MOTA, Mario Rogério Lima. Estudo da atividade antiinflamatória e antinociceptiva da lectina isolada de sementes de Lonchocarpus sericeus (Poir) Kunth. 2008. 152 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-09-04T16:12:17Z No. of bitstreams: 1 2008_tese_mrlmota.pdf: 2870545 bytes, checksum: fdc0b69fc513d197b88d1acd95f9ad88 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-09-05T11:31:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_tese_mrlmota.pdf: 2870545 bytes, checksum: fdc0b69fc513d197b88d1acd95f9ad88 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-05T11:31:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_tese_mrlmota.pdf: 2870545 bytes, checksum: fdc0b69fc513d197b88d1acd95f9ad88 (MD5) Previous issue date: 2008 / Lectins are non-immune (glyco)proteins that can recognize and reversibly bind to carbohydrates or other substances derived from sugars. Lonchocarpus sericeus seeds (LSL) shows a molecular mass of 23555 ± 15 Da and a a-metyl glucopyranoside and N-acetyl-glucosamine binding specificity. The aim of this work was to evaluate the antinoceptive and antiinflammatory activity of lectin from Lonchocarpus sericeus seeds (LSL). To do so, we used swiss mice (25-35g). In the antiinflammatory activity studying, LSL (10 or 100 mg/kg; i.v.; 15 minutes) inhibited the migration (neutrophil rolling and adhesion) to the peritoneal cavities of animals stimulated with carrageenan (Cg), and the effect seems to be related to the cytokines (TNF-a and IL-1b) and chemokines (MIP-1a [CCL3], KC [CXCL1]) level reduction induced by this lectin. The LSL inhibitory effect on the neutrophil migration seems to be also related to the nitric oxide (NO) systemic levels increasing. LSL was effective on the NO increasing on animals’ serum. The pretreatment of mice using aminoguanidin (nitric oxide reduced synthase inhibitor) reversed the antiinflammatory effect of lectin on the neutrophil migration. Still referring to the anti-inflammatory activity, LSL was effective on inhibiting the neutrophil migration to the peritoneal cavities of animals immunized and stimulated with ovalbumin (OVA), but the lectin was unable to inhibit an in vitro neutrophil migration induced by MIP-2, showing an indirect action of LSL (cytokines and chemokines) on the migration inhibition. In the antinoceptive study, LSL (3 or 10 mg/kg; i.v.; 30 minutes) reduced abdominal contortion induced by acetic acid and only decreased the second phase of formalin test, showing an activity on the inflammatory pain. In the hot plate test LSL didn’t show any effects. To evaluate the anti-inflammatory pain, we did a study based on the anthihypernociceptive activity. Thus, LSL (10 or 100 mg/kg; i.v.; 15 minutes) inhibited the mechanical hypernociception induced by carrageenan and ovalbumin (immunized animals) intraplantarly administration, but not induced by prostaglandin E2. (PGE2). This effect was correlated to the block of neutrophil influx, suggested by the reduction of myeloperoxidase (MPO) levels on animal’s paws pretreated with LSL (3 or 10 mg/kg; i.v.; 15 minutes) and stimulated with carregeenan. This antihyperalgesic effect seems to be highly dependent of the cytokines (TNF-a and IL-1b) and chemokines (MIP-1a [CCL3], KC [CXCL1]) level decreasing, since LSL (10 or 100 mg/kg; i.v.; 15 minutes) reduced these mediators’ levels on animal’s paws pretreated with Cg (intraplantar). Corresponding to the possible central activity, LSL (10 mg/kg; i.v.) did not alter the motor activity and not provoked depression on animals. LSL acute toxicity was evaluated by treating the rats with LSL (10 mg/kg; i.v.) during seven days analyzing several parameters of the animals: kidney functions (wet weight, urea dosage), liver functions (wet weight, kinetic evaluation of aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase), heart (wet weight) stomach (wet weight and visual evaluation of possible lesions), variation in body weight of treated animals and leukogram. The obtained results didn’t show any alteration on the evaluated parameters suggesting that LSL doesn’t show any toxicity on animals. In conclusion, the antinoceptive and antihyperalgesic activity of LSL are associated to the inhibition of the neutrophil migration; it is probably a reflection of an inhibition on cytokines and chemokines free flowing and for the increasing of NO free flow. Additionally, this lectin doesn’t show acute toxicity and central effects. / Lectinas são (glico)proteínas de origem não imune e que podem reconhecer e se ligar reversivelmente a carboidratos ou a outras substâncias derivadas de açúcares. A lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) apresenta massa molecular aparente de 23555 ± 15 Da e especificidade de ligação a N-acetil-glicosamina e α -metil-glicopiranosídeo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antiinflamatória e antinociceptiva da Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL). Para tal, utilizamos camundongos Swiss albinos (25-35g). No estudo da atividade antiinflamatória, LSL (3 ou 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) inibiu a migração (rolamento e adesão de neutrófilos) para a cavidade abdominal de animais estimulados com carragenina (Cg), e este efeito parece estar relacionado com a redução dos níveis de citocinas (TNF-α and IL-1β) e quimiocinas (MIP-1α [CCL3], KC [CXCL1]) por esta lectina. O efeito inibitório da LSL sobre a migração de neutrófilos, parece também envolver o aumento nos níveis sistêmicos de óxido nítrico (NO), pois LSL (10 mg/kg; e.v.) foi capaz de aumentar os níveis de NO no soro de animais, e o pré-tratamento de camundongos com aminoguanidina (inibidor da óxido nítrico sintase induzida) foi capaz de reverter o efeito aniinflamatório desta lectina sobre a migração de neutrófilos. Ainda em relação à atividade antiinflamatória, LSL foi capaz de inibir a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal de animais imunizados e estimulados com ovoalbumina (OVA), porém, esta mesma lectina foi ineficaz em inibir a migração de neutrófilos in vitro estimulada por MIP-2, demonstrando então um papel indireto da LSL (redução de citocinas e quimiocinas) na inibição da migração. No estudo da atividade antinociceptiva, LSL (10 ou 100 mg/kg; e.v.; 15 minutos) reduziu as contorções abdominais induzidas por ácido acético e diminuiu somente a segunda fase do teste da formalina, demostrando uma atividade sobre a dor inflamatória. No teste da placa quente, LSL não apresentou efeito. Para avaliar a dor inflamatória realizaram-se estudos de atividade antihipernociceptiva. Assim, LSL (3 ou 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) inibiu a hipernocicepção mecânica induzida por administração intraplantar de carragenina e ovalbumina (animais imunizados) mas não a induzida por prostaglandina E2 (PGE2). Este efeito foi correlacionado ao bloqueio do influxo de neutrófilos, sugerido pela redução dos níveis de mieloperoxidase (MPO) nas patas de animais pré-tratados com LSL (3 ou 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) e estimulados com carragenina. Este efeito antihiperalgésico parece também depender da redução dos níveis de citocinas (TNF-α and IL-1β) e quimiocinas (MIP-1α [CCL3], KC [CXCL1]), uma vez que LSL (3 ou 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) reduziu os níveis destes mediadores no tecido da pata de animais estimulados com Cg (intraplantar). Em relação a uma possível atividade central, LSL (10 mg/kg; e.v.) não alterou a atividade motora e nem provocou depressão nos animais. A toxicidade aguda foi avaliada pelo tratamento de camundongos com LSL (10 mg/kg; e.v.), durante sete dias consecutivos, através de vários parâmetros: funções do rim (peso úmido, dosagem de uréia) e do fígado (peso úmido, avaliação da cinética da aspartato amino transaminase e alanina amino transaminase), coração (peso úmido), estômago (peso úmido e avaliação visual de possíveis lesões), variação de massa corporal dos animais tratados e leucograma. Os resultados obtidos não mostraram qualquer alteração dos parâmetros avaliados, demonstrando que a LSL não apresenta nenhuma toxicidade nos animais. Em conclusão, a atividade antiinflamatória e antinociceptiva da LSL está associada com a inibição da migração de neutrófilos, que provavelmete é reflexo da inibição da liberação de citocinas e quimiocinas e do aumento na liberação de NO. Adicionalmente, esta lectina não apresenta efeitos centrais nem toxicidade aguda.

A dor pode ser classificada em inflamatória, neuropática e fásica, que ocorre por um dano do sistema nervoso e estimulação de nociceptores, como os Receptores de Potencial Transiente (TRP’s). Nesta família destacamos o TRPV1, TRPM8 e TRPA1, estimulados por substâncias antinociceptivas, como a capsaicina, mentol e metil salicilato, respectivamente. O trabalho objetivou investigar o papel dos TRP’s na antinocicepção, pela administração dos agonistas no acuponto Zusanli (ST36), no modelo de dor inflamatória, neuropática e fásica. Foram utilizados 180 ratos Wistars, machos, 6 semanas, entre 250 a 300g. Eles foram submetidos ao modelo de dor inflamatória induzida por Adjuvante Completo de Freund (CFA), dor fásica pelo Teste de Retirada da Cauda, Tail Flick (TF) e dor neuropática por Chronic Constriction Injury (CCI). Foi realizada uma injeção subcutânea no acuponto Zusanli de 20μL de salina e agonistas dos TRP’s, capsaicina, mentol e metil salicilato, nas doses de 0,03 μg/20μL; 0,3 μg/20μL; 3,0 μg/20μL. Os limiares mecânicos foram avaliados através do aparelho Von Frey digital, antes da administração do CFA e da cirurgia de constrição do nervo ciático, após 4 horas e 72 horas para avaliação hiperalgésica, e 0, 1, 3, 6 e 24 horas após a administração dos agonistas. E os limiares de TF foram avaliados antes e após 0, 1, 3, 6 e 24 horas. A hiperalgesia inflamatória foi revertida significativamente em todos os agonistas. A administração de capsaicina induziu redução do efeito hiperalgésico, em todos os tempos avaliados, nas 3 doses, exceto no tempo após 24 horas de tratamento, onde somente a maior dose induziu redução nos limiares mecânicos. E o tratamento com mentol e metil salicilato, no acuponto, induziu efeito antinociceptivo, em todos os tempos, nas diferentes doses. No grupo de dor fásica, a administração dos agonistas, capsaicina e mentol, apresentou aumento dos limiares de latência, em todos os tempos avaliados nas 3 doses, exceto no T0. E a administração de metil salicilato obteve efeito analgésico, em todas as doses, nos tempos T3, T6 e T24, e somente a maior dose apresentou efeito no T0 e a dose intermediária no T1. No modelo de dor neuropática, a capsaicina, nas doses maior e intermediária, apresentou efeito analgésico em quase todos os tempos. O mentol obteve este efeito em todas as doses e quase em todos os tempos, assim como o metil salicilato. De acordo com os resultados, podemos sugerir que os receptores TRPV1, TRPM8 e TRPA1 estão envolvidos no efeito anti-hiperalgésico, pela administração de agonistas no acuponto Zusanli, no controle da dor inflamatória, fásica e neuropática. / Pain may be classified as inflammatory, neuropathic and phasic, which occurs by a damage in the nervous system and nociceptors stimulation, such as the Transient Receptor Potential (TRP’s). In TRP’s group, we highlight the TRPV1, TRPM8, and TRPA1, stimulated by substances anti-nociceptive, such as capsaicin, menthol, and methyl salicylate respectively. This work sought to investigate the role of the TRP’s on the antinociception, trough administration of agonists in the acupoint Zusanli (ST36), in inflammatory, neuropathic and phasic pain models. The project has composed by 180 male Wistars rats, 6 weeks old, between 250g to 300g. The inflammatory pain model induced by Complete Freund’s Adjuvant (CFA), phasic pain model by Tail Flick (TF) and neuropathic pain model by Chronic Constriction Injury (CCI). A subcutaneous injection in the acupoint Zusanli 20μL of saline and the TRP 's agonists, capsaicin , menthol and methyl salicylate was applied in doses of 0,03 μg/20μL; 0,3 μg/20μL; 3,0 μg/20μL. Mechanical thresholds assessed using a digital Von Frey device before the administration of CFA and after 0, 1, 3, 6 and 24 hours of administration of the agonists. The TF thresholds assessed before and after 0, 1, 3, 6 and 24 hours. Inflammatory hyperalgesia revealed significantly reversed in all agonists. The administration of capsaicin induced the reduction of hyperalgesic effects at all periods, in 3 doses, except for the time after 24 hours of treatment, where only the higher dose induced a reduction in a mechanical threshold. The treatment with menthol and methyl salicylate induced an antinociceptive effect in the acupoint for all the times, in different doses. In phasic pain group, the administration of agonists, capsaicin, and menthol increased the latency thresholds, at all times evaluated in three doses except the T0. In addition, the administration of methyl salicylate obtained an analgesic effect on all doses and on the times T3, T6 and T24, and only the highest dose had an effect on T0 and the intermediate dose on T1. In neuropathic model pain, capsaicin in the highest and intermediate dose showed analgesic effect in all the times. The mentol and the methyl salicylate had this effect in all the dose and the most times. According to the results obtained so far, we suggest that TRPV1, TRPM8, and TRPA1 receptors are involved in anti-hyperalgesic effect by administering agonists in the Zusanli acupoint in the control of inflammatory and phasic pain. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

A dor neuropática pode ser causada por lesões e/ou disfunções no sistema somatossensorial. A transmissão da informação nociceptiva ocorre através das fibras aferentes primárias que iniciam a transmissão da informação dolorosa e expressam o receptor de potencial transiente vanilóide 1 (TRPV1), um receptor-chave envolvido na transmissão e modulação de sinais de dor. Estudos destacam a capsaicina no tratamento eficaz de dor neuropática. A capsaicina causa uma depleção de substancia P, alterando a transmissão da dor, produzindo uma dessensibilização. A resiniferatoxina (RTX), um agonista mais potente de TRPV1 que a capsaicina, inibe rapidamente a transmissão nociceptiva, como também proporciona analgesia duradoura em modelos comportamentais. Esses dados apoiam o desenvolvimento de novos analgésicos direcionados a neurônios que expressam o receptor TRPV1 tanto central como perifericamente. O presente estudo visa avaliar o efeito da RTX nos comportamentos hipernociceptivos de animais submetidos à modelo de lesão neuropática por constrição crônica do nervo isquiático (CCI). Foram utilizados 112 camundongos swiss, machos (5-6 semanas; pesando 25 a 28g), subdividos em 2 grupos: grupo tratamento prévio (pré-tratados com veículo e falso operados; pré-tratados com veículo e neuropáticos; pré-tratados com RTX e falso operados e pré tratados com RTX e neuropáticos) e grupo tratamento tardio (falso operados e tratados com veículo; falso operados e tratados com RTX; neuropáticos e tratados com veículo e neuropáticos e tratados com RTX). RTX/veículo foram administrados por via intratecal (i.t.), o limiar nociceptivo mecânico foi avaliado pelos filamentos de Von Frey e foi utilizada a técnica de Western Blotting para avaliar a expressão dos receptores TRPV1 nos gânglios da raiz dorsal (DRG). Os resultados encontrados por meio da avaliação nociceptiva pelos filamentos de Von Frey demonstram que no grupo tratamento prévio houve um aumento significativo do limiar nociceptivo, demostrando o efeito nociceptivo de RTX para o tratamento prévio, após CCI e no grupo tratamento tardio a dor neuropática induzida por CCI foi revertida após 1 hora da administração de RTX, persistindo por até 24 horas. Nos grupos dos animais neuropáticos tratados com veículo e nos grupos falsos-operados tratados com veículo e RTX não houve diferença entre os tempos e alteração do limiar nociceptivo. Nas análises das expressões de TRPV1, foi observado que a expressão dos receptores TRPV1 reduziu de maneira significativa no grupo de tratamento tardio quando comparados com o grupo veículo e tratamento prévio, representando a depleção dos receptores TRPV1 após a administração i.t. de RTX em animais submetidos a CCI. Pode-se concluir que, os receptores TRVP1 participam ativamente no controle da dor neuropática, induzindo antinocicepção, bem como a administração i.t. de RTX 1 hora antes do modelo de dor demonstrou esse efeito, entretanto as expressões dos receptores TRPV1 não foram alteradas / Neuropathic pain can be caused by injury and dysfunctions in the somatosensory system. The transmission of nociceptive information occurs via the primary afferent fibers that initiate the transmission of pain information and expressing the transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1), a receptor involved in the transmission and modulation of pain signals and is a main stimulus transducer. Studies featured capsaicin in the effective treatment of neuropathic pain. Capsaicin causes a depletion of substance P by changing the transmission of pain, producing desensitization. The resiniferatoxin (RTX), a more potent TRPV1 agonist capsaicin that rapidly inhibit nociceptive transmission, provides lasting analgesia in behavioral models. These data support the development of new analgesics directed to neurons that express the TRPV1 receptor both central and peripherally. This study aims to evaluate the effect of RTX in hypernociceptive behavior of animals subjected to the model of neuropathic chronic constriction injury of the sciatic nerve (CCI). 112 males mice Swiss were used, (5-6 weeks, weighing 25 to 28g), subdivided into 2 groups: previous treatment group (pretreated with vehicle and false operated; pretreated with vehicle and neuropathic; pretreated with RTX and operated false and pre-treated with RTX and neuropathic) and late treatment group (false operated and treated with vehicle, false operated and treated with RTX, neuropathic and treated with vehicle and neuropathic and treated with RTX). RTX/vehicle was administered intrathecally, the mechanical nociceptive threshold was evaluated by Von Frey filament and Western blotting technique was used to evaluate the expression of TRPV1 receptors on dorsal root ganglia (DRG). The results found by nociceptive evaluation by Von Frey filaments demonstrate that the previous treatment group showed a significant increase of nociceptive threshold, demonstrating nociceptive effect of RTX for previous treatment after CCI and treatment group later neuropathic pain induced by CCI It was reversed after 1 hour of RTX administration and persist for up to 24 hours. In groups of neuropathic vehicle treated animals and the false-operated group treated with vehicle and RTX there was no difference between the times and change the nociceptive threshold. In the analysis of expression of TRPV1 it was observed that the expression of TRPV1 receptors significantly reduced the late treatment group compared to the vehicle group, and previous treatment, representing depletion of the TRPV1 receptors after intrathecal administration of RTX in animals subjected to CCI. It can be concluded that the TRVP1 receptors actively participate in controlling the neuropathic pain induced antinociception, as well as intrathecal administration of RTX 1 hour before to pain model showed that effect, however the expression of TRPV1 receptors were not changed. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

A proteólise limitada de certas proteínas leva à liberação de peptídeos opióides endógenos. Vários relatos apontam que peptídeos derivados da hemoglobina como hemorfinas e hemopressinas têm efeito antinociceptivo, pela atividade de modulação de receptores acoplados a proteínas G. No presente estudo, um ensaio de captura do substrato (ECS) foi combinado com a marcação isotópica e LC-MS/MS para identificar e caracterizar um novo fragmento da hemoglobina que se liga à EP24.15. O peptídeo AGH, identificado neste trabalho, inibe respostas de hipernocicepção periféricas através de receptores opióides do tipo <font face=\"Symbol\">m . A persistência do peptídeo AGH no tecido nervoso perfundido sugere relevância fisiológica. Embora o AGH seja derivado de hemoglobina e tenha atividade opióide, falta-lhe a sequência chave das hemorfinas (YPWT), indicando que ele pode pertencer a uma nova classe de peptídeos derivados da hemoglobina. Adicionalmente, o AGH modula as interações entre as proteínas 14-3-3<font face=\"Symbol\">e e EP24.15 in vitro, podendo estar relacionado com a secreção não convencional da EP24.15. / Limited proteolysis of certain proteins leads to the release of endogenous opioid peptides. Several reports have shown that hemoglobin-derived peptides such as hemorphins and hemopressins have an antinociceptive effect by modulating GPCR activity. In the present study, a substrate capture assay (SCA) was combined with isotopic labeling and LC-MS/MS to identify and characterize a new bioactive hemoglobin fragment that binds to EP24.15. AGH, a new peptide identified in this work, inhibits peripheral hyperalgesic responses through <font face=\"Symbol\">m opioid receptors (MOR). The persistence of AGH peptide in perfused nervous tissue suggests its physiological relevance. Although AGH is derived from hemoglobin and it is a peptide with opioid activity, it lacks the key sequence of hemorphins (YPWT), indicating that it is part of a new class of peptides derived from hemoglobin. Additionally, the AGH modulates interactions between 14-3-3<font face=\"Symbol\">e and EP24.15 proteins in vitro and may be related to the unconventional EP24.15 secretion.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Lectins are non-immune (glyco)proteins that can recognize and reversibly bind to carbohydrates or other substances derived from sugars. Lonchocarpus sericeus seeds (LSL) shows a molecular mass of 23555  15 Da and a a-metyl glucopyranoside and N-acetyl-glucosamine binding specificity. The aim of this work was to evaluate the antinoceptive and antiinflammatory activity of lectin from Lonchocarpus sericeus seeds (LSL). To do so, we used swiss mice (25-35g). In the antiinflammatory activity studying, LSL (10 or 100 mg/kg; i.v.; 15 minutes) inhibited the migration (neutrophil rolling and adhesion) to the peritoneal cavities of animals stimulated with carrageenan (Cg), and the effect seems to be related to the cytokines (TNF-a and IL-1b) and chemokines (MIP-1a [CCL3], KC [CXCL1]) level reduction induced by this lectin. The LSL inhibitory effect on the neutrophil migration seems to be also related to the nitric oxide (NO) systemic levels increasing. LSL was effective on the NO increasing on animalsâ serum. The pretreatment of mice using aminoguanidin (nitric oxide reduced synthase inhibitor) reversed the antiinflammatory effect of lectin on the neutrophil migration. Still referring to the anti-inflammatory activity, LSL was effective on inhibiting the neutrophil migration to the peritoneal cavities of animals immunized and stimulated with ovalbumin (OVA), but the lectin was unable to inhibit an in vitro neutrophil migration induced by MIP-2, showing an indirect action of LSL (cytokines and chemokines) on the migration inhibition. In the antinoceptive study, LSL (3 or 10 mg/kg; i.v.; 30 minutes) reduced abdominal contortion induced by acetic acid and only decreased the second phase of formalin test, showing an activity on the inflammatory pain. In the hot plate test LSL didnât show any effects. To evaluate the anti-inflammatory pain, we did a study based on the anthihypernociceptive activity. Thus, LSL (10 or 100 mg/kg; i.v.; 15 minutes) inhibited the mechanical hypernociception induced by carrageenan and ovalbumin (immunized animals) intraplantarly administration, but not induced by prostaglandin E2. (PGE2). This effect was correlated to the block of neutrophil influx, suggested by the reduction of myeloperoxidase (MPO) levels on animalâs paws pretreated with LSL (3 or 10 mg/kg; i.v.; 15 minutes) and stimulated with carregeenan. This antihyperalgesic effect seems to be highly dependent of the cytokines (TNF-a and IL-1b) and chemokines (MIP-1a [CCL3], KC [CXCL1]) level decreasing, since LSL (10 or 100 mg/kg; i.v.; 15 minutes) reduced these mediatorsâ levels on animalâs paws pretreated with Cg (intraplantar). Corresponding to the possible central activity, LSL (10 mg/kg; i.v.) did not alter the motor activity and not provoked depression on animals. LSL acute toxicity was evaluated by treating the rats with LSL (10 mg/kg; i.v.) during seven days analyzing several parameters of the animals: kidney functions (wet weight, urea dosage), liver functions (wet weight, kinetic evaluation of aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase), heart (wet weight) stomach (wet weight and visual evaluation of possible lesions), variation in body weight of treated animals and leukogram. The obtained results didnât show any alteration on the evaluated parameters suggesting that LSL doesnât show any toxicity on animals. In conclusion, the antinoceptive and antihyperalgesic activity of LSL are associated to the inhibition of the neutrophil migration; it is probably a reflection of an inhibition on cytokines and chemokines free flowing and for the increasing of NO free flow. Additionally, this lectin doesnât show acute toxicity and central effects / Lectinas sÃo (glico)proteÃnas de origem nÃo imune e que podem reconhecer e se ligar reversivelmente a carboidratos ou a outras substÃncias derivadas de aÃÃcares. A lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL) apresenta massa molecular aparente de 23555  15 Da e especificidade de ligaÃÃo a N-acetil-glicosamina e &#945; -metil-glicopiranosÃdeo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antiinflamatÃria e antinociceptiva da Lectina de sementes de Lonchocarpus sericeus (LSL). Para tal, utilizamos camundongos Swiss albinos (25-35g). No estudo da atividade antiinflamatÃria, LSL (3 ou 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) inibiu a migraÃÃo (rolamento e adesÃo de neutrÃfilos) para a cavidade abdominal de animais estimulados com carragenina (Cg), e este efeito parece estar relacionado com a reduÃÃo dos nÃveis de citocinas (TNF-&#945; and IL-1&#946;) e quimiocinas (MIP-1&#945; [CCL3], KC [CXCL1]) por esta lectina. O efeito inibitÃrio da LSL sobre a migraÃÃo de neutrÃfilos, parece tambÃm envolver o aumento nos nÃveis sistÃmicos de Ãxido nÃtrico (NO), pois LSL (10 mg/kg; e.v.) foi capaz de aumentar os nÃveis de NO no soro de animais, e o prÃ-tratamento de camundongos com aminoguanidina (inibidor da Ãxido nÃtrico sintase induzida) foi capaz de reverter o efeito aniinflamatÃrio desta lectina sobre a migraÃÃo de neutrÃfilos. Ainda em relaÃÃo à atividade antiinflamatÃria, LSL foi capaz de inibir a migraÃÃo de neutrÃfilos para a cavidade peritoneal de animais imunizados e estimulados com ovoalbumina (OVA), porÃm, esta mesma lectina foi ineficaz em inibir a migraÃÃo de neutrÃfilos in vitro estimulada por MIP-2, demonstrando entÃo um papel indireto da LSL (reduÃÃo de citocinas e quimiocinas) na inibiÃÃo da migraÃÃo. No estudo da atividade antinociceptiva, LSL (10 ou 100 mg/kg; e.v.; 15 minutos) reduziu as contorÃÃes abdominais induzidas por Ãcido acÃtico e diminuiu somente a segunda fase do teste da formalina, demostrando uma atividade sobre a dor inflamatÃria. No teste da placa quente, LSL nÃo apresentou efeito. Para avaliar a dor inflamatÃria realizaram-se estudos de atividade antihipernociceptiva. Assim, LSL (3 ou 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) inibiu a hipernocicepÃÃo mecÃnica induzida por administraÃÃo intraplantar de carragenina e ovalbumina (animais imunizados) mas nÃo a induzida por prostaglandina E2 (PGE2). Este efeito foi correlacionado ao bloqueio do influxo de neutrÃfilos, sugerido pela reduÃÃo dos nÃveis de mieloperoxidase (MPO) nas patas de animais prÃ-tratados com LSL (3 ou 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) e estimulados com carragenina. Este efeito antihiperalgÃsico parece tambÃm depender da reduÃÃo dos nÃveis de citocinas (TNF-&#945; and IL-1&#946;) e quimiocinas (MIP-1&#945; [CCL3], KC [CXCL1]), uma vez que LSL (3 ou 10 mg/kg; e.v.; 15 minutos) reduziu os nÃveis destes mediadores no tecido da pata de animais estimulados com Cg (intraplantar). Em relaÃÃo a uma possÃvel atividade central, LSL (10 mg/kg; e.v.) nÃo alterou a atividade motora e nem provocou depressÃo nos animais. A toxicidade aguda foi avaliada pelo tratamento de camundongos com LSL (10 mg/kg; e.v.), durante sete dias consecutivos, atravÃs de vÃrios parÃmetros: funÃÃes do rim (peso Ãmido, dosagem de urÃia) e do fÃgado (peso Ãmido, avaliaÃÃo da cinÃtica da aspartato amino transaminase e alanina amino transaminase), coraÃÃo (peso Ãmido), estÃmago (peso Ãmido e avaliaÃÃo visual de possÃveis lesÃes), variaÃÃo de massa corporal dos animais tratados e leucograma. Os resultados obtidos nÃo mostraram qualquer alteraÃÃo dos parÃmetros avaliados, demonstrando que a LSL nÃo apresenta nenhuma toxicidade nos animais. Em conclusÃo, a atividade antiinflamatÃria e antinociceptiva da LSL està associada com a inibiÃÃo da migraÃÃo de neutrÃfilos, que provavelmete à reflexo da inibiÃÃo da liberaÃÃo de citocinas e quimiocinas e do aumento na liberaÃÃo de NO. Adicionalmente, esta lectina nÃo apresenta efeitos centrais nem toxicidade aguda

Orientadores: Carlos Amilcar Parada, Helder José Ceragioli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T15:58:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_PriscilaAmaral_M.pdf: 1496649 bytes, checksum: a3c769ea7d0b4a3fe45913f836d3615c (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Nanopartículas são estruturas com dimensões nanométricas que vem demonstrando um potencial para várias aplicações, inclusive na área biológica. De acordo com o seu processo de síntese e crescimento estas partículas podem possuir propriedades magnéticas com maior ou menor magnitude. O objetivo deste trabalho foi avaliar se a administração no espaço sub-aracnóide da medula espinal, de nanopartículas magnéticas altera o limiar de resposta a estímulos mecânicos aplicados em patas de ratos. As nanopartículas de carbono (nanotubos ou nanofibras) foram caracterizadas através do espectro de Raman e o seu comportamento magnético caracterizado pelo ferromagnetismo foi avaliado através da curva de histerese. As nanopartículas foram administradas via intratecal em ratos Wistar machos levemente anestesiados com Isoflorano. A resposta comportamental ao estímulo mecânico foi avaliada por um analgesímetro eletrônico (Von Frey eletrônico) que mede o limiar mecânico de retirada da pata (nocicepção mecânica). As nanopartículas foram classificadas de acordo com o comportamento magnético em: alto magnetismo e baixo magnetismo. A administração de nanopartículas (5, 20 ou 80 ?g) com alto magnetismo, mas não com baixo magnetismo, diminuiu o limiar mecânico de retirada da pata, quando comparada com a administração do seu solvente propilenoglicol (20?L). A diminuição do limiar mecânico foi observada nos tempos de 15, 30 e 60 minutos após a administração de 20?g de nanopartículas com alto magnetismo, sendo que após este período as respostas retornaram aos seus limiares basais. Por outro lado, a administração intraplantar das nanopartículas não alterou o limiar mecânico quando comparados com as respostas basais. Portanto, a administração na medula espinal, mas não no tecido periférico, de nanopartículas com alto magnetismo diminuiu o limiar mecânico. Em conclusão, os dados deste trabalho sugerem que a transmissão neuronal na medula espinal envolve uma atividade eletromagnética / Abstract: Nanoparticles are structures with nanometer dimensions that are emerging to various applications, including that one involved in biological area. According to their synthesis and growth techniques these particles can have magnetic properties with greater or lesser magnitude. The objective of this study was to evaluate whether the magnetic nanoparticles administration in the subarachnoid space of the spinal cord induces changes in the mechanical nociceptive threshold in rats hind-paw. The carbon nanoparticles (nanotubes or nanofibers) were characterized by Raman spectrum and their magnetic characterized by the ferromagnetism behavior was evaluated by the hysteresis curve. The nanoparticles were intrathecally administered in Wistar rats lightly anesthetized with Isoflorano. The behavioral response to mechanical stimulation was assessed by an electronic analgesimeter (electronic Von Frey) that measures the withdrawal mechanical threshold (mechanical nociception). The nanoparticles were classified according to their magnetic behavior in: high magnetism and low magnetism. The administration (5, 20 or 80 ?g) of high magnetism nanoparticles, but not of low magnetism nanoparticles, decreased the mechanical withdrawal threshold of the hind-paw, when compared with the administration of propylene glycol (20 ?L). Decreasing in mechanical withdrawal threshold was observed at 15, 30 and 60 minutes after administration of 20?g of high magnetism nanoparticles. After this period, the mechanical withdrawal thresholds returned to their normal baseline. In contrast, intraplantar administration of the nanoparticles did not alter the mechanical withdrawal threshold. Therefore, administration of high magnetic nanoparticles in the spinal cord, but not in peripheral tissue, decreases the mechanical withdrawal threshold. In conclusion, our data suggest that neuronal transmission in the spinal cord involves an electromagnetic activity / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

A proteólise limitada de certas proteínas leva à liberação de peptídeos opióides endógenos. Vários relatos apontam que peptídeos derivados da hemoglobina como hemorfinas e hemopressinas têm efeito antinociceptivo, pela atividade de modulação de receptores acoplados a proteínas G. No presente estudo, um ensaio de captura do substrato (ECS) foi combinado com a marcação isotópica e LC-MS/MS para identificar e caracterizar um novo fragmento da hemoglobina que se liga à EP24.15. O peptídeo AGH, identificado neste trabalho, inibe respostas de hipernocicepção periféricas através de receptores opióides do tipo <font face=\"Symbol\">m . A persistência do peptídeo AGH no tecido nervoso perfundido sugere relevância fisiológica. Embora o AGH seja derivado de hemoglobina e tenha atividade opióide, falta-lhe a sequência chave das hemorfinas (YPWT), indicando que ele pode pertencer a uma nova classe de peptídeos derivados da hemoglobina. Adicionalmente, o AGH modula as interações entre as proteínas 14-3-3<font face=\"Symbol\">e e EP24.15 in vitro, podendo estar relacionado com a secreção não convencional da EP24.15. / Limited proteolysis of certain proteins leads to the release of endogenous opioid peptides. Several reports have shown that hemoglobin-derived peptides such as hemorphins and hemopressins have an antinociceptive effect by modulating GPCR activity. In the present study, a substrate capture assay (SCA) was combined with isotopic labeling and LC-MS/MS to identify and characterize a new bioactive hemoglobin fragment that binds to EP24.15. AGH, a new peptide identified in this work, inhibits peripheral hyperalgesic responses through <font face=\"Symbol\">m opioid receptors (MOR). The persistence of AGH peptide in perfused nervous tissue suggests its physiological relevance. Although AGH is derived from hemoglobin and it is a peptide with opioid activity, it lacks the key sequence of hemorphins (YPWT), indicating that it is part of a new class of peptides derived from hemoglobin. Additionally, the AGH modulates interactions between 14-3-3<font face=\"Symbol\">e and EP24.15 proteins in vitro and may be related to the unconventional EP24.15 secretion.

INTRODUÇÃO: A toxina botulínica tipo A (TXB-A) tem sido testada no tratamento da rinite, principalmente nos casos de rinite idiopática. Sugere-se que um estado de hiper-reatividade do nervo trigêmeo esteja envolvido na fisiopatologia da rinite idiopática. O nervo trigêmeo possui fibras sensitivas não mielinizadas tipo C (FSNMT-C) que contém os neuropeptídeos substância P (SP) e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP). O óxido nítrico (NO) produzido pelas enzimas óxido nítrico sintase (NOS) também está envolvido nesse processo de neurorregulação nasal. O transporte mucociliar, mecanismo primário de defesa do sistema respiratório, é formado pelo batimento ciliar e muco nasal, e esses componentes podem ser influenciados por diferentes neuropeptídeos e neurotransmissores presentes na mucosa nasal. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da TXB-A sobre a expressão da SP, CGRP e óxido nítrico sintase neural (nNOS), além de sua influência sobre o transporte mucociliar nasal em coelhos. MÉTODOS: Coelhos machos saudáveis da linhagem Nova Zelândia foram divididos em dois grupos: o grupo tratamento recebeu TXB-A (25UI) na concha nasomaxilar (CNM) do lado direito e soro fisiológico a 0,9% (SF0,9%) na CNM esquerda. O grupo controle recebeu SF0,9% na CNM direita e nenhuma intervenção na CNM esquerda. Foram investigados os efeitos da TXB-A sobre a expressão da SP, CGRP e nNOS no tecido de CNM por meio da imuno-histoquímica. Para esta análise, dividiu-se o tecido em camada externa (CE, acima da membrana basal) e camada interna (CI, abaixo da membrana basal). Avaliou-se também a presença de apoptose celular, a frequência de batimento ciliar (FBC), o perfil histoquímico do muco nasal (glicoproteínas ácidas e neutras) e a espessura do epitélio (ESP-CE). RESULTADOS: Foi observado um aumento significativo na quantidade de células apoptóticas na CNM do grupo tratamento que recebeu TXB-A em comparação aos controles (p <= 0,001). A CNM do grupo tratamento que recebeu SF0,9% exibiu um aumento na quantidade de células apoptóticas na CI ao comparar com os controles (CNM SF0,9%, p=0,035) (CNM sem intervenção, p=0,022), e também um aumento da expressão de SP na CE em comparação aos controles (CNM SF0,9%, p=0,021) (CNM sem intervenção, p=0,040). A expressão de CGRP apresentou um aumento na CNM do grupo tratamento que recebeu TXB-A em comparação à CNM sem intervenção (p=0,008). A FBC, expressão de nNOS, perfil histoquímico do muco nasal e ESP-CE não apresentaram diferenças significativas. DISCUSSÃO: O aumento da expressão de CGRP e SP pode ter sido causado por inibição de sua exocitose vesicular pela TXB-A, levando ao seu acúmulo intracelular. Não foram observadas diferenças significativas na FBC ou perfil histoquímico do muco nasal, indicando que o aumento da expressão de CGRP e SP não foi associado à inflamação. O aumento da quantidade de células apoptóticas e da expressão de SP na CNM SF0,9% do grupo tratamento pode ter sido causado por um efeito central da TXB-A. CONCLUSÃO: A administração nasal de TXB-A aumentou a expressão de CGRP e SP, possivelmente por acúmulo intracelular por causa da inibição da sua exocitose, mas sem alterar a FBC e o perfil histoquímico do muco nasal / INTRODUCTION: Botulinum toxin type A (BoNT-A) has been assessed in the treatment of rhinitis, especially in cases of idiopathic rhinitis. Trigeminal hyper-responsiveness appears to be involved in the pathological process of idiopathic rhinitis. Trigeminal nociceptive type C unmyelinated sensory fibers contain the neuropeptides calcitonin gene-related peptide (CGRP) and substance P (SP). Nitric oxide (NO) produced by the enzyme nitric oxide synthase (NOS) are also involved in this nasal neurorregulation process. The mucociliary clearance, primary defense system of the respiratory system, is composed by the ciliary beat and nasal mucus. These components can be influenced by different nasal neuropeptides and neurotransmitters. OBJECTIVE: The aim of this study was to evaluate the effect of BoNT-A on the expression of SP, CGRP and neural nitric oxide synthase (nNOS), and its influence on nasal mucociliary clearance in rabbits. METHODS: Healthy New Zealand male rabbits were divided into two groups: the treatment group was challenged with BoNT-A (25UI) in the right nasomaxillary turbinate (NMT) and saline (SF0.9%) in the left NMT. The control group received SF0.9% in the right NMT and no-intervention in the left NMT. We investigated the effects of BoNT-A on SP, CGRP and nNOS expression in the NMT tissue by immunohistochemistry. Each area of interest was subdivided into an internal layer (IL: below the basement membrane) and outer layer (OL: above the basement membrane) for analysis. It was also assessed signs of cellular apoptosis, ciliary beat frequency (CBF), mucus histochemical profile (acidic and neutral glycoproteins) and epithelial thickness (EP-TH). RESULTS: It was observed a significant increase in the amount of apoptotic cells in the BoNT-A-challanged NMT compared with controls (p <= 0.001). The NMT of treatment group which received only SF0.9% showed an increase in the amount of apoptotic cells in the IL compared with controls (NMT SF0.9%, p = 0.035) (NMT no-intervention, p = 0.022), and also an increase in the SP expression in the OL compared with controls (NMT SF0.9%, p = 0.021) (NMT no-intervention, p = 0.040). CGRP expression showed higher expression in the BoNT-A-challanged NMT compared with no-intervention NMT (p=0.008). The CBF, nNOS expression, mucus histochemical profile and EP-TH did not show significant differences. DISCUSSION: The increased CGRP and SP expression could be due to inhibition of vesicular exocytosis by BoNT-A, leading to CGRP and SP intracellular accumulation. No significant differences in CBF or mucus histochemical profile were observed, indicating that the increased CGRP and SP expression was not associated with inflammation. The increase in the amount of apoptotic cells and SP expression in the SF0.9% NMT of treatment group may be due to a central effect of BoNT-A. CONCLUSION: Nasal administration of BoNT-A increased SP and CGRP expression, possibly via inhibition of their release, but did not change the CBF or mucus profile

INTRODUÇÃO: A toxina botulínica tipo A (TXB-A) tem sido testada no tratamento da rinite, principalmente nos casos de rinite idiopática. Sugere-se que um estado de hiper-reatividade do nervo trigêmeo esteja envolvido na fisiopatologia da rinite idiopática. O nervo trigêmeo possui fibras sensitivas não mielinizadas tipo C (FSNMT-C) que contém os neuropeptídeos substância P (SP) e peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP). O óxido nítrico (NO) produzido pelas enzimas óxido nítrico sintase (NOS) também está envolvido nesse processo de neurorregulação nasal. O transporte mucociliar, mecanismo primário de defesa do sistema respiratório, é formado pelo batimento ciliar e muco nasal, e esses componentes podem ser influenciados por diferentes neuropeptídeos e neurotransmissores presentes na mucosa nasal. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da TXB-A sobre a expressão da SP, CGRP e óxido nítrico sintase neural (nNOS), além de sua influência sobre o transporte mucociliar nasal em coelhos. MÉTODOS: Coelhos machos saudáveis da linhagem Nova Zelândia foram divididos em dois grupos: o grupo tratamento recebeu TXB-A (25UI) na concha nasomaxilar (CNM) do lado direito e soro fisiológico a 0,9% (SF0,9%) na CNM esquerda. O grupo controle recebeu SF0,9% na CNM direita e nenhuma intervenção na CNM esquerda. Foram investigados os efeitos da TXB-A sobre a expressão da SP, CGRP e nNOS no tecido de CNM por meio da imuno-histoquímica. Para esta análise, dividiu-se o tecido em camada externa (CE, acima da membrana basal) e camada interna (CI, abaixo da membrana basal). Avaliou-se também a presença de apoptose celular, a frequência de batimento ciliar (FBC), o perfil histoquímico do muco nasal (glicoproteínas ácidas e neutras) e a espessura do epitélio (ESP-CE). RESULTADOS: Foi observado um aumento significativo na quantidade de células apoptóticas na CNM do grupo tratamento que recebeu TXB-A em comparação aos controles (p <= 0,001). A CNM do grupo tratamento que recebeu SF0,9% exibiu um aumento na quantidade de células apoptóticas na CI ao comparar com os controles (CNM SF0,9%, p=0,035) (CNM sem intervenção, p=0,022), e também um aumento da expressão de SP na CE em comparação aos controles (CNM SF0,9%, p=0,021) (CNM sem intervenção, p=0,040). A expressão de CGRP apresentou um aumento na CNM do grupo tratamento que recebeu TXB-A em comparação à CNM sem intervenção (p=0,008). A FBC, expressão de nNOS, perfil histoquímico do muco nasal e ESP-CE não apresentaram diferenças significativas. DISCUSSÃO: O aumento da expressão de CGRP e SP pode ter sido causado por inibição de sua exocitose vesicular pela TXB-A, levando ao seu acúmulo intracelular. Não foram observadas diferenças significativas na FBC ou perfil histoquímico do muco nasal, indicando que o aumento da expressão de CGRP e SP não foi associado à inflamação. O aumento da quantidade de células apoptóticas e da expressão de SP na CNM SF0,9% do grupo tratamento pode ter sido causado por um efeito central da TXB-A. CONCLUSÃO: A administração nasal de TXB-A aumentou a expressão de CGRP e SP, possivelmente por acúmulo intracelular por causa da inibição da sua exocitose, mas sem alterar a FBC e o perfil histoquímico do muco nasal / INTRODUCTION: Botulinum toxin type A (BoNT-A) has been assessed in the treatment of rhinitis, especially in cases of idiopathic rhinitis. Trigeminal hyper-responsiveness appears to be involved in the pathological process of idiopathic rhinitis. Trigeminal nociceptive type C unmyelinated sensory fibers contain the neuropeptides calcitonin gene-related peptide (CGRP) and substance P (SP). Nitric oxide (NO) produced by the enzyme nitric oxide synthase (NOS) are also involved in this nasal neurorregulation process. The mucociliary clearance, primary defense system of the respiratory system, is composed by the ciliary beat and nasal mucus. These components can be influenced by different nasal neuropeptides and neurotransmitters. OBJECTIVE: The aim of this study was to evaluate the effect of BoNT-A on the expression of SP, CGRP and neural nitric oxide synthase (nNOS), and its influence on nasal mucociliary clearance in rabbits. METHODS: Healthy New Zealand male rabbits were divided into two groups: the treatment group was challenged with BoNT-A (25UI) in the right nasomaxillary turbinate (NMT) and saline (SF0.9%) in the left NMT. The control group received SF0.9% in the right NMT and no-intervention in the left NMT. We investigated the effects of BoNT-A on SP, CGRP and nNOS expression in the NMT tissue by immunohistochemistry. Each area of interest was subdivided into an internal layer (IL: below the basement membrane) and outer layer (OL: above the basement membrane) for analysis. It was also assessed signs of cellular apoptosis, ciliary beat frequency (CBF), mucus histochemical profile (acidic and neutral glycoproteins) and epithelial thickness (EP-TH). RESULTS: It was observed a significant increase in the amount of apoptotic cells in the BoNT-A-challanged NMT compared with controls (p <= 0.001). The NMT of treatment group which received only SF0.9% showed an increase in the amount of apoptotic cells in the IL compared with controls (NMT SF0.9%, p = 0.035) (NMT no-intervention, p = 0.022), and also an increase in the SP expression in the OL compared with controls (NMT SF0.9%, p = 0.021) (NMT no-intervention, p = 0.040). CGRP expression showed higher expression in the BoNT-A-challanged NMT compared with no-intervention NMT (p=0.008). The CBF, nNOS expression, mucus histochemical profile and EP-TH did not show significant differences. DISCUSSION: The increased CGRP and SP expression could be due to inhibition of vesicular exocytosis by BoNT-A, leading to CGRP and SP intracellular accumulation. No significant differences in CBF or mucus histochemical profile were observed, indicating that the increased CGRP and SP expression was not associated with inflammation. The increase in the amount of apoptotic cells and SP expression in the SF0.9% NMT of treatment group may be due to a central effect of BoNT-A. CONCLUSION: Nasal administration of BoNT-A increased SP and CGRP expression, possibly via inhibition of their release, but did not change the CBF or mucus profile