La activación glial es un proceso que se ha implicado en diversas patologías entre las que se incluyen diferentes enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer o la Esclerosis Lateral Amiotrófica. Esto se debe a que durante la activación glial se producen mediadores proinflamatorios, como la ciclooxigenasa (COX-2), el óxido nítrico (NO), factor de necrosis tumoral (TNF-alfa), la interleuquina-1 (IL-1) o la interleuquina-6 (IL-6), que presentan un potencial neurotóxico.El grupo de factores de transcripción C/EBPs (CCAAT/enhancer binding proteins) pertenecen a la familia bZIP y está compuesta por seis miembros. C/EBP-alfa, C/EBP-beta y C/EBP-delta participan en procesos como la proliferación y diferenciación celular o el control del metabolismo. Además, estos factores de transcripción se encuentran implicados en procesos inflamatorios como la respuesta de fase aguda o la activación de macrófagos, donde regulan la transcripción de muchos mediadores proinflamatorios, que se han relacionado con los efectos más neurotóxicos de la activación glial. En este trabajo se ha caracterizado la expresión de C/EBP-alfa, C/EBP-beta y C/EBP-delta en los astrocitos y la microglía en condiciones basales y también durante la activación glial. En primer lugar, C/EBP-alfa se expresa principalmente en la microglía y sus niveles disminuyen de forma tiempo y concentración dependiente cuando las células se tratan con lipopolisacárido (LPS) como estímulo proinflamatorio. Además del LPS, que es un agonista del receptor TLR4, la activación de los receptores TLR2, TLR3 y TLR9 también produce la disminución de este factor de transcripción.La síntesis de C/EBP-delta tiene lugar tanto en astrocitos como en microglía durante la activación glial in vitro, cuando estas células se tratan con LPS. Los agonistas de los receptores TLR2, TLR3 y TLR9 producen un aumento similar al producido por el LPS en las células microgliales. Dicho aumento está mediado por la actividad del enzima ERK1/2 y supone un incremento de la unión de C/EBP-delta al promotor de COX-2. En la microglía activada, C/EBP-delta forma dímeros con otros factores de transcripción como p65 (un componente de NF-kB) y C/EBP-beta.Por su parte, C/EBP-beta se encuentra presente de una forma mayoritaria en las células microgliales, aunque también se encuentra en menor cantidad en los astrocitos. El tratamiento con LPS supone el aumento tiempo y concentración dependiente de los niveles nucleares de C/EBP-beta gracias a la síntesis del novo. Este aumento está mediado por la enzima JNK. Para estudiar la funcián de C/EBP-beta en la activación glial se han generado clones de la línea microglial BV2 que sobreexpresan LIP, una isoforma de C/EBP-beta que actúa como un dominante negativo y se han utilizado ratones deficientes en C/EBP-beta. La inhibición de C/EBP-beta supone una atenuación en la producción del ARNm de los mediadores proinflamatorios NOS-II, COX-2 e IL-6 cuando las células gliales se activan, y también en la producción de NO cuando las células se tratan con LPS e IFN-gamma.Los resultados de este trabajo sugieren la implicación de C/EBP-alfa, C/EBP-beta y C/EBP-gamma en la regulación de la síntesis de diversos mediadores proinflamatorios, y su importancia en la parte más neurotóxica de la activación glial.

L’Esclerosi Lateral Amiotròfica (ELA o ALS) és una malaltia neuromuscular caracteritzada per la degeneració selectiva de les motoneurones (MN) superiors e inferiors del còrtex motor, el tronc de l’encèfal i la medul•la espinal, que resulta en una debilitat, espasticitat i atròfia progressives de la musculatura. Menys del 10% dels casos corresponen a la forma familiar de la malaltia, i un 20% d’aquests estan relacionats a mutacions en el gen de l’enzim superòxid dismutasa 1 (mSOD1). La resta de casos corresponen a la forma esporàdica. Les causes implicades en la degeneració selectiva de les MN en la ELA són encara desconegudes. La seva patogènesi s’ha atribuït a diversos mecanismes com serien l’estrès oxidatiu, l’agregació proteica anormal, la disfunció mitocondrial, el transport axonal aberrant, la neuroinflamació, l’autoimmunitat o l’excitotoxicitat per glutamat. En el present estudi hem treballat amb dues d’aquestes hipòtesis en avaluar l’efecte dels sèrums de pacients amb ELA i altres malalties de la MN sobre l’activitat del receptor ionotròpic de glutamat de tipus N-metil-D-Aspartat (NMDAR), expressat en el model d’oòcit de Xenopus laevis. Mitjançant assaigs de ELISA hem analitzat la presència d’autoanticossos associats a ELA en el sèrum de pacients. L’acció dels sèrums control i patològics en els oòcits de Xenopus produïa la generació de corrents oscil•latoris de clorur (Cl-). Aquests corrents havien estat prèviament descrits en aquestes cèl•lules i són deguts a l’activació dels canals de Cl- dependents de calci (Ca2+), endògens en els oòcits de Xenopus, a causa de la mobilització de Ca2+ intracel•lular. L’alliberació de Ca2+ dels compartiments intracel•lulars es activada per l’acció d’un factor sèric, anomenat àcid lisofosfatídic o lisofosfatidat (LPA), sobre el seu receptor, present en la membrana dels oòcits, i a través d’una via de senyalització de segons missatgers. Així doncs, en aquest model, la generació de corrents oscil•latoris de Cl- és una mesura indirecta de la mobilització intracel•lular de Ca2+. En presència del NMDAR, les respostes generades pel sèrum ELA eren significativament superiors a les activades pel sèrum d’individus sans i d’altres malalties de la MN. La resposta generada pel sèrum ELA presentava una dependència respecte de la presència de les dues subunitats del NMDAR i era sensible al bloqueig del receptor amb MK-801, un antagonista no competitiu. Vàrem reproduir els experiments amb sèrums del model de rata transgènica mSOD1 G93A, considerat un model de la forma familiar de la malaltia. Les mostres de sèrum mSOD1 G93A generaven, en presència del NMDAR, respostes significativament superiors a les activades pel sèrum de rata WT. En analitzar l’acció de la fracció de IgG purificada dels sèrums control i patològics en el model d’oòcit de Xenopus, es generaven corrents transitoris d’entrada de tipus no oscil•latori, els quals diferien dels generats en el cas del sèrum complet. La resposta activada per IgG de pacients amb ELA en presència del NMDAR era també significativament superior a la generada per les IgG d’individus sans. En la segona part d’aquest estudi s’ha comprovat la presència d’anticossos contra la proteïna Semaforina 3A (Sema3A) en alguns sèrums de ELA i Lower Motor Neuron Disease (LMND), una altra forma comuna de malaltia de la MN. La Sema3A és una molècula quimiotàctica de guia axonal recentment relacionada amb la patologia de la ELA en detectar-se una sobreexpressió d’aquesta proteïna en cèl•lules de Schwann terminals del model de ratolí mSOD1 G93A. Tot i descartar-se que els anticossos contra Sema3A siguin un marcador específic de la ELA, al no detectar-se en tots el sèrums de pacients, i alhora, al estar presents també en algunes mostres LMND, aquests autoanticossos podrien tenir un efecte defensiu contra les senyals nocives exercides per Sema3A sobre els axons de les MN. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a devastating neuromuscular disease, characterized by the selective degeneration of the superior motor neurons in the motor cortex and of the inferior motor neurons in the brain-stem and spinal cord. The familial form of the illness is associated with the mutation of the superoxide dismutase enzyme (SOD-1). This and other mutations accounts for fewer than 10% of cases; the rest, more than 90%, correspond to the sporadic form. In this study we tested the effect of sera from sporadic ALS patients and from mutated human SOD-1 (mSOD1 G93A) transgenic rats on N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAR). We hypothesize that an endogenous excitotoxic factor is implicated in neuronal death in ALS, mediated by the activation of NMDAR noncanonical signalling pathways. Sera from ALS patients or healthy subjects were pretreated to inactivate complement pathways and dialysed to remove glutamate. Sera from mSOD1 G93A rats were obtained at different stages of the neurodegenerative progression. Sera from transgenic rats were also pretreated to eliminate complement system and glutamate. Immunoglobulins G (IgGs) from ALS patients and healthy subjects were obtained by affinity chromatography and dialyzed against phosphate-buffered saline. Human NMDAR were expressed in Xenopus laevis oocytes, and glutamate-induced currents were recorded using the two electrode voltage clamp technique. We observed that sera from sporadic ALS patients induced transient oscillatory currents in Xenopus oocytes expressing NMDAR with a total electric charge significantly higher than the electric charge carried by currents induced by sera from healthy subjects. The currents were inhibited by MK-801, a noncompetitive blocker of NMDAR. Results of sera from mSOD1 G93A transgenic rats were similar to those of sera from ALS patients; samples from patients with another type of neuromuscular disease did not exert this effect. IgG from ALS patients have a significant effect on NMDAR-injected oocytes and that response was doubled respect to the observed in the case of IgG from healthy subjects. Our data agree with the view that ALS patients sera contain some soluble factors that activates NMDAR, not opening directly the ionic conductance, but activating a non-canonical pathway.

S'ha establert un sistema de cultiu organotípic de motoneurones (MNs)madures d'embrió de pollastre del dia embrionari (E) 16. Aquestes MNs, tot i serresistents a l'axotomia in vivo, moren en absència d'un suport tròfic exogen,majoritàriament durant els primers 7 dies in vitro (DIV). Després de testar els efectesde 15 factors tròfics (FTs) diferents, el GDNF ha resultat ser el FT més potentpromovent la supervivència de les MNs a llarg termini (fins als 28 DIV). A més, lapresència del GDNF al medi de cultiu ha afavorit l'expressió en les MNs dels mRNAsdel seu receptor Ret i del seu coreceptor GFRa1, afavorint la capacitat de respostasostinguda de les MNs a aquest FT. En aquest cultiu, s'ha evidenciat que el GDNF éscapaç de promoure la supervivència i la maduració a llarg termini de les MNs a travésde l'activació de la via de la PI3K. El GDNF ha reduït el percentatge de MNs caspasa-3activa positives que es detecten en absència de FT. Tot i que l'increment de cAMP ila despolarització amb K+ han permès rescatar les MNs de la mort que té lloc durantels primers 7 DIV no han resultat ser aproximacions vàlides per afavorir lasupervivència de les MNs a llarg termini. En aquest sistema, l'activació microglialpermanent amb LPS des dels 7 DIV provoca la mort de les MNs en aquests cultius.Considerant l'excitotoxicitat com la hipòtesi més plausible per explicarl'afectació selectiva de les MNs en l'ELA, hem assajat l'acció de diversos agonistes deglutamat sobre els cultius organotípics. En aquest sistema, les MNs mantenen lavulnerabilitat a les excitotoxines. L'àcid kaínic ha resultat ser l'agonistaglutamatèrgic més potent sobre les MNs actuant a través dels receptors ionotròpicsAMPA/KA. Les MNs també s'han mostrat vulnerables a una inhibició mitocondrialcrònica amb toxines mitocondrials i, en tal situació, degeneren i moren mitjançantun mecanisme excitotòxic.Finalment, hem avaluat els possibles efectes antiapoptòtics i antiexcitotòxicsdel liti sobre les MNs. El liti administrat in ovo durant l'etapa de la mort celBlularprogramada de les MNs (E6-E10) no ha rescatat aquestes neurones de la mortapoptòtica natural però actua com a agent neuroprotector enfront d'una lesióexcitotòxica amb kainat en el nostre sistema in vitro. Aquest rescat de les MNs de lamort excitotòxica s'ha acompanyat de la preservació de la ultrastructuramitocondrial i nuclear de les MNs. No obstant, el liti provoca alteracions estructuralscom l'acúmul de microtúbuls i de neurofilaments fosforilats en els eferoides axonals,l'increment de dense core vesicles i l'activació de l'autofàgia en les MNs. Hem posatde manifest que les dianes intracelBlulars del liti implicades en els seus efectesantiexcitotòxics són l'activació la via de la PI3K, la fosforilació/inhibició de la GSK-3bi possiblement una modulació diferencial de la fosforilació de les isoformes JNK.