CARDOSO, Kátia Virgínia Viana. Neuropatia autonômica induzida por cisplatina e vincristina em ratos : estudo funcional, eletrofisiológico e morfológico. 2011. 207 f. Tese (Doutorado em Ciências Médicas) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-18T16:13:57Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_kvvcardoso.pdf: 3035688 bytes, checksum: fdb4257953afd13eb283502f6c6479dc (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-05-18T16:18:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_kvvcardoso.pdf: 3035688 bytes, checksum: fdb4257953afd13eb283502f6c6479dc (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-18T16:18:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_kvvcardoso.pdf: 3035688 bytes, checksum: fdb4257953afd13eb283502f6c6479dc (MD5) Previous issue date: 2011 / Introduction: Chemotherapeutic agents are chemical compounds used for the treatment of cancer. The efficacy of chemotherapy is limited by its side effects such as nephro, neuro, hepato and ototoxicity. Cisplatin and vincristine are chemotherapy drugs and their use is limited by peripheral neuropathy with autonomic, sensory and/or motor involvement. Aims: We evaluated the effect of cisplatin and vincristine on the gastric emptying (GE), gastrointestinal (GI) transit of liquid, baroreflex function, thermal and mechanical withdrawal latencies, electrophysiological parameters of sympathetic neurons and morphology of nerve and muscle tissues in rats. Methods: Vincristine sulphate, cisplatin or saline were injected into the tail vein. Cisplatin was administered at doses of 0.5 mg/Kg (5 doses), 1 mg/kg (2-5 doses) or 2 mg/kg (1, 2 or 5 doses) daily and vincristine was administered at the doses of 50 µg/kg (5 doses), 100µg/kg (2-5 doses) or 150 µg/kg (1, 2 or 5 doses) every other day, both drugs administered in male Wistar rats (200-250g). Next day, they were gavage-fed with a test meal (0.5 mg/ml of phenol red in 5% glucose solution) and were sacrificed 10 minutes later. The recovery of phenol red in the stomach and intestine was determined by spectrophotometry. Peak values of basal mean arterial pressure (MAP) and heart rate (HR) after i.v. phenylephrine 5 mg/kg and atropine 0.5 mg/kg were used to evaluate the baroreflex responses. Animals were subjected to hot plate testing to evaluate changes in the thermal pain threshold and for the assessment of mechanical threshold and allodynia, an dynamic plantar aesthesiometer based on the von Frey filament principle was used. Differences were evaluated by One-Way ANOVA with P<0.05. Results: Cisplatin increased the GE of liquid with doses ≥ 2 mg/Kg by 59.7-77.4% and this GE delay was not present two weeks after the treatment with 5 doses of cisplatin at 1 mg/kg. Vincristine increased the GE of liquid with doses ≥ 250 µg/kg by 54.5 – 69.3% and this GE delay was not present one week after the treatment with 5 doses of vincristine at 150 µg/kg. Cisplatin also enhanced baroreflex gain possibly by increasing sympathetic activity. Phenylephrine-induced bradycardia was enhanced suggesting sympathetic dysfunction and after infusion of atropine (0.5 mg/kg) heart rate changes related this drug infusion were still more prominent in cisplatin-treated rats than controls. Cisplatin changed the excitability of sympathetic neurons of the superior cervical ganglion and the morphology of autonomic and somatic ganglia and the vargus nerve in rats. Vincristine enhanced the HR reduction induced by phenylephrine and atropine (P<0.05). Conclusion: Our results demonstrated that cisplatin and vincristine induced autonomic neuropathy courses with delayed GE, altered baroreflex responses and increased colonic weight. Cisplatin altered mechanical threshold but not thermal, and autonomic neuropathy preceded this changes, in rats treated with vincristine sensory neuropathy preceded and outlasted the autonomic changes. / Introdução: Quimioterápicos são compostos químicos utilizados para o tratamento de câncer. A eficácia destes compostos é limitada pelos efeitos colaterais como nefro, neuro, hepato e ototoxicidade. Cisplatina e vincristina são quimioterápicos de uso limitado que causam neuropatia periférica com alterações autonômicas, sensitivas e/ou motoras. Objetivos: Avaliar os efeitos do tratamento com cisplatina e vincristina no esvaziamento gástrico, trânsito intestinal de líquidos, na função barorreflexa, nas latências térmica e mecânica, nos parâmetros eletrofisiológicos de neurônios simpáticos e na morfologia de tecidos nervosos e musculares em ratos. Métodos: Sulfato de vincristina, cisplatina ou salina foram injetados na veia da cauda. Cisplatina foi administrada nas doses de 0,5 mg/kg (5 doses), 1 mg/kg (2-5 doses) ou 2 mg/kg (1, 2 ou 5 doses) diariamente e vincristina administrada nas doses de 50 µg/kg (5 doses), 100µg/kg (2-5 doses) ou 150 µg/kg (1, 2 ou 5 doses) em dias alternados, ambas as drogas administradas em ratos Wistar machos (200-250g). No dia seguinte, eles receberam gavagem com uma refeição teste (0,5 mg/ml de vermelho fenol em 5% de solução de glucose) e foram sacrificados após 10 minutos. A recuperação do vermelho fenol no estômago e intestino foi determinada por espectofotometria. Valores de pico da pressão arterial média basal (PAM) e freqüência cardíaca (FC) após fenilefrina 5 mg/kg e atropina 0,5 mg/kg i.v. foram utilizados para avaliar as respostas barorreflexas. Animais foram submetidos ao teste da placa quente para avaliar alterações no limiar de dor induzido por calor e para a avaliação do limiar mecânico e alodinia, um estesiômetro dinâmico plantar baseado no princípio dos filamentos de Von Frey foi utilizado. Diferenças foram avaliadas com teste t ou One-Way ANOVA com P<0,05. Resultados: Cisplatina aumentou a retenção gástrica de líquidos com doses ≥ 2 mg/kg de 60-70% e este retarde do esvaziamento gástrico não permaneceu após duas semanas de interrupção do tratamento com 5 doses de 1 mg/kg de cisplatina. Vincristina aumentou a retenção gástrica de líquidos com doses > 250 µg/kg de 54,5-69,3% e este retarde do esvaziamento gástrico não permaneceu após uma semana de interrupção do tratamento com 5 doses de 150 µg/kg de vincristina. Cisplatina também aumentou o ganho do barorreflexo possivelmente pelo aumento da atividade simpática. Bradicardia induzida por fenilefrina foi aumentada sugerindo disfunção simpática e após a infusão de atropina (0,5 mg/kg) as alterações da freqüência cardíaca relacionadas a infusão desta droga foram mais proeminentes nos ratos tratados com cisplatina que no grupo controle. Cisplatina também alterou a excitabilidade de neurônios do gânglio cervical superior e a morfologia de gânglios autonômicos, somáticos e do nervo vago em ratos. Vincristina reforçou a redução da FC induzida pela fenilefrina e atropina. Conclusão: Nossos resultados demonstraram que cisplatina e vincristina induzem neuropatia autonômica com retarde do esvaziamento gástrico, alteração das respostas barorreflexas e aumento do peso colônico. Cisplatina alterou a latência mecânica, mas não a térmica e a neuropatia autonômica precedeu estas alterações. Em ratos tratados com vincristina a neuropatia sensitiva precedeu as disfunções autonômicas.

A dor neuropática ocorre como resultado de uma lesão ao sistema nervoso. Clinicamente, sua causa está relacionada, na maioria dos casos, ao comprometimento dos nervos periféricos, por isso a utilização de modelos animais de lesão nervosa periférica é amplamente aceita para o seu estudo. A medula espinal representa o centro de processamento primário da informação nociceptiva e a fisiopatologia da dor neuropática envolve principalmente o mecanismo de sensibilização central. Esse fenômeno é caracterizado pelo aumento na resposta das células do corno dorsal espinal aos estímulos aferentes. Diversas moléculas estão envolvidas nesse mecanismo e, recentemente, as espécies ativas do oxigênio (EAO) têm sido sugeridas como possíveis mediadores da dor neuropática. Para verificar essa relação, o presente estudo avaliou os efeitos temporais da secção do nervo ciático sobre marcadores de estresse oxidativo e nitrosativo e de defesas antioxidantes na medula espinal lombossacral de ratos, bem como a ativação da Akt. Os animais foram dividos nos grupos denervado (secção do nervo ciático), sham (o nervo foi exposto, porém, não seccionado) e controle (sem nenhum procedimento cirúrgico). Inicialmente os animais foram testados quanto à hiperalgesia térmica através do teste da placa quente. Foi demonstrado que 3 dias após a lesão, os animais sham e denervados apresentaram-se hiperalgésicos, mas aos 7 dias apenas os denervados ainda exibiam esta resposta. Aos 15 dias após a lesão, a hiperalgesia já havia sido revertida em todos os grupos estudados. As defesas antioxidantes enzimáticas foram avaliadas pela medida da atividade e da expressão das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase. A atividade da catalase reduziu aos 3 e 7 dias após a cirurgia nos animais sham e denervados, e a atividade da SOD diminuiu apenas nos animais denervados no período de 7 dias após a lesão. A expressão dessas enzimas, medida por Western blot, não apresentou variações. Para a determinação de lipoperoxidação foi realizada a medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a qual não apresentou diferenças entre os grupos estudados. Esses resultados iniciais sugerem que o procedimento cirúrgico, por estimular os aferentes nociceptivos dos tecidos relacinados, é suficiente para diminuir a atividade antioxidante enzimática da medula espinal, porém, essas alterações são mais expressivas nos animais submetidos à axotomia. Após, foi realizado o estudo de outras enzimas antioxidantes, a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa-S-transferase (GST), e também do principal antioxidante não-enzimático, a glutationa (GSH). A atividade da GST na medula não foi alterada pela lesão nervosa, e a atividade da GPx aumentou 3 dias após a cirurgia nos grupos sham e denervado, juntamente com a redução do conteúdo de glutationa. A queda da glutationa deve ser atribuída à maior atividade da GPx, que a utiliza como substrato na redução do peróxido de hidrogênio (H2O2) a água. Nessa etapa, foi determinada ainda a expressão da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e a medida dos metabólitos do óxido nítrico (NOx). A expressão da nNOS mostrou-se aumentada 7 dias após a lesão nos animais denervados. A formação de NOx foi maior nos períodos de 1, 7 e 15 dias após a axotomia. Esses resultados sustentam o envolvimento do óxido nítrico na dor neuropática. Na última parte deste trabalho foi realizada a medida da concentração do H2O2 na medula espinal, que apresentou aumento nos animais sham e denervados 1, 7 e 15 dias após a cirurgia. Também foi avaliada, por Western blot, a expressão dos adutos de Michael formados pelo 4- hidroxinonenal (HNE) e da Akt total e fosforilada. Aos 7 dias após a lesão nervosa houve um aumento na expressão da Akt total e dos adutos de Michael formados pelo HNE. A Akt fosforilada apresentou um aumento na sua expressão 1, 3 e 7 dias após a axotomia. Como o HNE é um produto da lipoperoxidação, pode-se afirmar que a lesão nervosa estimula este processo na medula espinal. A ativação da Akt, entretanto, pode ser um indicativo de proteção para as células nervosas, pois esta proteína participa de cascatas de sinalização relacionadas à sobrevivência celular. A partir do presente trabalho pode-se concluir que a estimulação nociceptiva induzida pela cirurgia causa alterações em sistemas antioxidantes como a catalase, a GSH e a GPx, bem como na produção de H2O2 na medula espinal, o que não é específico da lesão neuropática. Contudo, a dor neuropática está relacionada com a redução da atividade da SOD e o aumento na produção de HNE e de NO. Assim, após a lesão nervosa ocorre formação de EAO, as quais podem atuar como sinalizadores na modulação do processamento nociceptivo na medula espinal e, talvez, interferir em mecanismos neuroprotetores, como, por exemplo, pela ativação da Akt. / Neuropathic pain occurs as result of nervous system injury. Clinically, in almost all cases, its etiology is related to impairment of peripheral nerves. Thus, animal models of peripheral nerve injury are widely accepted to neuropathic pain studies. The spinal cord is the center of primary processing of the nociceptive information and the pathophysiology of the neuropathic pain involves mainly a central sensitization mechanism. This phenomenon is characterized by an increased response of spinal dorsal horn cells to afferent stimulus. Many molecules are involved in this mechanism and, recently, reactive oxygen species (ROS) have been suggested as putative mediators of neuropathic pain. In order to verify this relationship, the present study evaluated the temporal effects of sciatic nerve transection on oxidative and nitrosative stress markers, antioxidant defenses and Akt activation in the lumbossacral spinal cord of rats. Animals were divided in three groups: naïve, sham and sciatic nerve transection (SNT). Initially, hot plate test was performed to evaluate hyperalgesia. It was demonstrate hyperalgesia 3 days after injury in sham and SNT groups. At 7 days, only SNT animals exhibited this response and 15 days after injury the hyperalgesia was reverted in all groups. The enzymatic antioxidant defenses were evaluated by means of superoxide dismutase (SOD) and catalase activities and expression. The catalase activity was decreased at 3 and 7 days after surgery in sham and SNT group, and SOD activity was reduced only in SNT rats at 7 days after injury. No changes were observed in SOD and catalase expression, measured by Western blot. In order to evaluate lipid peroxidation (LPO), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were analyzed, and no differences among the groups were shown. These results demonstrated that the injury modifies antioxidant enzymatic activity in spinal cord. Afterwards, other antioxidant enzymes, glutathione peroxidase (GPx) and glutathione-S-transferase (GST) and the main non-enzymatic antioxidant, glutathione (GSH), also were studied. GST activity was not changed after nerve injury. There was an increase in GPx activity and a decrease in GSH content 3 days after surgery in both sham and SNT groups. The decrease in GSH may be attributed to the increase in GPx activity, since GSH is necessary to reduction of hydrogen peroxide (H2O2) to water catalyzed by GPx. The expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and the determination of nitric oxide metabolites (NOx) also were conducted. nNOS expression increased 7 days after SNT. NOx production was higher at 1, 7 and 15 days after axotomy. These results emphasize the involvement of nitric oxide in neuropathic pain. In the last part of this study, the measurement of H2O2 in spinal cord was conducted, showing an increase in sham and SNT animals at 1, 7 and 15 days after surgery. It was also evaluated, by Western blot, the 4-hydroxy-2-nonenal (HNE)-Michael adducts and the total and phospho-Akt. At 7 days, there was an increase in total-Akt expression and HNE-Michael adducts. Phospho-Akt expression increased 1, 3 and 7 days after axotomy. HNE is a lipid peroxidation product, thus, may be suggested that nerve injury stimulates this process in spinal cord. However, the Akt activation may be a means of protection to nerve cells, since this protein participate of signal cascades related to cell survival. In summary, the results of present study show that the peripheral nerve injury interferes in the systems related to oxidative stress, besides activate cell survival mechanisms. In conclusion, nociceptive stimulation induced by surgery causes changes in antioxidants systems such as catalase, GSH and GPx, as well in H2O2 production in spinal cord, which is not specific to neuropathic injury. However, neuropathic pain is related with SOD activity decrease and HNE and NO production increase. Thus, after nerve injury occur ROS formation which can act as signaling molecules in nociceptive processing modulation in spinal cord and, maybe, interferes in neuroprotection mechanisms, such as Akt activation.

A dor neuropática ocorre como resultado de uma lesão ao sistema nervoso. Clinicamente, sua causa está relacionada, na maioria dos casos, ao comprometimento dos nervos periféricos, por isso a utilização de modelos animais de lesão nervosa periférica é amplamente aceita para o seu estudo. A medula espinal representa o centro de processamento primário da informação nociceptiva e a fisiopatologia da dor neuropática envolve principalmente o mecanismo de sensibilização central. Esse fenômeno é caracterizado pelo aumento na resposta das células do corno dorsal espinal aos estímulos aferentes. Diversas moléculas estão envolvidas nesse mecanismo e, recentemente, as espécies ativas do oxigênio (EAO) têm sido sugeridas como possíveis mediadores da dor neuropática. Para verificar essa relação, o presente estudo avaliou os efeitos temporais da secção do nervo ciático sobre marcadores de estresse oxidativo e nitrosativo e de defesas antioxidantes na medula espinal lombossacral de ratos, bem como a ativação da Akt. Os animais foram dividos nos grupos denervado (secção do nervo ciático), sham (o nervo foi exposto, porém, não seccionado) e controle (sem nenhum procedimento cirúrgico). Inicialmente os animais foram testados quanto à hiperalgesia térmica através do teste da placa quente. Foi demonstrado que 3 dias após a lesão, os animais sham e denervados apresentaram-se hiperalgésicos, mas aos 7 dias apenas os denervados ainda exibiam esta resposta. Aos 15 dias após a lesão, a hiperalgesia já havia sido revertida em todos os grupos estudados. As defesas antioxidantes enzimáticas foram avaliadas pela medida da atividade e da expressão das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase. A atividade da catalase reduziu aos 3 e 7 dias após a cirurgia nos animais sham e denervados, e a atividade da SOD diminuiu apenas nos animais denervados no período de 7 dias após a lesão. A expressão dessas enzimas, medida por Western blot, não apresentou variações. Para a determinação de lipoperoxidação foi realizada a medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a qual não apresentou diferenças entre os grupos estudados. Esses resultados iniciais sugerem que o procedimento cirúrgico, por estimular os aferentes nociceptivos dos tecidos relacinados, é suficiente para diminuir a atividade antioxidante enzimática da medula espinal, porém, essas alterações são mais expressivas nos animais submetidos à axotomia. Após, foi realizado o estudo de outras enzimas antioxidantes, a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa-S-transferase (GST), e também do principal antioxidante não-enzimático, a glutationa (GSH). A atividade da GST na medula não foi alterada pela lesão nervosa, e a atividade da GPx aumentou 3 dias após a cirurgia nos grupos sham e denervado, juntamente com a redução do conteúdo de glutationa. A queda da glutationa deve ser atribuída à maior atividade da GPx, que a utiliza como substrato na redução do peróxido de hidrogênio (H2O2) a água. Nessa etapa, foi determinada ainda a expressão da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e a medida dos metabólitos do óxido nítrico (NOx). A expressão da nNOS mostrou-se aumentada 7 dias após a lesão nos animais denervados. A formação de NOx foi maior nos períodos de 1, 7 e 15 dias após a axotomia. Esses resultados sustentam o envolvimento do óxido nítrico na dor neuropática. Na última parte deste trabalho foi realizada a medida da concentração do H2O2 na medula espinal, que apresentou aumento nos animais sham e denervados 1, 7 e 15 dias após a cirurgia. Também foi avaliada, por Western blot, a expressão dos adutos de Michael formados pelo 4- hidroxinonenal (HNE) e da Akt total e fosforilada. Aos 7 dias após a lesão nervosa houve um aumento na expressão da Akt total e dos adutos de Michael formados pelo HNE. A Akt fosforilada apresentou um aumento na sua expressão 1, 3 e 7 dias após a axotomia. Como o HNE é um produto da lipoperoxidação, pode-se afirmar que a lesão nervosa estimula este processo na medula espinal. A ativação da Akt, entretanto, pode ser um indicativo de proteção para as células nervosas, pois esta proteína participa de cascatas de sinalização relacionadas à sobrevivência celular. A partir do presente trabalho pode-se concluir que a estimulação nociceptiva induzida pela cirurgia causa alterações em sistemas antioxidantes como a catalase, a GSH e a GPx, bem como na produção de H2O2 na medula espinal, o que não é específico da lesão neuropática. Contudo, a dor neuropática está relacionada com a redução da atividade da SOD e o aumento na produção de HNE e de NO. Assim, após a lesão nervosa ocorre formação de EAO, as quais podem atuar como sinalizadores na modulação do processamento nociceptivo na medula espinal e, talvez, interferir em mecanismos neuroprotetores, como, por exemplo, pela ativação da Akt. / Neuropathic pain occurs as result of nervous system injury. Clinically, in almost all cases, its etiology is related to impairment of peripheral nerves. Thus, animal models of peripheral nerve injury are widely accepted to neuropathic pain studies. The spinal cord is the center of primary processing of the nociceptive information and the pathophysiology of the neuropathic pain involves mainly a central sensitization mechanism. This phenomenon is characterized by an increased response of spinal dorsal horn cells to afferent stimulus. Many molecules are involved in this mechanism and, recently, reactive oxygen species (ROS) have been suggested as putative mediators of neuropathic pain. In order to verify this relationship, the present study evaluated the temporal effects of sciatic nerve transection on oxidative and nitrosative stress markers, antioxidant defenses and Akt activation in the lumbossacral spinal cord of rats. Animals were divided in three groups: naïve, sham and sciatic nerve transection (SNT). Initially, hot plate test was performed to evaluate hyperalgesia. It was demonstrate hyperalgesia 3 days after injury in sham and SNT groups. At 7 days, only SNT animals exhibited this response and 15 days after injury the hyperalgesia was reverted in all groups. The enzymatic antioxidant defenses were evaluated by means of superoxide dismutase (SOD) and catalase activities and expression. The catalase activity was decreased at 3 and 7 days after surgery in sham and SNT group, and SOD activity was reduced only in SNT rats at 7 days after injury. No changes were observed in SOD and catalase expression, measured by Western blot. In order to evaluate lipid peroxidation (LPO), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were analyzed, and no differences among the groups were shown. These results demonstrated that the injury modifies antioxidant enzymatic activity in spinal cord. Afterwards, other antioxidant enzymes, glutathione peroxidase (GPx) and glutathione-S-transferase (GST) and the main non-enzymatic antioxidant, glutathione (GSH), also were studied. GST activity was not changed after nerve injury. There was an increase in GPx activity and a decrease in GSH content 3 days after surgery in both sham and SNT groups. The decrease in GSH may be attributed to the increase in GPx activity, since GSH is necessary to reduction of hydrogen peroxide (H2O2) to water catalyzed by GPx. The expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and the determination of nitric oxide metabolites (NOx) also were conducted. nNOS expression increased 7 days after SNT. NOx production was higher at 1, 7 and 15 days after axotomy. These results emphasize the involvement of nitric oxide in neuropathic pain. In the last part of this study, the measurement of H2O2 in spinal cord was conducted, showing an increase in sham and SNT animals at 1, 7 and 15 days after surgery. It was also evaluated, by Western blot, the 4-hydroxy-2-nonenal (HNE)-Michael adducts and the total and phospho-Akt. At 7 days, there was an increase in total-Akt expression and HNE-Michael adducts. Phospho-Akt expression increased 1, 3 and 7 days after axotomy. HNE is a lipid peroxidation product, thus, may be suggested that nerve injury stimulates this process in spinal cord. However, the Akt activation may be a means of protection to nerve cells, since this protein participate of signal cascades related to cell survival. In summary, the results of present study show that the peripheral nerve injury interferes in the systems related to oxidative stress, besides activate cell survival mechanisms. In conclusion, nociceptive stimulation induced by surgery causes changes in antioxidants systems such as catalase, GSH and GPx, as well in H2O2 production in spinal cord, which is not specific to neuropathic injury. However, neuropathic pain is related with SOD activity decrease and HNE and NO production increase. Thus, after nerve injury occur ROS formation which can act as signaling molecules in nociceptive processing modulation in spinal cord and, maybe, interferes in neuroprotection mechanisms, such as Akt activation.

A dor neuropática ocorre como resultado de uma lesão ao sistema nervoso. Clinicamente, sua causa está relacionada, na maioria dos casos, ao comprometimento dos nervos periféricos, por isso a utilização de modelos animais de lesão nervosa periférica é amplamente aceita para o seu estudo. A medula espinal representa o centro de processamento primário da informação nociceptiva e a fisiopatologia da dor neuropática envolve principalmente o mecanismo de sensibilização central. Esse fenômeno é caracterizado pelo aumento na resposta das células do corno dorsal espinal aos estímulos aferentes. Diversas moléculas estão envolvidas nesse mecanismo e, recentemente, as espécies ativas do oxigênio (EAO) têm sido sugeridas como possíveis mediadores da dor neuropática. Para verificar essa relação, o presente estudo avaliou os efeitos temporais da secção do nervo ciático sobre marcadores de estresse oxidativo e nitrosativo e de defesas antioxidantes na medula espinal lombossacral de ratos, bem como a ativação da Akt. Os animais foram dividos nos grupos denervado (secção do nervo ciático), sham (o nervo foi exposto, porém, não seccionado) e controle (sem nenhum procedimento cirúrgico). Inicialmente os animais foram testados quanto à hiperalgesia térmica através do teste da placa quente. Foi demonstrado que 3 dias após a lesão, os animais sham e denervados apresentaram-se hiperalgésicos, mas aos 7 dias apenas os denervados ainda exibiam esta resposta. Aos 15 dias após a lesão, a hiperalgesia já havia sido revertida em todos os grupos estudados. As defesas antioxidantes enzimáticas foram avaliadas pela medida da atividade e da expressão das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase. A atividade da catalase reduziu aos 3 e 7 dias após a cirurgia nos animais sham e denervados, e a atividade da SOD diminuiu apenas nos animais denervados no período de 7 dias após a lesão. A expressão dessas enzimas, medida por Western blot, não apresentou variações. Para a determinação de lipoperoxidação foi realizada a medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a qual não apresentou diferenças entre os grupos estudados. Esses resultados iniciais sugerem que o procedimento cirúrgico, por estimular os aferentes nociceptivos dos tecidos relacinados, é suficiente para diminuir a atividade antioxidante enzimática da medula espinal, porém, essas alterações são mais expressivas nos animais submetidos à axotomia. Após, foi realizado o estudo de outras enzimas antioxidantes, a glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa-S-transferase (GST), e também do principal antioxidante não-enzimático, a glutationa (GSH). A atividade da GST na medula não foi alterada pela lesão nervosa, e a atividade da GPx aumentou 3 dias após a cirurgia nos grupos sham e denervado, juntamente com a redução do conteúdo de glutationa. A queda da glutationa deve ser atribuída à maior atividade da GPx, que a utiliza como substrato na redução do peróxido de hidrogênio (H2O2) a água. Nessa etapa, foi determinada ainda a expressão da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e a medida dos metabólitos do óxido nítrico (NOx). A expressão da nNOS mostrou-se aumentada 7 dias após a lesão nos animais denervados. A formação de NOx foi maior nos períodos de 1, 7 e 15 dias após a axotomia. Esses resultados sustentam o envolvimento do óxido nítrico na dor neuropática. Na última parte deste trabalho foi realizada a medida da concentração do H2O2 na medula espinal, que apresentou aumento nos animais sham e denervados 1, 7 e 15 dias após a cirurgia. Também foi avaliada, por Western blot, a expressão dos adutos de Michael formados pelo 4- hidroxinonenal (HNE) e da Akt total e fosforilada. Aos 7 dias após a lesão nervosa houve um aumento na expressão da Akt total e dos adutos de Michael formados pelo HNE. A Akt fosforilada apresentou um aumento na sua expressão 1, 3 e 7 dias após a axotomia. Como o HNE é um produto da lipoperoxidação, pode-se afirmar que a lesão nervosa estimula este processo na medula espinal. A ativação da Akt, entretanto, pode ser um indicativo de proteção para as células nervosas, pois esta proteína participa de cascatas de sinalização relacionadas à sobrevivência celular. A partir do presente trabalho pode-se concluir que a estimulação nociceptiva induzida pela cirurgia causa alterações em sistemas antioxidantes como a catalase, a GSH e a GPx, bem como na produção de H2O2 na medula espinal, o que não é específico da lesão neuropática. Contudo, a dor neuropática está relacionada com a redução da atividade da SOD e o aumento na produção de HNE e de NO. Assim, após a lesão nervosa ocorre formação de EAO, as quais podem atuar como sinalizadores na modulação do processamento nociceptivo na medula espinal e, talvez, interferir em mecanismos neuroprotetores, como, por exemplo, pela ativação da Akt. / Neuropathic pain occurs as result of nervous system injury. Clinically, in almost all cases, its etiology is related to impairment of peripheral nerves. Thus, animal models of peripheral nerve injury are widely accepted to neuropathic pain studies. The spinal cord is the center of primary processing of the nociceptive information and the pathophysiology of the neuropathic pain involves mainly a central sensitization mechanism. This phenomenon is characterized by an increased response of spinal dorsal horn cells to afferent stimulus. Many molecules are involved in this mechanism and, recently, reactive oxygen species (ROS) have been suggested as putative mediators of neuropathic pain. In order to verify this relationship, the present study evaluated the temporal effects of sciatic nerve transection on oxidative and nitrosative stress markers, antioxidant defenses and Akt activation in the lumbossacral spinal cord of rats. Animals were divided in three groups: naïve, sham and sciatic nerve transection (SNT). Initially, hot plate test was performed to evaluate hyperalgesia. It was demonstrate hyperalgesia 3 days after injury in sham and SNT groups. At 7 days, only SNT animals exhibited this response and 15 days after injury the hyperalgesia was reverted in all groups. The enzymatic antioxidant defenses were evaluated by means of superoxide dismutase (SOD) and catalase activities and expression. The catalase activity was decreased at 3 and 7 days after surgery in sham and SNT group, and SOD activity was reduced only in SNT rats at 7 days after injury. No changes were observed in SOD and catalase expression, measured by Western blot. In order to evaluate lipid peroxidation (LPO), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were analyzed, and no differences among the groups were shown. These results demonstrated that the injury modifies antioxidant enzymatic activity in spinal cord. Afterwards, other antioxidant enzymes, glutathione peroxidase (GPx) and glutathione-S-transferase (GST) and the main non-enzymatic antioxidant, glutathione (GSH), also were studied. GST activity was not changed after nerve injury. There was an increase in GPx activity and a decrease in GSH content 3 days after surgery in both sham and SNT groups. The decrease in GSH may be attributed to the increase in GPx activity, since GSH is necessary to reduction of hydrogen peroxide (H2O2) to water catalyzed by GPx. The expression of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and the determination of nitric oxide metabolites (NOx) also were conducted. nNOS expression increased 7 days after SNT. NOx production was higher at 1, 7 and 15 days after axotomy. These results emphasize the involvement of nitric oxide in neuropathic pain. In the last part of this study, the measurement of H2O2 in spinal cord was conducted, showing an increase in sham and SNT animals at 1, 7 and 15 days after surgery. It was also evaluated, by Western blot, the 4-hydroxy-2-nonenal (HNE)-Michael adducts and the total and phospho-Akt. At 7 days, there was an increase in total-Akt expression and HNE-Michael adducts. Phospho-Akt expression increased 1, 3 and 7 days after axotomy. HNE is a lipid peroxidation product, thus, may be suggested that nerve injury stimulates this process in spinal cord. However, the Akt activation may be a means of protection to nerve cells, since this protein participate of signal cascades related to cell survival. In summary, the results of present study show that the peripheral nerve injury interferes in the systems related to oxidative stress, besides activate cell survival mechanisms. In conclusion, nociceptive stimulation induced by surgery causes changes in antioxidants systems such as catalase, GSH and GPx, as well in H2O2 production in spinal cord, which is not specific to neuropathic injury. However, neuropathic pain is related with SOD activity decrease and HNE and NO production increase. Thus, after nerve injury occur ROS formation which can act as signaling molecules in nociceptive processing modulation in spinal cord and, maybe, interferes in neuroprotection mechanisms, such as Akt activation.

A dor neuropática pode ser causada por lesões e/ou disfunções no sistema somatossensorial. A transmissão da informação nociceptiva ocorre através das fibras aferentes primárias que iniciam a transmissão da informação dolorosa e expressam o receptor de potencial transiente vanilóide 1 (TRPV1), um receptor-chave envolvido na transmissão e modulação de sinais de dor. Estudos destacam a capsaicina no tratamento eficaz de dor neuropática. A capsaicina causa uma depleção de substancia P, alterando a transmissão da dor, produzindo uma dessensibilização. A resiniferatoxina (RTX), um agonista mais potente de TRPV1 que a capsaicina, inibe rapidamente a transmissão nociceptiva, como também proporciona analgesia duradoura em modelos comportamentais. Esses dados apoiam o desenvolvimento de novos analgésicos direcionados a neurônios que expressam o receptor TRPV1 tanto central como perifericamente. O presente estudo visa avaliar o efeito da RTX nos comportamentos hipernociceptivos de animais submetidos à modelo de lesão neuropática por constrição crônica do nervo isquiático (CCI). Foram utilizados 112 camundongos swiss, machos (5-6 semanas; pesando 25 a 28g), subdividos em 2 grupos: grupo tratamento prévio (pré-tratados com veículo e falso operados; pré-tratados com veículo e neuropáticos; pré-tratados com RTX e falso operados e pré tratados com RTX e neuropáticos) e grupo tratamento tardio (falso operados e tratados com veículo; falso operados e tratados com RTX; neuropáticos e tratados com veículo e neuropáticos e tratados com RTX). RTX/veículo foram administrados por via intratecal (i.t.), o limiar nociceptivo mecânico foi avaliado pelos filamentos de Von Frey e foi utilizada a técnica de Western Blotting para avaliar a expressão dos receptores TRPV1 nos gânglios da raiz dorsal (DRG). Os resultados encontrados por meio da avaliação nociceptiva pelos filamentos de Von Frey demonstram que no grupo tratamento prévio houve um aumento significativo do limiar nociceptivo, demostrando o efeito nociceptivo de RTX para o tratamento prévio, após CCI e no grupo tratamento tardio a dor neuropática induzida por CCI foi revertida após 1 hora da administração de RTX, persistindo por até 24 horas. Nos grupos dos animais neuropáticos tratados com veículo e nos grupos falsos-operados tratados com veículo e RTX não houve diferença entre os tempos e alteração do limiar nociceptivo. Nas análises das expressões de TRPV1, foi observado que a expressão dos receptores TRPV1 reduziu de maneira significativa no grupo de tratamento tardio quando comparados com o grupo veículo e tratamento prévio, representando a depleção dos receptores TRPV1 após a administração i.t. de RTX em animais submetidos a CCI. Pode-se concluir que, os receptores TRVP1 participam ativamente no controle da dor neuropática, induzindo antinocicepção, bem como a administração i.t. de RTX 1 hora antes do modelo de dor demonstrou esse efeito, entretanto as expressões dos receptores TRPV1 não foram alteradas / Neuropathic pain can be caused by injury and dysfunctions in the somatosensory system. The transmission of nociceptive information occurs via the primary afferent fibers that initiate the transmission of pain information and expressing the transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1), a receptor involved in the transmission and modulation of pain signals and is a main stimulus transducer. Studies featured capsaicin in the effective treatment of neuropathic pain. Capsaicin causes a depletion of substance P by changing the transmission of pain, producing desensitization. The resiniferatoxin (RTX), a more potent TRPV1 agonist capsaicin that rapidly inhibit nociceptive transmission, provides lasting analgesia in behavioral models. These data support the development of new analgesics directed to neurons that express the TRPV1 receptor both central and peripherally. This study aims to evaluate the effect of RTX in hypernociceptive behavior of animals subjected to the model of neuropathic chronic constriction injury of the sciatic nerve (CCI). 112 males mice Swiss were used, (5-6 weeks, weighing 25 to 28g), subdivided into 2 groups: previous treatment group (pretreated with vehicle and false operated; pretreated with vehicle and neuropathic; pretreated with RTX and operated false and pre-treated with RTX and neuropathic) and late treatment group (false operated and treated with vehicle, false operated and treated with RTX, neuropathic and treated with vehicle and neuropathic and treated with RTX). RTX/vehicle was administered intrathecally, the mechanical nociceptive threshold was evaluated by Von Frey filament and Western blotting technique was used to evaluate the expression of TRPV1 receptors on dorsal root ganglia (DRG). The results found by nociceptive evaluation by Von Frey filaments demonstrate that the previous treatment group showed a significant increase of nociceptive threshold, demonstrating nociceptive effect of RTX for previous treatment after CCI and treatment group later neuropathic pain induced by CCI It was reversed after 1 hour of RTX administration and persist for up to 24 hours. In groups of neuropathic vehicle treated animals and the false-operated group treated with vehicle and RTX there was no difference between the times and change the nociceptive threshold. In the analysis of expression of TRPV1 it was observed that the expression of TRPV1 receptors significantly reduced the late treatment group compared to the vehicle group, and previous treatment, representing depletion of the TRPV1 receptors after intrathecal administration of RTX in animals subjected to CCI. It can be concluded that the TRVP1 receptors actively participate in controlling the neuropathic pain induced antinociception, as well as intrathecal administration of RTX 1 hour before to pain model showed that effect, however the expression of TRPV1 receptors were not changed. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos de um protocolo de natação sobre a alodinia mecânica e possíveis alterações no corno dorsal da medula espinhal de ratos machos adultos com dor neuropática crônica experimental, induzida por constrição crônica do nervo ciático. No experimento 1 foi testado o efeito do protocolo de natação na produção de analgesia e se este é mediado pelo sistema opióide endógeno em ratos com dor muscular crônica experimental. No experimento 2, estudou-se o efeito da analgesia induzida pelo exercício de natação em animais com dor neuropática experimental, avaliando a alodinia mecânica e as alterações imunoistoquimicas do corno dorsal da medula espinhal. O protocolo de exercício consistiu em natação em água aquecida (36°C), 30 min diariamente, durante 3 semanas. A alodinia mecânica foi avaliada através de filamentos de Von Frey e foi considerada a diminuição dela quando houve aumento no limiar de retirada frente ao estimulo mecânico com filamentos de Von Frey. A avaliação das alterações no corno dorsal da medula espinhal foram realizadas através de analise da imunorreatividade da serotonina e do CGRP (peptídeo relacionado ao gene da calcitonina). Os resultados mostraram que o protocolo de natação foi capaz de produzir analgesia opióide endógeno no modelo de dor muscular. Entretanto, no modelo de dor neuropática a natação não produziu analgesia. O modelo de dor neuropática levou a diminuição do CGRP ipsilateral a lesão, em contrapartida, não foi encontrada alteração serotonérgica entre ambos os grupos. Em conclusão, a natação é capaz de produzir analgesia no modelo de dor muscular, entretanto, na dor neuropática, que envolve um sistema mais complexo incluindo possíveis modificações centrais, a natação não produziu analgesia.

O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos de um protocolo de natação sobre a alodinia mecânica e possíveis alterações no corno dorsal da medula espinhal de ratos machos adultos com dor neuropática crônica experimental, induzida por constrição crônica do nervo ciático. No experimento 1 foi testado o efeito do protocolo de natação na produção de analgesia e se este é mediado pelo sistema opióide endógeno em ratos com dor muscular crônica experimental. No experimento 2, estudou-se o efeito da analgesia induzida pelo exercício de natação em animais com dor neuropática experimental, avaliando a alodinia mecânica e as alterações imunoistoquimicas do corno dorsal da medula espinhal. O protocolo de exercício consistiu em natação em água aquecida (36°C), 30 min diariamente, durante 3 semanas. A alodinia mecânica foi avaliada através de filamentos de Von Frey e foi considerada a diminuição dela quando houve aumento no limiar de retirada frente ao estimulo mecânico com filamentos de Von Frey. A avaliação das alterações no corno dorsal da medula espinhal foram realizadas através de analise da imunorreatividade da serotonina e do CGRP (peptídeo relacionado ao gene da calcitonina). Os resultados mostraram que o protocolo de natação foi capaz de produzir analgesia opióide endógeno no modelo de dor muscular. Entretanto, no modelo de dor neuropática a natação não produziu analgesia. O modelo de dor neuropática levou a diminuição do CGRP ipsilateral a lesão, em contrapartida, não foi encontrada alteração serotonérgica entre ambos os grupos. Em conclusão, a natação é capaz de produzir analgesia no modelo de dor muscular, entretanto, na dor neuropática, que envolve um sistema mais complexo incluindo possíveis modificações centrais, a natação não produziu analgesia.

O objetivo deste estudo foi analisar os efeitos de um protocolo de natação sobre a alodinia mecânica e possíveis alterações no corno dorsal da medula espinhal de ratos machos adultos com dor neuropática crônica experimental, induzida por constrição crônica do nervo ciático. No experimento 1 foi testado o efeito do protocolo de natação na produção de analgesia e se este é mediado pelo sistema opióide endógeno em ratos com dor muscular crônica experimental. No experimento 2, estudou-se o efeito da analgesia induzida pelo exercício de natação em animais com dor neuropática experimental, avaliando a alodinia mecânica e as alterações imunoistoquimicas do corno dorsal da medula espinhal. O protocolo de exercício consistiu em natação em água aquecida (36°C), 30 min diariamente, durante 3 semanas. A alodinia mecânica foi avaliada através de filamentos de Von Frey e foi considerada a diminuição dela quando houve aumento no limiar de retirada frente ao estimulo mecânico com filamentos de Von Frey. A avaliação das alterações no corno dorsal da medula espinhal foram realizadas através de analise da imunorreatividade da serotonina e do CGRP (peptídeo relacionado ao gene da calcitonina). Os resultados mostraram que o protocolo de natação foi capaz de produzir analgesia opióide endógeno no modelo de dor muscular. Entretanto, no modelo de dor neuropática a natação não produziu analgesia. O modelo de dor neuropática levou a diminuição do CGRP ipsilateral a lesão, em contrapartida, não foi encontrada alteração serotonérgica entre ambos os grupos. Em conclusão, a natação é capaz de produzir analgesia no modelo de dor muscular, entretanto, na dor neuropática, que envolve um sistema mais complexo incluindo possíveis modificações centrais, a natação não produziu analgesia.