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Nova classe de inibidor de serinopeptidase presente na peçonha do escorpião Tityus obscurusMourão, Caroline Barbosa Farias 15 March 2016 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2017-05-20T13:22:39Z
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Previous issue date: 2017-05-20 / O interesse na caracterização de novos inibidores de peptidases (PIs) tem
aumentado nas últimas décadas devido a seu potencial uso na prevenção e tratamento de
diversas doenças humanas. Muitos PIs já foram caracterizados de animais venenosos e
peçonhentos, como anêmonas, serpentes, anuros e, mais recentemente, escorpiões e
aranhas. Nesse estudo apresentamos uma nova classe de inibidor de serinopeptidase
isolado da peçonha do escorpião Tityus obscurus (Buthidae), responsável por muitos casos de envenenamento na região Amazônica. Denominado ToPI1, ele foi purificado da peçonha bruta por RP-HPLC, e sua sequência foi determinada por MALDI-ISD e pela análise de seu precursor, obtido da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha do T. obscurus. O ToPI1 compartilha menos de 45% de similaridade com outros peptídeos descritos em bancos de dados públicos. Ainda assim, todas eles são bloqueadores ou possíveis bloqueadores de canais de K+, não havendo similaridade com nenhum PI descrito até o momento. O peptídeo sintético oxidado (ToPI1s), obtido usando a estratégia Fmoc/t-butila, foi ativo contra tripsina em ensaios cromogênicos, mostrando-se do tipo tight-binding, e também por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR), em um biossensor Biacore 3000, onde apresentou afinidade picomolar por tripsina imobilizada. Os resultados indicaram que a
formação do complexo ToPI1:tripsina é espontânea, endotérmica e favorecida por um
aumento de entropia. Experimentos em SPR indicaram que o ToPI1s se liga ao sítio ativo da tripsina, semelhante aos inibidores canônicos. O ToPI1s não inibiu quimotripsina mesmo em concentrações elevadas. Também não reduziu a viabilidade de células tumorais HeLa (de câncer cervical humano) e B16F10 (de melanoma murino) nem de fibroblastos murinos não tumorais (NIH-3T3). Seu efeito foi mínimo ou nulo nas correntes de diferentes subtipos de canais de K+. O ToPI1s não causou alterações comportamentais e/ou fisiológicas visíveis em camundongos. A potente atividade inibidora de tripsina do ToPI1s em conjunto com esses resultados negativos o tornam um candidato atrativo para futuras aplicações terapêuticas. Análises por dicroísmo circular (190-260 nm) sugerem ausência de diferenças de estrutura secundária entre o ToPI1 nativo e o ToPI1s, com predominância de estruturas do tipo β (folhas-β e voltas-β) e desordenadas, e menor quantidade de α-hélice. O ToPI1s mostrou-se bastante estável, não desnaturando na faixa de pH 3,0-9,0 mesmo a 95°C. Dois análogos do ToPI1 foram sintetizados, os quais estão sob processo de proteção à propriedade intelectual. / The interest in the characterization of new peptidase inhibitors (PIs) has increased
in recent decades due to their potential use in the prevention and treatment of several
human diseases. Many PIs from poisonous and venomous animals such as sea anemones,
snakes, anurans and, more recently, scorpions and spiders have been characterized. In the
present study we present a new class of serinopeptidase inhibitor isolated from Tityus
obscurus scorpion venom. This species (Buthidae) is responsible for many cases of
envenomation in the Amazon region.
Named ToPI1, it was purified from the crude venom by RP-HPLC and its sequence
was determined by MALDI-ISD and by the analysis of its precursor, obtained from the cDNA
library of T. obscurus venom gland. ToPI1 shares less than 45% sequence similarity with
other peptides described in public databases. Still, they are all blockers or potential
blockers of K+ channels, with no similarity to any PI described so far. The oxidized synthetic
peptide (ToPI1s), obtained by using the Fmoc/t-butyl strategy, was active against trypsin in
chromogenic assays, displaying tight-binding inhibition, and also by Surface Plasmon
Resonance (SPR) in a Biacore 3000 biosensor, where it showed picomolar affinity to
immobilized trypsin. The results indicated that the formation of the bimolecular complex
ToPI1:trypsin is spontaneous, endothermic and favored by an entropy increase.
SPR experiments indicated that ToPI1s binds to the active site of trypsin, similar to
the canonical inhibitors. ToPI1s did not inhibit chymotrypsin even at high doses. In addition,
it reduced neither the viability of the tumor cells HeLa (from human cervical cancer) and
B16F10 (from murine melanoma) nor of non-tumor murine fibroblasts (NIH-3T3). It showed
minimal or null effect on the currents of different subtypes of K+ channels. The ToPI1s did
not cause any visible behavioral and/or physiological changes in mice. The potent trypsin
inhibitory activity of ToPI1s together with these negative results make it an attractive
candidate for future therapeutic purposes. Analysis by circular dichroism (190-260 nm)
suggests the absence of differences in secondary structures between ToPI1s and the native
ToPI1, with predominance of β-type structures (β-sheets and β-turns) and randon coil, and
a smaller amount of α-helix. The ToPI1s proved to be very stable, non-denaturing at the
range of pH 3.0 to 9.0 even at 95 °C. Two ToPI1 analogues were synthesized, which are
under process of intellectual property protection.
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Caracterização química e atividade biológica de peptídeos presentes na peçonha do escorpião brasileiro Opisthacanthus cayaporumCamargos, Thalita Soares 29 July 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-04-14T12:41:31Z
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Previous issue date: 2009-07-29 / A peçonha de escorpiões é conhecida por ser uma complexa mistura de moléculas capazes de exercer as mais diversas funções. As mais estudadas são as que atuam em canais iônicos, especialmente nos canais seletivos aos íons Na+ e K+, os responsáveis pela transmissão da informação nervosa. Além dessas moléculas, existe uma família de peptídeos sem pontes dissulfeto, chamados de NDBP (Non Dissulfide Brigded Peptides), que podem agir como formadores de poros em membranas, como antimicrobianos e citolíticos, e/ou potencializadores de bradicinina. O presente trabalho demonstra a riqueza de moléculas presentes na peçonha do escorpião brasileiro Opisthacanthus cayaporum. A caracterização de uma molécula bloqueadora de canal para K+, membro da família das κ-KTx, sistematicamente chamada de κ-KTx2.5, mostrou que esta molécula forma α-hélices em ambiente hidrofílico e é capaz de bloquear canais de K+ dos subtipos hKV1.1 e 1.4. As sequências parciais de uma molécula da família das Escorpinas e de um NDBP também são descritas no presente trabalho. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Scorpions venom is a rich source of molecules with variable functions. The most studied are those that act on ion channels, particularly those selective for Na + and K +, which are responsible for the cell excitability. Besides these compounds, a family of peptides without disulfide bridges, called NDBP (Non Dissulfide Brigded Peptides), which act as pores formers in membranes, holding antimicrobial and cytolytic activities, and as bradykinin potentiators. This study demonstrates the richness of molecules present in the venom of Brazilian scorpion Opisthacanthus cayaporum. The characterization of a K +-channel blocker, for member of the family of κ-KTx, and systematically called here as κ-KTx2.5, showed that this molecule form α-helix in an hydrophilic environment, and is able to blockhKV1.1 and 1.4 K+-channel subtypes. The partial sequence of a molecule belonging to the Escorpine family and a NDBP are also described in the work.
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Prospecção da peçonha do escorpião Tityus fasciolatus sob a perspectiva proteômica e transcritômica, e caracterização biológica de peptídeos moduladores de canais de Na+Camargos, Thalita Soares 17 October 2014 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, Departamento de Ciências Fisiológicas, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-08T20:32:58Z
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2014_ThalitaSoaresCamargos_Parcial.pdf: 3765440 bytes, checksum: 4c947e78d1cc1b6d98d492ae3ecbb73e (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-05-11T18:04:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1
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2014_ThalitaSoaresCamargos_Parcial.pdf: 3765440 bytes, checksum: 4c947e78d1cc1b6d98d492ae3ecbb73e (MD5) / O escorpião Tityus fasciolatus faz parte da família Buthidae, que contém espécies causadoras de envenenamentos graves em humanos. As moléculas responsáveis pelos efeitos mais severos são conhecidas como neurotoxinas que, em sua maioria, são componentes peptídicos cujos principais alvos são os canais iônicos, os quais são relevantes para o funcionamento dos diversos sistemas orgânicos. Os compostos relacionados aos envenenamentos por peçonhas de escorpiões são conhecidos por agirem com especificidade nos canais iônicos. Os constituintes proteicos de T. fasciolatus foram caracterizados com o auxílio de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC), com coluna C18 analítica, espectrometria de massa MALDI/ TOF-MS e uma biblioteca transcritômica da glândula de peçonha. Mais de 200 diferentes massas moleculares foram identificadas nas frações cromatográficas, assim como 9.130 transcritos na biblioteca transcritômica, dentre os quais foram identifcados 278 que codificam toxinas. A atividade biológica de três toxinas e de uma fração foram testadas com canais iônicos expressos em oócitos de Xenopus laevis, através da técnica de Voltage clamp de dois eletrodos. Foram utilizados canais de Na+ de mamíferos hNav1.1/1, hNav1.2/1, hNav1.3/1, hNav1.4/1, hNav1.5/1, hNav1.6/1, hNav1.7/1 e rNav1.8/1. Duas toxinas (Tf3 e Tf4) foram classificadas como -NaScTx (Sodium Scorpion Toxins), por causarem aumento da corrente de Na+ e retardo da inativação rápida do canal. A Tf3 foi ativa em hNav 1.1 à hNav1.7, enquanto a Tf4 agiu apenas nos hNav1.2 e hNav1.7. A fração 63 também apresentou atividade α, sendo sua atividade significativa em hNav1.7. A toxina Tf2 foi identificada como -NaScTx, cuja característica é a ativação dos canais de Na+ em potenciais onde antes os canais estavam em repouso. Dentre os oito canais de Na+ de mamífero testados, a Tf2 foi seletiva para hNav1.3, à concentração de 1M. Além da descrição da atividades dessas toxinas de Na+, este trabalho gerou um acervo de sequências de nucleotídeos e resíduos de aminoácidos, um perfil das massas moleculares associadas aos seus respectivos tempos de retenção, 18 sequências de prováveis NaScTxs e 15 sequências de prováveis KTxs. ______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Tityus fasciolatus is a scorpion belonging to the Buthidae family, known by the
species that cause severe evenomation in humans. The molecules responsible for the
most severe effects are known as neurotoxins, which are mostly peptide components,
targeting ion channels, which are relevant to the functioning of the various organ
systems. The compounds responsible for envenomation are usually known to act with
specificity on ion channels. The proteic components of T. fasciolatus venom were
analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), MALDI/TOF mass
spectrometry and a transcriptomic library of the venom gland. More than 200 different
molecular masses were detected in chromatographic fractions, as well as 9,130
transcripts that encode compounds, among them 278 encode toxins. Two Electrodes
Voltage Clamp was used to test the biological activity of three toxins and a fraction in
Xenopus laevis oocytes expressing ion channels. The Nav channels used were all
mammals, hNav1.1/1, hNav1.2/1, hNav1.3/1, hNav1.4/1, hNav1.5/1, hNav1.6/1,
hNav1.7/1 and rNav1.8/1. Two toxins (Tf3 and Tf4) were classified as -NaScTx
(Sodium Scorpion toxins), since they cause an increase in Na+
currents and a delay in
the rapid inactivation of the channel (Tf3 and Tf4). The Tf3 was active in hNav 1.1 to
hNav1.7, while Tf4 affected only hNav1.2 and hNav1.7. Fraction 63 also showed α
activity in hNav1.7. Tf2 was identified as β-NaScTx, whose characteristic is the
activation of Nav channels at more negative potentials. Among the eight mammal Nav
channels tested, Tf2 was hNav1.3 selective, at 1μM. This work led to a collection of
sequences of nucleotides and amino acid residues, a molecular mass profile with their
respective retention times, and 18 putative NaScTxs and 15 putative KTxs sequences.
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Análises epidemiológica, de distribuição geográfica e genética dos escorpiões que ocorrem no Estado do Amazonas, BrasilCosta, Cícero Lucinaldo Soares de Oliveira 30 November 2016 (has links)
Submitted by Inácio de Oliveira Lima Neto (inacio.neto@inpa.gov.br) on 2017-11-29T19:45:38Z
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Previous issue date: 2016-11-30 / Scorpions are invertebrates from the order Scorpiones (Arachnida). Although it is a diverse
group and important from a medical perspective, there are very few studies on scorpions in Amazonas, the state with the largest scorpionfauna of Brazil. This lack of data is associated mainly to the low number of specialists in the region. Thus, and taking into account that knowledge is an important step in decision making, this research has three different proposals: first (chapter I), to cover the current situation of scorpionism (accidents with scorpions) in the state; second (chapter II), to present the geographical distribution of scorpion species in Amazonas; and third (chapter III), to sequence the 16S gene, for as many scorpion species as possible so that this data can be used in taxonomical and phylogenetic studies. For the first objective, the Sistema Nacional de Agravos e Notificações – SINAN was accessed to obtain data on envenomations that occurred in the state of Amazonas between 2008 and 2014. Information from the arachnid collections of Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia - INPA, Universidade Federal do Amazonas - UFAM and Fundação de Medicina Tropical do Amazonas - FMT/AM, field collecting and literature data were used as data for the second chapter. Specimens from the above mentioned collections and from the field collecting were used to obtain the genetic sequences for the chapter III proposal. Results demonstrate that, although the average annual rate of scorpionism in Amazonas is of 8.14 cases per 100 thousand habitants, which is below the national average (17.7), some of its regions presented alarming rates. Among these, the municipality of Apuí is highlighted with 273 cases per 100 thousand habitants. This study demonstrated that the species Tityus metuendus, T. matthieseni, T. bastosi and T. silvestris are the main ones involved in accidents in the municipalities of Manaus, Apuí, Tabatinga and Rio Preto da Eva, respectively. The geographical distribution results of chapter II reinforce the status of Amazonas as the Brazilian state with the largest scorpionfauna of the country, however the species distribution is still not completely known. Furthermore, the distributional data confirmed the endemism of the Rio Negro and Manaus regions, placing the former, for the first time, as the region with the highest number of endemic species of the state (17 spp.). The findings from the molecular study (chapter III) demonstrate that the nucleotide intra-specific divergence was smaller than the inter-specific divergence, confirming data from the literature. Based on the trees from the Maximum Parsimony and Neighbor-Joining analyses it is possible to assume that the Tityus grouping is in accordance to what is presented by traditional taxonomy. The findings
regarding the species Brotheas amazonicus, Broteochactas polisi and Chactopsis amazonicus, all from the family Chactidae, can help clarify or even resolve the issue regarding the placement of the genus Chactopsis in this family. All proposals presented for the current study were met and the results obtained will certainly be used as base for other researches or even in decision making regarding scorpionism in Amazonas. / Os escorpiões são invertebrados que pertencem à ordem Scorpiones, classe Arachnida. Embora seja um grupo diverso e importante do ponto de vista médico, são poucos estudados no Estado do Amazonas, estado detentor da maior escorpionfauna brasileira. A carência de dados é associada, principalmente, ao baixo número de especialistas na região. Diante disso, e considerando que o conhecimento é um passo importante para a tomada de decisões, é que a presente pesquisa apresentou três propostas diferentes. A primeira (capítulo I) abordou a situação do escorpionismo (acidentes por escorpiões) no estado. A segunda (capítulo II) revelou o atual contexto da distribuição geográfica das espécies que ocorrem no Amazonas. A terceira (capítulo III) utilizou-se a ferramenta molecular, por meio do DNA mitocondrial (16S), para gerar sequências gênicas possíveis de serem usadas em estudos taxonômicos e filogenia molecular. Para atingir o primeiro objetivo foram usados os dados disponíveis no Sistema Nacional de Agravos e Notificações – SINAN acerca das picadas que ocorreram no Amazonas entre os anos de 2008 e 2014. Informações das coleções aracnológicas do INPA, UFAM e FMT/AM, coletas de campo e dados de publicações foram utilizados na produção do segundo capítulo. Espécimes das coleções aracnológicas citadas, juntamente com exemplares coletados em campo, foram usados para gerar as sequências gênicas apresentadas como proposta do capítulo III. Os resultados mostraram que, embora a taxa anual média de escorpionismo no Amazonas de 8.14 casos por 100 mil habitantes esteja abaixo da brasileira, que gira em torno de 17.7 casos por 100 mil habitantes, algumas de suas regiões apresentaram índices alarmantes. Neste contexto, destaque para o município de Apuí, que revelou números assustadores, 273 casos por 100 mil habitantes. O estudo mostrou que as espécies Tityus metuendus, T. matthieseni, T. bastosi e T. silvestris são as principais envolvidas em acidentes nos municípios de Manaus, Apuí, Tabatinga e Rio Preto da Eva, respectivamente. Os resultados do capítulo II, relacionados à distribuição geográfica, consolidam o Estado do Amazonas como o detentor da maior escorpião da fauna do Brasil. Entretanto, mostra que a distribuição das espécies no Estado não está bem compreendida. Além disso, confirmaram os dados de endemismo das regiões do Rio Negro e Manaus, colocando de forma inédita, a primeira região como àquela que apresenta o maior número de espécies endêmicas do Estado, dezessete no total. Por fim, a pesquisa apresenta os resultados referentes à parte genética. Os achados mostraram que as divergências nucleotídicas intra-específica foram menores que entre espécies não relacionadas, confirmando dados da literatura. A partir das árvores geradas pelos algoritmos de Máxima Parcimônia e Neighbor-Joining foi possível inferir que o agrupamento dos Tityus estão de acordo com o que é apresentado pela taxonomia morfológica convencional. Em relação às espécies Brotheas amazonicus, Broteochactas polisi e Chactopsis amazonicus, todos representantes da família Chactidae, os resultados podem aclarar ou ainda resolver uma grande discussão em torno da permanência do gênero
Chactopsis dentro da família citada. Os resultados deste estudo certamente serão utilizados na fundamentação de outras pesquisas ou ainda na tomada de decisões acerca do escorpionismo
no Estado do Amazonas.
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Análise proteômica parcial da peçonha do escorpião colombiano Centruroides margaritatus (Gervais, 1841)Guerrero Vargas, Jimmy Alexander 14 March 2008 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-12-04T19:03:56Z
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DISSERTACAO_2008_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 1916877 bytes, checksum: d700ddf73df00f0f92fbe08e9c73d637 (MD5) / A peçonha de escorpiões é uma mistura complexa de peptídeos que exercem sua atividade modulando canis iônicos de membranas biológicas. O presente projeto
teve como objetivo central realizar a análise proteômica da peçonha do escorpião
colombiano Centruroides margaritatus. Tal espécie é capaz de produzir acidentes
moderados e graves em humanos, no entanto existe pouca informação disponível
relacionada aos componentes desta peçonha. A peçonha foi obtida por estimulação elétrica aplicando-se 5 impulsos de 50 V em cada escorpião, liofilizada e
armazenada a -20oC. Diferenças significativas na produção de peçonha entre
machos e fêmeas e também entre fêmeas grávidas e não-grávidas foram
observadas. A peçonha bruta foi submetida a fracionamento por RP-HPLC usando
coluna C8 (4.6 x 250 mm) e 43 frações foram eluídas, coletadas e secadas a vácuo.
Todas essas frações foram analisadas por MALDI-TOF/MS e detectou-se 91
componentes com massas moleculares distintas. A peçonha de C. margaritatus
apresenta 54% de suas toxinas no intervalo de massas moleculares de 2,5 a 6,0
kDa, no qual estão incluídas as toxinas de cadeia curta bloqueadoras de canais para
potássio; 13% do total encontram-se no intervalo de 6,5 até 8,0 kDa que corresponde
ao grupo das toxinas moduladoras de canais para sódio voltagem-dependentes.
Finalmente, 33% dos componentes presentes na peçonha de C. margaritatus são
pequenos compostos com 2,0 kDa que fazem parte de um grupo de moléculas
raramente descrito nas peçonhas de escorpiões. Também foram isolados e
caracterizados quimicamente dois novos peptídeos: a margatoxina 2 (MgTx2), com
24 resíduos de aminoácidos (MM = 2,6 kDa) e três pontes dissulfeto, pertencente à
família das das -KTx e a margatoxina 3 (MgTx3) com 30 resíduos de aminoácidos
(MM = 3,38 kDa) e três pontes dissulfeto. Trata-se de uma molécula inédita, sem
similaridade com outras descritas na literatura.
______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Scorpion venoms are a complex mixture of peptides that exert their action via
ion-channel modulation in biological membranes. The central objective of this project was to perform the proteomic characterization of the venom from the Colombian scorpion Centruroides margaritatus. This species is capable of producing moderate accidents and serious complications in humans, but little information is available related to its components. The venom was obtained by mild electrical stimulation method, applying 5 impulses of 50 V in each scorpion. It was observed differences in the production of the venom between males and females and also between pregnant and not-pregnant females. The crude venom was fractioned by RP-HPLC using a C8 column (4.6 x 250 mm) and 43 fractions were collected and vacuum dried. All these fractions were analyzed by MALDI-TOF/MS and 91 distinct compounds had their molecular masses characterized. The venom of C. margaritatus exhibits 54% of their toxins in the molecular mass range from 2.5 to 6.0 kDa that probably includes
short-chain K+ channel blockers; 13% of the total are in the range from 6.5 to 8.0 kDa
and may include long-chain Na+ channel toxins. Finally, 33% of the components
present in C. margaritatus venom are peptides smaller than 2.0 KDa, a group rarely
described in scorpions venoms. Two novel peptides were purified and chemically
characterized: margatoxin 2 (MgTx2), 24 amino acids long (MM = 2,6 kDa) and three
disulfide bridges, belonging to the -KTx family and margatoxin 3 (MgTx3), 30 amino
acids long (MM = 3,38 kDa) and three disulfide bridges, with no significant
similarities to other scorpion neurotoxins described.
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Predição e caracterização de um epitopo conformacional da beta-neurotoxina TSI do escorpião Tityus serrulatasTriches, Celiana Maria Ferrarini January 2017 (has links)
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências de Saúde. / No mundo ocorrem muitos acidentes com animais peçonhentos e, entre eles, destacam-se os causados pelos escorpiões, que são considerados um problema de saúde pública. No Brasil, esses acidentes estão classificados pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como doenças negligencias. O principal escorpião responsável pelos acidentes no país, e também o mais perigoso é o Tityus serrulatus, popularmente chamado de escorpião amarelo. A picada deste animal é uma ameaça grave ao indivíduo acidentado, já que seu veneno é composto por toxinas potentes que podem levá-lo à morte em poucas horas. Entre as toxinas do veneno, a mais tóxica e que corresponde a 15% do peso do veneno é chamada de Ts1. A Ts1 é classificada como β-neurotoxina que atua em canais de Na+. Por ser considerada a principal toxina da peçonha e exercer uma importância representativa no processo de envenenamento, neutralizá-la significaria uma possível neutralização da atividade tóxica do veneno. Desta forma, este estudo teve como objetivo identificar um epítopo conformacional da Ts1. Este epítopo foi sintetizado quimicamente e utilizado como antígeno na produção de um soro capaz de neutralizar a toxina e o veneno total. Para isso, foram utilizadas ferramentas de bioinformática utilizando os softwares Sting Millenium, Java Protein Dossier e SwissPDBviwer, síntese de peptídeos utilizando a técnica Fmoc-Sínteses, imunizações e soroneutralização em camundongos adultos. Os resultados de ELISA e de neutralização in vivo mostraram que o epítopo conformacional predito foi capaz de produzir anticorpos que reconhecem o veneno e neutralizam o seu efeito tóxico. Concluiu-se que a produção deste anticorpo, a partir do epítopo sintetizado, pode se tornar uma alternativa para a produção atual de antivenenos, além de atender a condições expostas em debates em torno da bioética.
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Alterações clínicas e cardiopulmonares produzidas pelo envenenamento escorpiônico em cãesCordeiro, Fernanda Fontalva [UNESP] January 2003 (has links) (PDF)
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cordeiro_ff_me_botfmvz.pdf: 669896 bytes, checksum: a563b65811a0515bad1e5a7935727526 (MD5) / O escorpionismo é um problema comum que acomete países tropicais e subtropicais e que assume grande importância médico-sanitária devido à sua fatalidade sobre aqueles indivíduos mais sensíveis, podendo levar crianças e idosos à morte. O potencial letal do envenenamento reside nas graves alterações cardiopulmonares que a toxina escorpiônica é capaz de gerar em suas vítimas. A presente pesquisa avaliou os efeitos do veneno do escorpião Tityus serrulatus em cães com duas diferentes doses: uma dose que simularia o envenenamento natural (0,4 mg/dose total) e outra dose experimental (0,25 mg/kg). Foram observados sinais clínicos gerais em diferentes momentos pós-envenenamento, bem como dados específicos relacionados ao sistema cardio-pulmonar por meio de mensuração da pressão arterial sistêmica, dosagem da atividade enzimática de CK-MB e de exames radiográficos, eletrocardiográficos e ecocardiográficos. Os resultados obtidos demonstraram que o veneno escorpiônico foi capaz de gerar lesão cardíaca aguda e reversível em poucos dias sob dose experimental e produziu quadro de envenenamento leve na dose que simulara o acidente natural. / Scorpionism is a common problem that occurs in tropical and subtropical countries and has great medical and sanitary significance because of its fatality in sensitive individuals, leading children and old people to death. The lethal potential of poisoning is due severe pulmonary and cardiac effects that scorpion toxin can cause in it's victims. The present research evaluated the effects of the Tityus serrulatus toxin in dogs using two different dosages: one dose that simulates the natural envenoming (0,4 mg/total dose) and another experimental dose (0,25 mg/kg). General clinical signs were observed at different moments after the poisoning, as well as specific signs related to cardiac and pulmonary systems by using arterial blood pressure measurement, CK-MB enzymatic activity as well as radiographic, electrocardiographic and echocardiographic evaluations. The results showed that scorpion toxin can cause acute and reversible cardiac lesions under experimental dosage and produced mild poisoning at the dosage that simulated natural envenoming.
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Indentificação e caracterização biológica de peptídeos isolados da peçonha do escorpião comlombiano Tityus pachyurus, que atuam nos canais para Na+Guerrero Vargas, Jimmy Alexander 14 February 2012 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T10:47:04Z
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2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-27T10:47:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1
2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-27T10:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1
2012_JimmyAlexanderGuerreroVargas.pdf: 12143766 bytes, checksum: 4d41b23c8e319089c94ffd4a35e9f009 (MD5) / Tityus pachyurus é uma das espécies causadoras de escorpionismo grave na Colômbia e pouco se conhece sobre as toxinas que constituem sua peçonha. O presente projeto teve como objetivo principal identificar novas toxinas moduladoras de canais para Na+ na peçonha de T. pachyurus. Pela construção da biblioteca de cDNA da glândula peçonhenta de um escorpião T. pachyurus se identificarem 5 novas toxinas putativas da família dos peptídeos com atividade em canais para Na+ e por similaridade na estrutura primária dos peptídeos maduros, 3 foram classificados como alfa-NaScTxs - Tpa4, Tpa5 e Tpa6 - e dois como beta- NaScTxs - Tpa7 e Tpa8 -, sendo que a toxina Tpa8 é o primeiro registro de uma beta toxina anti-inseto excitatória na peçonha de escorpiões do Novo Mundo. Essas NaScTxs foram usadas na construção de uma árvore filogenética incluindo NaScTxs do escorpião T. obscurus e de outras identificadas em escorpiões do gênero Tityus e depositadas nos bancos de dados públicos de proteínas. A análise filogenética coincide com a distribuição geográfica dos escorpiões do gênero Tityus divididos nas espécies que ocorrem ao norte do rio Amazonas e naquelas que habitam ao sul do rio Amazonas. A peçonha bruta de T. pachyurus, submetida a fracionamento por RPHPLC usando uma coluna C18, resultou em 55 frações cromatográficas. As três frações mais abundantes foram submetidas a recromatografias e os peptídeos puros obtidos foram seqüenciados por espectrometria de massa (MS). Três seqüências parciais que correspondem a três novas NaScTxs foram obtidas: Tpa9 com 7061,87 Da, Tpa10 com 6994,36 Da e Tpa11 com 7167,23 Da. Essas novas toxinas (500 nM) foram testadas em canais de sódio expressos em células HEK. Tpa9 reduziu em 20% as correntes de Na" em hNavU, como as (3NaScTx.Tpa10 apresentou efeito em hNav1.1, hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6 como as aNaScTx e a Tpa11 em hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6. A Tpa2, uma (3NaScTx previamente identificada na mesma espécie de escorpião, modificou as correntes de sódio em hNav1.2, hNav1.3 e hNav1.6. Essas quatro toxinas foram administradas em camundongos via i.p., indicando que Tpa2 e Tpa10 causam escorpionismo classe II (x2= 8,0; p-valor = 0,005) e degeneração vacuolar e infiltrado inflamatório no fígado (x2= 4,4; p-valor = 0,035). _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Although Tityus pachyurus is the scorpion species which is responsible for the most dangerous cases of scorpionism in Colombia, little is known about its venom toxins. This project aimed to identify new toxins having Na+ channels as molecular targets in the venom of T. pachyurus. By means of the library construction of the cDNA venomous gland of a scorpion T. pachyurus, five new putative toxins from NaScTx peptide family were identified and by the primary structure of the mature peptides, three of them were classified as alpha-NaScTxs - Tpa4, Tpa5 and Tpa6 - and two as beta-NaScTxs - the Tpa7 and Tpa8. The last one is the first anti-insect excitatory beta-class toxin describedfor a New World scorpion. These five toxins, together with others NaScTxs described for Tityus species were used to construct a phylogenetic tree. Phylogenetic analysis indicated a marked geographic separation between toxins presented in scorpions occurring in the North of the Amazon River and those presented in the scorpions inhabiting the South of the Amazon River. The crude venom of T. pachyurus after being fractionated by RP-HPLC, using a C18 column, resulted in 55 chromatografic fractions. The three most abundant fractions were submitted to further fractioning and the purified peptides were sequenced by mass spectrometry (MS). Three NaScTxs partial sequences were described: Tpa9 with 7061.87 Da, Tpa10 with 6994.36 Da and Tpa11 with 7167, 23 Da. These new toxins (500 nM) were tested on Na+-channels expressed in HEK cells. Tpa9 reduced on 20% the Na+ currents in hNavl.1, similarly as the (3NaScTxs; Tpa10 acted on hNav1.1, hNavl .2, hNav1.3 and hNav1.6 as aNaScTxs, and Tpa11 had effect on hNavl .2, hNavl .3, and hNavl .6. The Tpa2, a (3-toxin previously identified, modified the currents in hNavl.2, hNavl.3 and hNavl .6. These four toxins were injected into mice showing that Tpa2 and Tpa10 caused class II scorpionism (x2 = 8.0, p = 0.005) and vacuolar degeneration and inflammatory infiltration in the liver (x2 = 4.4, p-value = 0.035).
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Caracterização parcial de duas toxinas isoladas da peçonha do escorpião Tityus mattogrossensis (Borelli, 1901)Oliveira, Natiela Beatriz de 15 February 2012 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Ciências Fisiológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-09-24T14:55:14Z
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2012_NatielaBeatrizdeOliveira.pdf: 3826943 bytes, checksum: bc95f23eec5132d04ee27298fb70b59f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-10-02T12:25:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1
2012_NatielaBeatrizdeOliveira.pdf: 3826943 bytes, checksum: bc95f23eec5132d04ee27298fb70b59f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-02T12:25:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1
2012_NatielaBeatrizdeOliveira.pdf: 3826943 bytes, checksum: bc95f23eec5132d04ee27298fb70b59f (MD5) / O escorpião da espécie Tityus mattagrassensis Borelli (1901). pertence à família Buthidae, e é endêmico do cerrado brasileiro, sendo encontrado em todo o Centro Oeste, Bahia e Norte de Minas Gerais. As espécies da família Buthidae são as principais responsáveis pelos acidentes ocorridos com humanos. Os acidentes com T mattogrossensis são considerados de pequena gravidade devido ao baixo grau de reação ã picada e de poucos casos registrados. A peçonha de escorpiões é uma mistura complexa de moléculas bioativas, porém, os componentes mais importantes são os peptideos neurotóxicos, que agem em canais iónicos de Na*, K* e Ca2'. As toxinas de escorpiões que agem em canais para Na' voltagem dependentes são divididas em duas famílias: as a-toxinas de escorpiões (a-NaScTx) que agem no sitio 3 do domínio IV do canal para sódio e com isso deixam a inativaçâo do canal mais lenta ou causam o bloqueio da inativaçâo; e as B-toxinas escorpiônicas (B-NaScTx) que se ligam ao sítio 4 do domínio II do canal e alteram o potencial para a ativação dos canais para Na*. Até o momento, não existem trabalhos com a caracterização da peçonha de Tityus mattogrossensis e o presente trabalho tem como objetivo caracterizar química e eletrofisíologicamente os peptideos componentes da peçonha do escorpião dessa espécie, com ênfase na caracterização de duas toxinas para canais Na,. A peçonha bruta foi fracionada mediante CLAli mostrou a presença de 65 facões, sendo 7 frações mais abundantes, que foram testadas de forma bioguiada em nervos de rã, por meio da técnica "Single Sucrose-Gap". Onde foram observadas quatro frações com atividade: uma que causou um relardo da repolarização do potencial de ação e três com atividade de redução do potencial de ação. Dessas, duas frações F5 (7308,5 m/z) e F6 (7108,0 m/z) tornaram-se foco do trabalho. As suas seqüências foram parcialmente obtidas por meio de sequenciamento "de novo" em MALDI-TOF/MS. E tiveram alta similaridade com outras toxinas de escorpiões do tipo B do gênero Tityus. Foram feitos testes preliminares eletroflsiológicos em "patch clamp" e a toxina F5, mostrou alta atividade em canais Nav 1.3, Nav 1.6, DUM e baixa atividade em DRG. A toxina F6 apresentou alta atividade em Nav 1.3 e essa atividade foi aumentada com um pré-pulso despolarizante. A F6 também apresentou ação em DRG. Porém, mais testes deveram ser feitos. A peçonha do escorpião T. mattagrassensis possui duas toxinas abundantes que agem sobre canais para sódio voltagem dependentes. E podem ser as primeiras toxinas descritas com atividade de bloqueio de Nav jâ descritas no gênero Tityus. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The endemic Brazilian cerrado scorpion Tityus mactagrossensis Borelli (1901), belongs to Buthidae family, and is found in the Brazil Midwest, Bahia and north of Minas Gerais states. The species of the Buthidae family are the main responsible for humans accidents. T. mattograssensis sting are considered as small gravity due to the low degree of reaction and the few recorded cases. The scorpion venom is a complex mixture of bioactive molecules, however, the most important components are neurotoxic peptides, which act on ion channels of Na\ K' and Ca2'The toxins of scorpions that act on channels for Na* voltage-dependent are divided into two families: the a-scorpions toxins (a-NaScTx) act at the site 3 domain IV of the channel to sodium, and thus slowing the channel inactivation level causing blockage or inactivation, and the |i scorpion toxins (8- NaScTx) that bind to site 4 of the domain II of the channel and changing the potential of activation of Na* channels. There are no characterization studies of T. mattogrossensis venom, this present work aims to characterize chemical and electrophysiological peptides of scorpion venom components of this species, with emphasis on the characterization of two scorpion sodium channel toxins. The crude venom fractionated by high performance liquid chromatography (HPLC) showed the presence of 65 fractions, with seven more abundant, which were bio-guided tested, using the technique Single Sucrose-Gap with frog's ciatic nerve. Four fractions showed neurotoxicity in this preparation: one caused a delay of action potential repolarization and three with reduced activity of the action potential. From these two fractions F5 (7308.5 m/z) and F6 (7108.0 m/z) became the focus of this study. Their sequences were obtained by partially sequencing "de novo" in MALDI-TOF/MS. Both had high identity with others Tityus B-scorpions toxins, suggesting theirs activity. Preliminary electrophysiological tests were performed in patch clamp and the toxin F5 showed high activity channels Nav 1.3, Na, 1.6 and DUM. and low activity in DRG. The toxin F6 showed high activity in Na, 1.3 and this activity was increased by a depolarizing pre-pulse. The F6 also presented action in DRG. However, further tests will be done. The two major toxins of T. mattogrossensis venom action on voltage-dependent sodium channels, and toxins can be the first already described with activity block Nar Tityus genus.
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Isolamento e caracterização de peptídeos biologicamente ativos presentes na peçonha do escorpião Tityus fasciolatusZanotta, Lanuse Caixeta 10 March 2006 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2006. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-16T13:45:06Z
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2006_LanusecaixetaZanotta.pdf: 2759687 bytes, checksum: 6648f9b9b9e241bf7e823934a4640935 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-16T13:45:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1
2006_LanusecaixetaZanotta.pdf: 2759687 bytes, checksum: 6648f9b9b9e241bf7e823934a4640935 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-16T13:45:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1
2006_LanusecaixetaZanotta.pdf: 2759687 bytes, checksum: 6648f9b9b9e241bf7e823934a4640935 (MD5) / Em algumas regioes do mundo, inclusive no Brasil, o numero de acidentes com escorpioes e bastante significativo. Devido a necessidade, entao, de se produzir antidotos ou anti-soros eficazes para combater os prejuizos causados a saude humana em decorrencia desses acidentes, estudos envolvendo a caracterizacao quimica e farmacologica da peconha desses animais foram intensificados. A peconha dos escorpioes e composta por varios tipos de moleculas, principalmente polipeptideos geralmente toxicos para um grande numero de organismos como mamiferos, insetos e crustaceos. Muito se tem estudado sobre as diferentes propriedades fisiologicas e farmacologicas dessas moleculas e atualmente ja sao conhecidas a atuacao em canais ionicos, atividade antimicrobiana, antimalaria, fosfolipasica e inseticida. Esse trabalho tem como objetivo principal o isolamento e a caracterizacao de peptideos biologicamente ativos presentes na peconha do escorpiao Tityus fasciolatus, especie endemica do cerrado. Os animais foram coletados na regiao do Distrito Federal e a peconha foi obtida por meio de estimulacao eletrica moderada proximo a glandula produtora de peconha do especime e, em seguida, liofilizada. A purificacao dos peptideos foi realizada em duas etapas: filtracao em gel (Superdex 75 HR 10/30) em tampao formiato de amonia e RP-HPLC (Vydac C18 218TP54) com a eluicao mediada pela aplicacao de um gradiente linear de acetonitrila. Os peptideos de interesse foram reduzidos e alquilados com 4-vinilpiridina e suas massas moleculares foram obtidas por meio de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS). A estrutura primaria dos peptideos isolados foi obtida por meio da degradacao de Edman e tambem foram realizados ensaios biologicos a fim de se determinar a atividade de tais peptideos. Tres peptideos que apresentaram bom grau de pureza e abundancia tiveram suas estruturas primarias determinadas. O peptideo Tf14 possui massa molecular igual a 14 kDa e temos indicios de se tratar de um homodimero ligado por pontes dissulfeto; Tf3.5 e um provavel bloqueador de canais de potassio, uma vez que possui alta similaridade estrutural com peptideos dessa natureza e, finalmente, Tf2.7, um peptideo linear com 25 residuos de aminoacidos e massa molecular igual a 2,75 kDa. Ensaios biologicos revelaram tratar-se de um peptideo com atividade semelhante a bradicinina, alem de ser capaz de bloquear o fluxo de ions em canais de potassio voltagem-dependentes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In some regions of the world, including Brazil, the number of injuries caused by scorpions is rather relevant. In order to minimize the deleterious effects in human health caused by those injuries by means of counter poison or anti-serum, efforts were expanded to further investigate the biochemical and pharmacological properties of the poison of these animals. The scorpion venom are constituted by several and different kinds of molecules, mainly polypeptides, generally toxic for a large number of organisms like mammals, insects and crustaceans. Much is known about the physiological and pharmacological properties of these polypeptides, including their mode of action on ions channels, anti-malary, anti-microbial, phospholipasic and insecticidal activities. The main objective of this work is the purification and characterization of biologically active peptides present in the venom of the scorpion Tityus fasciolatus, an endemic species from cerrado region. The animals were collected in Distrito Federal, and the venom was obtained by gentle electric stimulation next to the producing glandule of the specimen. The peptides were purified in two steps: gel filtration (Superdex 75 HR 10/30) using ammonium formiate buffer, followed by RP-HPLC cromatography (Vydac C18 218TP54). The elution was performed by means of an acetonitrile gradient. The obtained peptides were reduced and alkylated using 4-vinylpyridine and their molecular masses were determined using mass spectrometry analysis (MALDI-TOF MS). The primary structures of these peptides were determined by Edman degradation and several assays were done in order to determine the biological activity of these peptides. Three highly pure and abundant peptides had their primary structures determined: Tf14, with a molecular mass of 14 kDa seems to be an homodimer holded by disulphide bridges; Tf3.5 should act blocking potassium channels since it shares high structural similarities to other scorpion peptides of this nature; and Tf2.7, a linear peptide of 25 amino acids residues with a molecular mass of 2.75 kDa. This peptide exhibits a bradykinin-like activity and is also able of blocking ion fluxes in voltage-dependent potassium channels.
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