Les malalties del cervell representen avui en dia un dels problemes de salut més importants del món desenvolupat, tant pel que fa a malalties neurològiques d’ampli abast, com la malaltia d’Alzheimer, com pel que fa a malalties psiquiàtriques greus, com l’esquizofrènia i la depressió. Els costos socioeconòmics directes (tractaments) i indirectes (baixes laborals, incidència familiar, atenció al malalt, etc.) de les malalties del cervell a la UE dels 25 pugen fins als 286.000 milions de € anuals, dels quals gairebé 240.000 milions són deguts a malalties mentals (Andlin-Sobocki et al., 2005). Dins d’aquestes, depressió i esquizofrènia. La prevenció i correcte tractament d’aquestes dues malalties representen avui en dia un dels reptes més importants de la Neurociència.

En els últims anys, diversos treballs han demostrat que els astròcits participen activament en el desenvolupament i la plasticitat del sistema nerviós central, així com en la modulació de la neurotransmissió. Característicament, la majoria de les accions descrites dels astròcits sobre la fisiologia i la patologia neuronal són mitjançades per secreció vesicular. En el aquest treball s’han identificat les molècules implicades en l’exocitosi de cèl•lules astroglials. Malgrat que alguns components són comuns amb les neurones, altres com sintaxina 4, VAMP3 i SNAP23 s’expressen de forma específica en les cèl•lules astroglials. Tractaments activadors o de maduració diferencialment regulen l’expressió de diferents isoformes de proteïnes exocítiques en cèl•lules glials in vitro. Així, l’activació amb citocines proinflamatòries augmenta l’expressió d’algunes SNAREs i els seus reguladors en glia, com sintaxina4 i munc18b. La correlació entre els nivells d’expressió d’aquestes proteïnes exocítiques i l’augment de la secreció de mediadors d’activació i inflamació suggereix un important paper d’aquestes molècules en la secreció de cèl•lules activades. Amb l’objectiu d’estudiar la secreció regulada per calci en astròcits madurs s’ha obtingut un fenotip madur glial in vitro mitjançant l’activació de la via del AMPc. L’anàlisi global amb "gene set enrichment analysis" del transcriptoma astrocitari ha demostrat que l’increment en els nivells intracel•lulars d’AMPc reprimeix la immaduresa i activació dels astròcits i promou la seva maduració. Aquesta maduració dependent de la via del AMPc augmenta l’expressió de proteïnes exocítiques, com per exemple VAMP2, així com la via de secreció regulada per calci dels pèptids ANP i SgII. Finalment, mitjançant assajos de pèrdua de funció, es demostra un paper d’aquestes proteïnes en la secreció de pèptids glials. Aquests resultats suggereixen que diferents molècules d’exocitosi mitjancen diferents processos de secreció glials. Per altra banda, en aquesta tesi s’ha identificat un nou component de la via de secreció astroglial, tant in vitro com in vivo, la SgIII. En cèl•lules neuroendocrines SgIII actua com un receptor de direccionament a grànuls secretors. En cèl•lules astroglials SgIII presenta una forma molecular i una dinàmica de secreció diferencial a cèl•lules neuroendocrines. A més, hem demostrat una notable sobreexpressió d’aquesta proteïna en astròcits reactius en lesions traumàtiques, la qual cosa suggereix una participació de SgIII en els mecanismes de protecció o dany cerebral en lesions del sistema nerviós central. / In recent years, several studies have demonstrated that astrocytes influences neuronal development, function and plasticity through vesicular transmitter release. However, secretory pathways and the involved molecular mechanisms in astroglial cells are poorly known. In this study, we showed that a variety of SNARE and Munc18 isoforms were expressed by cultured astrocytes, with syntaxin-4, Munc18c, SNAP-23 and VAMP-3 being the most abundant variants. Exocytotic protein expression was differentially regulated by activating and differentiating agents. Specifically, proteins controlling Ca2+-dependent secretion in neuroendocrine cells were up-regulated after long-term 8Br-cAMP administration in astrocytes, but not by proinflammatory cytokines. We also analyzed the global transcriptome of cultured astroglial cells incubated with activators of cAMP pathways. cAMP analogs strongly upregulated genes involved in typical functions of mature astrocytes, whereas they downregulated a considerable number of proliferating and immaturity-related transcripts. Gene Set Enrichment Analysis and evaluation in situ of gene expression in astrocytes in different states showed that cAMP signaling conferred a mature and in vivo–like transcriptional profile to cultured astrocytes. Moreover, 8Br-cAMP treatment greatly increased the cellular content of exocytotic proteins such as VAMP-2 and stimulated Ca2+-dependent secretion of secretogranin-2 and ANP. Regulation of both exocytotic protein expression and Ca2+-dependent peptide secretion in astrocytes by differentiating and activating agents suggested that glial secretory pathways were adjusted in different physiological states. In this thesis, we showed the expression, transcriptional regulation, trafficking and release of the secretory pathway component SgIII in astroglial cells. In endocrine cells, SgIII is a key sorting receptor for peptide hormones while astrocytes produced and released a non-processed form. Moreover, SgIII expression was specifically upregulated in reactive astrocytes after perforating brain injury. These results showed that SgIII is a reliable component of the astrocyte secretory pathway and suggest important roles for glial SgIII in the glia–neuron communication.

La corteza prefrontal (CPF) juega un papel crucial en funciones cerebrales superiores como la cognición, siendo la corteza cerebral más evolucionada en humanos. La corteza cerebral está densamente inervada por aferencias aminérgicas que se originan en el cerebro medio: los núcleos del rafe (NR), el locus coeruleus y el área tegmental ventral, que ejercen un papel neuromodulador de la actividad cortical. Estudios en humanos han implicado a la CPF en patologías psiquiátricas severas como la depresión o la esquizofrenia. A su vez, la mayor parte de los fármacos antidepresivos utilizados actualmente (inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina) tienen al sistema serotoninérgico como diana terapéutica. En la presente Tesis se ha estudiado el circuito que se establece entre la CPF medial (CPFm) y los núcleos dorsal y medial del rafe (NDR y NMR) con el objetivo principal de conocer cómo se controlan recíprocamente estas dos áreas cerebrales. Para ello hemos utilizado microdiálisis intracerebral en rata despierta y electrofisiología unitaria extracelular en animal anestesiado.Específicamente, hemos descrito el mecanismo utilizado por la CPFm para controlar la actividad de las neuronas serotoninérgicas del NDR. Este mecanismo implica una excitación inicial glutamatérgica a través de receptores iGluR (NMDA y AMPA/KA), tras lo cual aumenta la liberación de serotonina en el NDR, que inhibe a otras neuronas serotoninérgicas a través de receptores 5-HT1A. Adicionalmente, la excitación de interneuronas GABAérgicas de los NR inhibe a las neuronas serotoninérgicas a través de receptores GABAA. La CPFm expresa receptores para la serotonina 5-HT1A (inhibitorios) y 5-HT2A (excitatorios) abundantemente, pero se desconoce su localización exacta y su papel funcional. Nuestros trabajos muestran cómo la activación de estos receptores corticales disminuye y aumenta, respectivamente, la actividad de las neuronas serotoninérgicas del NDR y la liberación de serotonina en la CPFm. Además, la activación cortical de receptores 5-HT2A por el alucinógeno DOI aumenta de forma global la actividad de las neuronas piramidales de la CPFm y con ello la actividad del circuito, traduciéndose en un aumento en la liberación cortical de serotonina. Así, el aumento de la actividad de las neuronas piramidales por receptores AMPA, ya sea administrando AMPA o aumentando las concentraciones extracelulares de glutamato endógeno mediante la desinhibición del tálamo, incrementan la liberación cortical de serotonina en respuesta al aumento en la actividad del circuito CPFm-NR. Estos resultados sugieren un efecto sinérgico parecido a la LTP entre la activación de receptores 5-HT2A corticales y receptores AMPA. Paralelamente, experimentos farmacológicos y lesiones del tálamo muestran que los receptores 5-HT2A responsables de la excitación piramidal inducida por DOI no se encuentran en terminales talamocorticales.Además, describimos un efecto global inhibitorio de la serotonina en la CPF. Hemos caracterizado la presencia de receptores 5-HT1A y 5-HT2A en neuronas piramidales de CPFm, que están ampliamente coexpresados y cuya actividad induce respuestas opuestas en la actividad piramidal. Se ha propuesto una localización de los receptores 5-HT1A y 5-HT2A en distintos compartimentos de las neuronas piramidales: los primeros se localizarían en el cono axonal (un lugar muy importante para la generación del potencial de acción) mientras que los segundos se encontrarían en la dendrita apical. El importante papel inhibidor de los receptores 5-HT1A en la generación del potencial de acción y la posible existencia de proyecciones GABAérgicas desde los NR explicarían el predominante papel inhibitorio que los NR ejercen en la CPFm.Finalmente describimos la presencia de receptores 5-HT3 en un conjunto de neuronas corticales localizadas cerca de la línea media, posiblemente GABAérgicas, que controlarían la actividad piramidal a nivel de su dendrita apical.Estos resultados ayudan a comprender el funcionamiento de la CPF y el papel de la serotonina en la función cerebral. / The prefrontal cortex (PFC) plays a crucial role in higher brain functions like cognition. It receives a dense innervation from the brainstem aminergic nuclei, including the serotonergic dorsal and median raphe nuclei (DR, MnR). Although the exact role of serotonergic neurotransmission in PFC remains largely unknown, the PFC contains a very large density or serotonin 5-HT1A (inhibitory) and 5-HT2A (excitatory) receptors. In addition, hallucinogens like LSD or DOI are agonists and atypical antipsychotics are antagonists at 5-HT2A receptors. Furthermore, most of the antidrepressants (selective serotonin reuptake inhibitors) target the serotonergic system.As the PFC and the raphe nuclei are implicated in major depression and schizophrenia, the main goal of this Doctoral Thesis has been to analize the circuit PFC-raphe nuclei. For this purpose we have used the microdialysis technique and single-unit extracellular recordings. Firstly, our results indicate a complex regulation of DR serotonergic neurons by medial PFC (mPFC) afferents. An initial excitation of some serotonergic neurons by descending excitatory fibers releases serotonin, which inhibits other DR neurons by acting on 5-HT1A autoreceptors. Afferents from the mPFC also inhibit serotonergic neurons through the activation of GABAergic interneurons.Secondly, the activation of 5-HT1A and 5-HT2A receptors in the mPFC decreases and increases, respectively, DR serotonergic neuron activity and serotonin release in the mPFC. Additionally, DOI-induced activation of cortical 5-HT2A receptor increases pyramidal activity. Likewise, the increase in piramidal activity through AMPA receptors, induced by locally AMPA administration or thalamic disinhibition increases cortical serotonin release. However, 5-HT2A receptors responsible for DOI cortical excitation are unrelated to thalamocortical afferents.Moreover, we report an overall inhibitory effect of raphe nuclei stimulation on PFC activity. Our results show a large coexpression of 5-HT1A and 5-HT2A receptors in pyramidal neurons of the PFC that exert opposite effects on pyramidal activity. 5-HT2A receptors are enriched in apical dendrites of pyramidal neurons. 5-HT1A receptors are mainly localized in the axon hillock, that would assign a prominent inhibitory role in the control of pyramidal activity. Our in vivo data also suggest the existence of a GABAergic projection from the raphe nuclei to the mPFC.Finally, we describe a subpopulation of cortical 5-HT3-expressing neurons, possibly GABAergic, localized near the midline that control pyramidal activity at the apical dendrite level.