resultado de uma lesão ao sistema nervoso. Clinicamente, sua causa está relacionada, na maioria dos casos, ao comprometimento dos nervos periféricos, por isso a utilização de modelos animais de lesão nervosa periférica é amplamente aceita para o seu estudo. A medula espinal representa o centro de processamento primário da informação nociceptiva e a fisiopatologia da dor neuropática envolve principalmente o mecanismo de sensibilização central. Esse fenômeno é caracterizado pelo aumento na resposta das células do corno dorsal espinal aos estímulos aferentes. Diversas moléculas estão envolvidas nesse mecanismo e, recentemente, as espécies ativas do oxigênio (EAO) têm sido sugeridas como possíveis mediadores da dor neuropática. Para verificar essa relação, o presente estudo avaliou os efeitos temporais da secção do nervo ciático sobre marcadores de estresse oxidativo e nitrosativo e de defesas antioxidantes na medula espinal lombossacral de ratos, bem como a ativação da Akt. Os animais foram dividos nos grupos denervado (secção do nervo ciático), sham (o nervo foi exposto, porém, não seccionado) e controle (sem nenhum procedimento cirúrgico). Inicialmente os animais foram testados quanto à hiperalgesia térmica através do teste da placa quente. Foi demonstrado que 3 dias após a lesão, os animais sham e denervados apresentaram-se hiperalgésicos, mas aos 7 dias apenas os denervados ainda exibiam esta resposta. Aos 15 dias após a lesão, a hiperalgesia já havia sido revertida em todos os grupos estudados. As defesas antioxidantes enzimáticas foram avaliadas pela medida da atividade e da expressão das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase. A atividade da catalase reduziu aos 3 e 7 dias após a cirurgia nos animais sham e denervados, e a atividade da SOD diminuiu apenas nos animais denervados no período de 7 dias após a lesão. A expressão dessas enzimas, medida por Western blot, não apresentou variações. Para a determinação de lipoperoxidação foi realizada a medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a qual não apresentou diferenças entre os grupos estudados. Esses resultados iniciais sugerem que o procedimento cirúrgico, por estimular os aferentes nociceptivos dos tecidos relacinados, é suficiente para diminuir a atividade antioxidante enzimática da medula espinal, porém, essas alterações são mais expressivas nos animais submetidos à axotomia. Após, foi realizado o estudo de outras enzimas antioxidantes, a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa-S-transferase (GST), e também do principal antioxidante não-enzimático, a glutationa (GSH). A atividade da GST na medula não foi alterada pela lesão nervosa, e a atividade da GPx aumentou 3 dias após a cirurgia nos grupos sham e denervado, juntamente com a redução do conteúdo de glutationa. A queda da glutationa deve ser atribuída à maior atividade da GPx, que a utiliza como substrato na redução do peróxido de hidrogênio (H2O2) a água. Nessa etapa, foi determinada ainda a expressão da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e a medida dos metabólitos do óxido nítrico (NOx). A expressão da nNOS mostrou-se aumentada 7 dias após a lesão nos animais denervados. A formação de NOx foi maior nos períodos de 1, 7 e 15 dias após a axotomia. Esses resultados sustentam o envolvimento do óxido nítrico na dor neuropática. Na última parte deste trabalho foi realizada a medida da concentração do H2O2 na medula espinal, que apresentou aumento nos animais sham e denervados 1, 7 e 15 dias após a cirurgia. Também foi avaliada, por Western blot, a expressão dos adutos de Michael formados pelo 4- hidroxinonenal (HNE) e da Akt total e fosforilada. Aos 7 dias após a lesão nervosa houve um aumento na expressão da Akt total e dos adutos de Michael formados pelo HNE. A Akt fosforilada apresentou um aumento na sua expressão 1, 3 e 7 dias após a axotomia. Como o HNE é um produto da lipoperoxidação, pode-se afirmar que a lesão nervosa estimula este processo na medula espinal. A ativação da Akt, entretanto, pode ser um indicativo de proteção para as células nervosas, pois esta proteína participa de cascatas de sinalização relacionadas à sobrevivência celular. A partir do presente trabalho pode-se concluir que a estimulação nociceptiva induzida pela cirurgia causa alterações em sistemas antioxidantes como a catalase, a GSH e a GPx, bem como na produção de H2O2 na medula espinal, o que não é específico da lesão neuropática. Contudo, a dor neuropática está relacionada com a redução da atividade da SOD e o aumento na produção de HNE e de NO. Assim, após a lesão nervosa ocorre formação de EAO, as quais podem atuar como sinalizadores na modulação do processamento nociceptivo na medula espinal e, talvez, interferir em mecanismos neuroprotetores, como, por exemplo, pela ativação da Akt. / Neuropathic pain occurs as result of nervous system injury. Clinically, in almost all cases, its etiology is related to impairment of peripheral nerves. Thus, animal models of peripheral nerve injury are widely accepted to neuropathic pain studies. The spinal cord is the center of primary processing of the nociceptive information and the pathophysiology of the neuropathic pain involves mainly a central sensitization mechanism. This phenomenon is characterized by an increased response of spinal dorsal horn cells to afferent stimulus. Many molecules are involved in this mechanism and, recently, reactive oxygen species (ROS) have been suggested as putative mediators of neuropathic pain. In order to verify this relationship, the present study evaluated the temporal effects of sciatic nerve transection on oxidative and nitrosative stress markers, antioxidant defenses and Akt activation in the lumbossacral spinal cord of rats. Animals were divided in three groups: naïve, sham and sciatic nerve transection (SNT). Initially, hot plate test was performed to evaluate hyperalgesia. It was demonstrate hyperalgesia 3 days after injury in sham and SNT groups. At 7 days, only SNT animals exhibited this response and 15 days after injury the hyperalgesia was reverted in all groups. The enzymatic antioxidant defenses were evaluated by means of superoxide dismutase (SOD) and catalase activities and expression. The catalase activity was decreased at 3 and 7 days after surgery in sham and SNT group, and SOD activity was reduced only in SNT rats at 7 days after injury. No changes were observed in SOD and catalase expression, measured by Western blot. In order to evaluate lipid peroxidation (LPO), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were analyzed, and no differences among the groups were shown. These results demonstrated that the injury modifies antioxidant enzymatic activity in spinal cord. Afterwards, other antioxidant enzymes, glutathione peroxidase (GPx) and glutathione-S-transferase (GST) and the main non-enzymatic antioxidant, glutathione (GSH), also were studied. GST activity was not changed after nerve injury. There was an increase in GPx activity and a decrease in GSH content 3 days after surgery in both sham and SNT groups. The decrease in GSH may be attributed to the increase in GPx activity, since GSH is necessary to reduction of hydrogen peroxide (H2O2) to water catalyzed by GPx. The expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and the determination of nitric oxide metabolites (NOx) also were conducted. nNOS expression increased 7 days after SNT. NOx production was higher at 1, 7 and 15 days after axotomy. These results emphasize the involvement of nitric oxide in neuropathic pain. In the last part of this study, the measurement of H2O2 in spinal cord was conducted, showing an increase in sham and SNT animals at 1, 7 and 15 days after surgery. It was also evaluated, by Western blot, the 4-hydroxy-2-nonenal (HNE)-Michael adducts and the total and phospho-Akt. At 7 days, there was an increase in total-Akt expression and HNE-Michael adducts. Phospho-Akt expression increased 1, 3 and 7 days after axotomy. HNE is a lipid peroxidation product, thus, may be suggested that nerve injury stimulates this process in spinal cord. However, the Akt activation may be a means of protection to nerve cells, since this protein participate of signal cascades related to cell survival. In summary, the results of present study show that the peripheral nerve injury interferes in the systems related to oxidative stress, besides activate cell survival mechanisms. In conclusion, nociceptive stimulation induced by surgery causes changes in antioxidants systems such as catalase, GSH and GPx, as well in H2O2 production in spinal cord, which is not specific to neuropathic injury. However, neuropathic pain is related with SOD activity decrease and HNE and NO production increase. Thus, after nerve injury occur ROS formation which can act as signaling molecules in nociceptive processing modulation in spinal cord and, maybe, interferes in neuroprotection mechanisms, such as Akt activation.

Made available in DSpace on 2014-06-12T22:57:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1461_1.pdf: 1715536 bytes, checksum: 08234a92099f516b78ff379b3750a0f3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Faculdade Maurício de Nassau / Neste estudo avaliou-se o efeito do exercício físico sobre a instalação da neuropatia periférica em ratos com diabetes experimental. Foram utilizados 40 ratos machos, adultos, da linhagem Wistar. Estes foram divididos em 4 grupos: controle sedentário (GCS), controle exercitado (GCE), diabético sedentário (GDS), diabético exercitado (GDE). A indução do diabetes foi realizada nos animais, com 60 dias de vida, através da administração intraperitoneal de estreptozotocina, dose única de 60 mg/kg. O protocolo de exercício constou de natação durante 6 semanas. Na primeira semana os animais começavam com 10 minutos e a cada dia ocorria um acréscimo de mais 10 minutos, terminando a primeira semana com treino 50 minutos. Nas cinco semanas seguintes o treino era realizado por 60 minutos, 5x/sem. Semanalmente eram registrados a glicemia, o peso, a velocidade de condução nervosa (VCN) e a amplitude do potencial de ação do nervo caudal. Após as 6 semanas os animais foram anestesiados com solução de Cloridato de ketamina (50 mg) e de Xilasina a 2% (20 mg) (0,2 mL/100g), em seguida o nervo ciático, foi dissecado e cortado proximalmente, seguindo para uma pré-fixação realizada com solução Karnowisky por 24h a 4°C, depois pós-fixado com solução de tetróxido de ósmio e processado para obtenção de cortes semi-finos (0,5&#956;m), corados com azul de toluidina. Foram avaliadas a área de secção transversa do nervo ciático, a quantidade, densidade e o tipo de fibras nervosas mielínicas de 4 animais de cada grupo, escolhido aleatoriamente. A análise estatística foi realizada utilizando a média dos valores ± desvio-padrão e o teste T Student para dados paramétricos, e valores da mediana ± erro-padrão e teste Teste U de Mann-Whitney para dados não paramétricos, sendo p < 0,05; para análise dos valores eletrofisiológicos utilizou-se ANOVA, confiabilidade de 0,05. Ao final do experimento podemos perceber que os animais do GDS apresentaram peso significativamente mais baixo que os do GCS. Após a indução do diabetes os níveis glicêmicos dos animais diabéticos mostraram-se significativamente maior que os do grupo controle. Ao final do experimento o grupo diabético exercitado apresentou glicemia significativamente menor em relação ao grupo diabético não exercitado. A VCN demonstrou não diferir entre os grupos diabéticos, porém quando comparamos grupo diabético com sedentários os primeiros apresentaram VCN mais baixas. Em relação aos parâmetros avaliados: número de fibras mielínicas, área de secção transversa do nervo ciático e densidade de fibras mielinizadas, ao se comparar os valores entre os grupos diabéticos, controle, sedentários e exercitados não encontramos nenhuma diferença. As fibras estudadas foram classificadas em pequenas, intermediárias e grandes. Ao se comparar o número de fibras intermediárias entre os grupos sedentários houve uma diferença significativa nos valores de suas médias. A comparação entre os grupos com os demais tipos de fibras não apresentou diferença Diante destes resultados, pode-se concluir que o tempo do experimento foi suficiente para causar uma neuropatia periférica nos ratos diabéticos, contudo por ser a neuropatia uma patologia de origem multifatorial, neste estudo percebemos que o processo de mielinização não foi comprometido

Made available in DSpace on 2014-06-12T22:59:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4212_1.pdf: 1452578 bytes, checksum: 5964dcfa660561cbf15ca5725d7420e7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Avaliou-se a regeneração nervosa periférica, em animais adultos que foram submetidos à desnutrição protéica durante o período conhecido por janela crítica de desenvolvimento. Utilizamos 20 ratos machos, adultos, da linhagem Wistar. Durante o período de aleitamento, partes das mães receberam dieta hipoproteica (caseína 8%) formando o grupo de filhotes desnutridos (10 animais), enquanto outra parte recebeu dieta normoproteica (caseína 17%), formando o grupo de filhotes normonutridos (10 animais). Após este período, os animais foram alimentados com dieta padrão de biotério até o término do experimento, sem restrições de água e comida. A evolução ponderal foi registrada diariamente durante 21 dias de vida, e após este período registrada aos 30, 60, 90 e 210 dias. Aos 90 dias de vida, os animais (05 por grupo) foram pré-anestesiados com Atropina e anestesiados com solução de Cloridato de ketamina (50 mg) e de Xilasina a 2% (20 mg) (0,2 mL/100g). O nervo ciático foi seccionado aproximadamente 1 cm anteriormente à bifurcação dos nervos tibial posterior e fibular comum. Após a lesão, os fragmentos nervosos foram suturados, a um tubo de polietileno (10 mm) preenchido com solução salina e matrigel. De acordo com a presença ou não da lesão nervosa, os animais foram divididos nos grupos Nutrido Sem Lesão (GNSL), Nutrido Lesão (GNL), Desnutrido Sem Lesão (GDSL) e Desnutrido Lesão (GDL). Cento e vinte dias após a lesão nervosa foi coletado o tecido nervoso neoformado, fixado em solução Karnowisky por 24h a 4°C, pósfixados com solução de tetróxido de ósmio e processados para obtenção de cortes semi-finos (0,5&#956;m), corados com azul de toluidina. Foram avaliadas a área de secção transversa do nervo ciático, a quantidade, densidade e o tipo de fibras nervosas mielínicas e o número total de vasos sanguíneos. A análise estatística foi realizada utilizando a média dos valores ± desvio-padrão e o teste T Student para dados paramétricos, e valores da mediana ± erro-padrão e teste Teste U de Mann- Whitney para dados não paramétricos, sendo p < 0,05. O peso corporal manteve-se reduzido a partir do 3° dia de vida e por todo o experimento no grupo desnutrido. Não foram observadas diferenças dos parâmetros analisados entre os grupos GNSL e GDSL. Observou-se um aumento na quantidade de vasos no GDL (p = 0,0022) em relação ao GNL. O grupo GNSL em relação ao GNL apresentou uma maior área de secção transversa (p = 0,0002), maior quantidade de fibras mielínicas (p = 0,004), menor densidade de fibras (p=0,009) e maior proporção de fibras de tamanho intermediário (p < 0,05), entretanto houve uma menor quantidade de vasos sanguíneos (p = 0,01). O GDL apresentou padrão regenerativo semelhante em relação ao GNL. Diante destes resultados, pode-se concluir que nos animais adultos, submetidos a desnutrição protéica durante o período de aleitamento, com posterior período de reposição nutricional, não houve alterações na estrutura do tecido nervoso periférico, assim como na resposta regenerativa diante da injúria deste tecido, após 120 dias de lesão

Os nervos periféricos são freqüentemente lesionados por lesão mecânica direta, doenças metabólicas ou tumores. As lesões dos NPs resultam em perda parcial ou total das funções motoras, sensoriais e vegetativas no segmento corporal envolvido. Ratos machos adultos Wistar foram divididos em três grupos: controle (n=7), sham (n=25) e crush (n=25). Todos os grupos foram submetidos à avaliação termográfica, funcional e histológica. A ∆ T do grupo crush foi diferente do grupo controle no 1°, 3°e 7° dia pós-operatório, e do grupo sham no 1°, 3°e 28° dia pós-operatório (p0.05). No grupo crush, a recuperação funcional retornou ao aos valores normais entre a 3ª e 4ª semanas após a lesão, enquanto a análise morfológica do nervo mostrou uma regeneração incompleta na 4ª semana após a lesão. Este estudo é a primeira demonstração que a temperatura da pele é aumentada pela compressão do nervo ciático e esta mudança provavelmente não é correlacionada com a recuperação funcional.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000419178-Texto+Completo-0.pdf: 2007989 bytes, checksum: be7bf028f4f59c8aac1c686ee0ecf9f8 (MD5) Previous issue date: 2009 / Introduction: Treatment of peripheral nerve loss is still a non-resolved problem. In the experimental research area, animal’s models have been used, with long nerve defects, in order to study the effect of different substances with capacity of promote nerve regeneration when incorporated inside of nerve conduits. As a measure of nerve regeneration, a functional effect it’s considered as the most important effect measurement, being the Sciatic Function Index (SFI) the most employed method after sciatic nerve injury in rats; however, its use has been questioned in models of nerve transection (neurotmeses). The objective of the present study is to study SFI behavior in a transection model, with a long gap of 12 mm, in rat’s sciatic nerve with the aim of verify if the SFI is a reliable tool to differentiate recovery patterns of function and nerve regeneration after long sciatic nerve defects. Methods: Thirty young adult female Wistar rats were divided in 5 groups, in which a nerve gap was created, with a gap of 12 mm in right sciatic nerve, after that, the nerve gap was repaired using autograft, or using a silicone nerve conduit, filled with fibrin glue at which bone derived stromal cells, nerve growth factor or a combination of both was added. As a functional measure the SFI was recorded each week since the fifth until the sixteen. Results: Of 24 animals operated with tubes 21 failed to reconstitute a nerve inside the conduit (87, 5%). Of the three animals that showed nerve bridging inside the conduit, neither shown any difference in the SFI score compare with animals without nerve growth. All animals repaired with silicone tube showed absence of improvement in SFI score during all time of follow up. After 16 weeks, the average SFI±SD of the 4 groups with tube was -77,88±8,3, and this average score was statistically lower than the autograft group, that was -56,97±12,71, with a p value =0,003. Even when this difference was significant, the autograft group showed a recovery of only 43% of its normal value, after 16 weeks of follow up. Discussion: The difference after 16 weeks of SFI score founded between groups with null effect (tube) and the best effect actually possible (autograft), was statistically significant, however the low precision of the measure and the low amplitude of possible values founded between them, cause that its method has low power. Conclusions: The SFI is not a reliable method to measure nerve repair after long nerve gap (12mm) in a sciatic nerve injury model in rats, because its low power to detect true differences. / Introdução: O tratamento de lesões com perda dos nervos periféricos é ainda um problema não resolvido. Na área de pesquisa experimental, modelos animais com perdas nervosas de grande porte têm sido usados com o objetivo de estudar o efeito de sustâncias promotoras da regeneração axonal adicionadas dentro de sistemas de tubulização. Como medida de regeneração nervosa, o efeito funcional é considerado como o mais importante – o índice funcional da marcha, ou Sciatic Function Index (SFI), é o método mais utilizado nas lesões de nervo ciático em ratos; seu uso, porém, tem sido questionado em modelos de transecção nervosa (neurotmese). O objetivo do presente trabalho experimental é estudar o desempenho do SFI, em um modelo de transecção e perda de grande porte (12 mm) em nervo ciático de ratos, com o fim de verificar se a utilização do SFI é uma ferramenta confiável para diferenciar padrões de recuperação funcional e regeneração nervosa após perdas segmentares de grande porte em ratos. Métodos: Foram utilizadas 30 fêmeas de ratos Wistar, adultos, isogênicos, divididos em 5 grupos, nos quais se realizou uma perda de 12 mm do nervo ciático direito. Posteriormente, tal perda foi reparada com auto-enxerto ou com tubo de silicone preenchido com uma matriz de fibrina, onde se adicionaram células mononucleares de medula óssea (CMMO), fator de crescimento neural (NGF) ou uma combinação destes. O índice funcional da marcha (SFI) foi medido entre as 5° e 16° semanas após a cirurgia. Resultados: Do total de ratos tratados com tubo, 21 dos 24 animais falharam em reconstituir nervo no tubo (87,5%). Os três animais em que se evidenciou crescimento de nervo dentro do tubo não mostraram diferenças no SFI em relação aos outros em que não cresceu nervo. Todos os animais com tubulização mostraram ausência de recuperação funcional no SFI durante o seguimento. Depois de 16 semanas, a média do SFI± DP dos 4 grupos com tubo foi -77,88 ± 8,3, obtendo valores significativamente piores aos obtidos com auto-enxertos, com média SFI ±DP, -56,97±12,71, com valor p=0,003. Ainda que a diferença tenha sido significativa, o grupo com auto-enxerto apresentou uma melhoria limitada: 43% do valor considerado normal, após 16 semanas de observação. Discussão: As diferenças do SFI encontradas entre os grupos com ausência de efeito (tubo) e o melhor efeito possível (auto-enxerto) foi significativa (p=0,003); porém, a baixa precisão da estimativa e a baixa amplitude de valores encontrada entre eles determinam um método com baixo poder. Conclusões: O índice funcional da marcha (SFI) não é um método adequado para avaliar regeneração nervosa após lesões com perda segmentar de 12 mm em nervo ciático de rato, por ter um baixo poder para detectar verdadeiras diferenças.

Os exercícios físicos têm sido empregados em estudos clínicos experimentais com o propósito de estimular a regeneração nervosa periférica, entretanto estas pesquisas não examinam os efeitos de tipos específicos de exercícios sobre a regeneração das fibras nervosas periféricas. Neste estudo, testamos os possíveis efeitos de um programa de treinamento aeróbico, de resistência muscular e a combinação de ambos os programas (durante 5 semanas) na regeneração do nervo ciático em ratos após lesão nervosa por compressão, utilizando análises funcional e morfométrica. Os resultados obtidos neste estudo indicam que o treinamento aeróbico melhora a recuperação funcional, desde a primeira semana de treino, e a diferenciação morfológica do nervo ciático em regeneração após 5 semanas de treinamento quando comparado com os animais lesionados sedentários. Por outro lado, o treinamento de resistência muscular e a combinação dos treinos aeróbico e de resistência, ou seja, treinamento concorrente, retardam a recuperação funcional, embora não a impeçam. Além disso, 5 semanas de treinamento de resistência muscular e concorrente não melhoram a diferenciação morfológica do nervo ciático em regeneração quando comparado com os animais do treinamento aeróbico. Neste estudo, a diferenciação dos nervos em regeneração dos ratos que realizaram treinamento de resistência muscular e concorrente foi similar à dos animais lesionados sedentários. Estes dados provêm evidências de que o treinamento aeróbico tem um grande potencial para promover a recuperação funcional e melhorar a diferenciação do nervo ciático em regeneração após lesões traumáticas experimentais, e que os treinamentos de resistência muscular e concorrente parecem retardar a recuperação funcional e não interferir na diferenciação das fibras nervosas em regeneração do nervo ciático lesionado.