Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:06Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-14Bitstream added on 2014-06-13T19:24:24Z : No. of bitstreams: 1 tonello_ps_dr_araiq_prot.pdf: 883713 bytes, checksum: 24de135b041e3052b7ee3ff6ddbb9c28 (MD5) / As técnicas de ultrafiltração com fluxo tangencial (UF-FT) e de difusão em filmes finos por gradiente de concentração (DGT) foram empregadas no estudo da labilidade de Al e Cu em soluções modelo e em amostras de águas de dois rios do litoral do estado de São Paulo, rio Sorocabinha e rio Peropava. Como para técnica DGT, existe a necessidade de se conhecer o valor do coeficiente de difusão dos analitos em hidrogéis, foi construída uma câmara de difusão para a determinação desses coeficientes. As soluções modelo contendo diferentes concentrações de Al ou Cu, na presença de substâncias húmicas aquáticas (SHA), foram submetidas ao procedimento de UF-FT para a determinação das concentrações de metais livres e complexados. Com esses resultados e os coeficientes de difusão dos metais e seus complexos com substâncias húmicas, foram determinados coeficientes de difusão aparentes, específicos para cada solução modelo e/ou amostra. A técnica DGT convencional permitiu a determinação da fração lábil total dos analitos e, usando géis para difusão com diferentes porosidades, foi possível a determinação das frações inorgânicas e orgânicas dos analitos nas soluções modelo e/ou amostras. Para se verificar a exatidão dos resultados foi usado um procedimento de extração em fase sólida (EFS) com coluna preenchida com resina Chelex-100. Os resultados dos coeficientes de difusão de Al, Cu, Al-SH e Cu-SH, determinados através da câmara construída, foram similares aos encontrados na literatura para a mesma temperatura. Com os resultados da UF-FT, foram determinadas as capacidades complexantes das SH para Al e Cu em 3,7 e 1,0 mmol mg-1 de COT, para as SHA do rio Itapanhaú, e 3,9 e 7,4 mmol mg-1 de COT para as SHA do rio Sorocabinha. Os resultados da UF-FT e da DGT usando o coeficiente de difusão aparente não diferiram estatisticamente dos encontrados... / The techniques of tangential flow ultrafiltration with (TF-UF) and diffusion gradients in thin films (DGT) were applied in the study of the lability of Al and Cu in model solutions and water samples from two rivers from the coast of the São Paulo state, the Sorocabinha and the Peropava River. As the DGT technique requires the values of the diffusion coefficients of the analytes in hydrogels, a diffusion chamber was built, in order to determine them. The model solutions, which contain different concentrations of Al and Cu when aquatic humic substances (AHS) are present, were submitted to the TF-UF procedure to determine the concentration of free and complexed metals. With these results and the diffusion coefficients of the metals and their complexes with humic substances, apparent diffusion coefficients, which are specific to every model solution and/or sample, were determined. The conventional DGT technique allowed the determination of the total labile fraction of the analytes and using diffusing gels with different pore size, the determination of the inorganic fractions of the analytes in the model solutions and/or samples was possible. To verify the accuracy of the results, a solid phase extraction procedure (SPE) was used, with the column filled with Chelex-100 resin. The results of the diffusion coefficients from Al(III), Cu(II), Al-HS and Cu-HS, determined through the built chamber, were similar to the ones found in the literature for the same temperature. With the TF-UF results the complexing capacities of the HS to Al and Cu were determined as 3.7 and 1.0 µmol mg-1 TOC to the AHS of the Itapanhaú River, and 3.9 and 7.4 µmol mg-1 TOC to the AHS of the Sorocabinha River. The TF-UF and DGT results using the apparent diffusion coefficients didn’t differ statistically to the ones found with the SPE, allowing thus the determination of the free, labile, labile more moderately labile... (Complete abstract click electronic access below)

A diversidade de espécies e fenotípica pode variar consideravelmente entre grupos taxonômicos e ao longo do tempo em uma mesma linhagem. O estudo de tais variações tornou-se um dos principais objetivos da biologia evolutiva fornecendo informações importantes a respeito dos possíveis mecanismos que regulam a biodiversidade. Dessa forma, o objetivo geral da presente tese foi investigar os padrões da diversificação de espécies e da morfologia em um grupo cosmopolita de serpentes, a família Viperidae, e os potenciais processos subjacentes. Primeiramente, (1) reconstruímos as relações filogenéticas e estimamos os tempos de divergência entre as linhagens da família Viperidae utilizando uma abordagem Bayesiana. (2) Aplicando um método recentemente desenvolvido (BAMM), exploramos como as taxas de especiação e extinção variaram ao longo da radiação do grupo inferindo os possíveis processos reguladores. Por fim, (3) analisamos se a evolução do tamanho do corpo e as taxas de especiação variam nos diferentes habitats ocupados pelos viperídeos (terrestres vs arborícola). Nesta tese geramos a filogenia molecular de viperídeos mais completa até o momento utilizando sequências para 11 genes mitocondriais e nucleares abrangendo 79% das espécies viventes (264 terminais) e todos com exceção de um gênero. De maneira geral, foi possível obter relações filogenéticas robustas para o grupo com a maioria dos gêneros sendo monofilética. Os tempos de divergência obtidos indicam que os viperídeos começaram a diversificar em meados do Paleoceno tardio/meio do Eoceno inferindo idades um pouco mais tardias que o encontrado em estudos anteriores. Durante a radiação do grupo, um aumento nas taxas de especiação parece ter ocorrido durante a diversificação dos crotalíneos (pit vipers) em decorrência não só da evolução das fossetas loreais mas também como resultado de mudanças geológicas e climáticas na Ásia e da invasão do novo mundo. Após este rápido aumento inicial, as taxas de especiação desaceleraram em direção ao presente. Por fim, os resultados aqui apresentados indicam que apesar dos habitats arborícolas limitarem a evolução morfológica nos viperídeos, a evolução da arborealidade parece não afetar as taxas de especiação que permanecem similares entre linhagens arborícolas e terrestres. Isto sugere dois cenários: (1) a especiação acontece de forma independente das mudanças morfológicas nos viperídeos; ou (2) o isolamento geográfico seria um mecanismo importante na diversificação de linhagens arborícolas contrabalançando decréscimos nas oportunidades de especiação possivelmente relacionados às pressões seletivas impostas pelo ambiente arborícola. A presente tese contribui para entendermos mais sobre como evoluíram os viperídeos ao longo dos seus ∼50 milhões de anos. Além de propor cenários e hipóteses a serem futuramente explorados com os viperídeos, elaboramos uma discussão ampla e conceitual a respeito dos possíveis mecanismos por trás da diversificação de espécies e da morfologia que poderiam também ser contemplados para outros grupos de organismos. Portanto, a presente tese contribui não só para entendermos os mecanismos que geram e mantém a diversidade de serpentes, mas também para enriquecer a discussão dos mecanismos que geram e mantém a biodiversidade como um todo / Species and phenotypic diversity may vary considerably between taxonomic groups and through time for a given lineage. The study of such variation became one of the main goals of evolutionary biology and provides important information related to the possible mechanisms regulating biodiversity. The general goal of the present thesis was to investigate the patterns of species and morphological diversification in a cosmopolitan group of snakes, the family Viperidae, and the potential underlying processes. First, (1) we estimated the phylogenetic relationships and divergence times between lineages of the family Viperidae using a Bayesian approach; then we (2) applyed a recently developed method (BAMM) to explore how speciation and extinction rates varied during the radiation of the group suggesting possible underlying processes. Finally, (3) we analyzed if body size evolution and speciation rates showed distinct patterns among vipers occurring in different habitats (terrestrial vs arboreal). Herein we generated the most complete molecular phylogeny for vipers until this moment using sequences from 11 mitochondrial and nuclear genes comprising 79% of extant species (264 terminals) and all except one genus. In general, we were able to recover well supported phylogenetic relationships with most genera being monophyletic. Divergence time estimates suggested that vipers started to diversify around the late Paleocene/middle Eocene finding older ages than previous studies. During the group radiation, an increase in speciation rates seems to have occurred during the diversification of crotalines (pit vipers) not only due to the evolution of loreal pits but also as a result of climatic and geological changes in Asia and the invasion of the New World. After this rapid initial increase, speciation rates decelerated toward the present. Lastly, the results presented here suggest that although arboreal habitats constrain morphological evolution in vipers the evolution of arboreality does not seem to affect speciation rates, which remain similar among arboreal and terrestrial lineages. Our results suggest two distinct scenarios: (1) speciation could be independent of morphological evolution in vipers; or (2) geographic isolation would be an important mechanism underlying species diversification in arboreal lineages offsetting decreases in speciation opportunities potentially related to the selective pressures imposed by the arboreal environment. The present thesis contribute to increase our understanding about how vipers evolved during their ∼50 million years. In addition to providing scenarios and hypotheses to be further explored with vipers, we elaborated a broad and conceptual discussion about the possible mechanisms underlying species and morphological diversification that might apply to other groups of organisms. Therefore, this thesis comprises a contribution that goes beyond the understanding of mechanisms generating and maintaining the diversity of snakes, but will hopefuly enrich the discussion of mechanisms that generate and maintain biodiversity as a whole

Na presente Tese foram usados métodos de inferência filogenética e de filogeografia buscando identificar os processos históricos de diversificação do gênero Conopophaga na América do Sul, em especial na Mata Atlântica. O monofiletismo do gênero e a estrutura filogeográfica das espécies distribuídas no sudeste da Mata Atlântica (Conopophaga lineata e C. melanops), foram testados utilizando seqüências de DNA mitocondrial. Para a filogenia foram utilizadas duas matrizes, sendo uma de 2270 pb (941 pb da subunidade 2 da NADH desidrogenase (ND2), 343 pb do ND3 e 986 pb do citocromo b) e outra de 878 pb (461 pb do ND2 e 417 pb do cit b). Nas análises de filogeografia de C. lineata e C. melanops foram utilizadas seqüências da região controladora de 472 pb e 439 pb, respectivamente. Os resultados demonstraram que o gênero Conopophaga é monofilético e que provavelmente uma rápida radiação ocorreu nesse gênero depois da especiação de C. melanogaster e de C. melanops. Dessa radiação, foram recuperados dois grupos: (1) Um grupo que se distribui somente na Amazônia e mantém a característica ancestral da coloração negra da mandíbula e (2) um grupo distribuindo-se na Amazônia e também na Mata Atlântica e que possui a mandíbula branca. Nesse último grupo, C. l. cearae não se agrupou com C. lineata, demonstrando que essa espécie não é uma espécie monofilética. A relação entre as espécies que apresentam a mandíbula branca parece indicar a ocorrência de uma conexão entre o leste da Amazônia e a Mata Atlântica no passado. O estudo filogeográfico de C. lineata revelou a existência de possíveis eventos de vicariância: (1) na região compreendida pelo Vale do Rio Paraíba do Sul e (2) à oeste de São Paulo e Paraná, separando as populações mais ao sul. Apesar de as inferências filogenéticas realizadas em C. melanops e C. lineata não serem totalmente concordantes, é possível que exista um padrão de vicariância nessa região. Concluindo, a ocorrência desses eventos vicariantes, tais como eventos geológicos e ciclos de alterações climáticas tenham influenciado na diversificação da família Conopophagidae. Além disso, eventos de dispersão e/ou seleção também podem auxiliar no entendimento da história biogeográfica do grupo, bem como de outros grupos na América do Sul. / In order to identify the historical processes of diversification of the gender textitConopophaga in South America, especially in the Atlantic forest, methods of phylogenetic and phylogeography inference were used in the present thesis. The genus phylogeny and the phylogeographic structure of two species ( textitConopophaga lineata and textitC. melanops) which occurs in the Southeast of the Atlantic forest were tested using sequences of mithocondrial DNA. Two matrixes were used to perform the phylogenetic analyses. The first one comprising 2270 bp (941 bp of ND2, 343 bp of ND3 and 986 bp of cytochrome b) and the second one comprising of 878 bp (461 bp of ND2 and 417 bp of cytochrome b). The phylogeography analyses of textitC. lineata and textitC. melanops were done using sequences from the control region consisting of 472 bp and 439 bp, respectively. The results demonstrated that the genus textitConopophaga is monophyletic and probably after textitC. melanogaster and textitC. melanops speciation, a rapid diversification had occurred in this genus. Following this event two distinct groups were recovered: (1) a group distributed in Amazonian, which maintains the ancestral characteristic of black jaw and (2) a group possessing white jaw occurring in the Amazonian and also in the Atlantic forest. In the last group, the subspecies C. l. cearae did not grouped with textitC. lineata demonstrating that this species is not monophyletic. Moreover, the distribution pattern of species presenting white jaw indicates a plausible a connection between the east of the Amazonian and the Atlantic forest in the past. The phylogeographic study of textitC. lineata revealed the existence of possible vicariant events: (1) in the area of Vale do Rio Paraíba do Sul and (2) in the west of São Paulo and Paraná, separating the southern south populations. Although the phylogeographic structure observed in textitC. melanops and in textitC. lineata are not in total agreement, the occurrence of vicariant events still remains as a possible explanation for the phylogeographic patterns in this region. Finally, the occurrence of these vicariant events like, geological events and climatic oscilations, may have influenced the diversification of the family Conopophagidae. Moreover, dispersion events and/or selection should also be considered for the understanding of biogeographic history of this group and also other ones in South America.

The family Caulimoviridae comprises viruses with semicircular double-stranded DNA genomes encapsulated into isometric or bacilliform particles, being divided into eight genera. The genus Badnavirus is the most important due to its high number of species reported infecting cultivated plants worldwide. The present study aimed to evaluate the taxonomic/phylogenetic positioning and population genetic variability into the genus Badnavirus. Initially, a data set comprising badnavirus full-length genome sequences was obtained from the non-redundant GenBank database. Multiple nucleotide sequence alignments were obtained for the data sets: complete genome; ORF III; full (1020pb) and partial (579pb) RT/RNaseH. Pairwise sequence comparisons, phylogenetic and recombination analyses were performed for all data sets. A total of 127 isolates were obtained, representing 53 badnavirus species. Nucleotide pairwise comparisons for the data sets RT/RNaseH and ORF III showed that a number of distinct badnavirus species shared up to 82,5% of identity, higher than the 80% threshold currently used for species demarcation in the genus. Bayesian phylogenetic trees showed four well supported clusters, with clusters 1 and 3 being sister groups comprising predominantly isolates infecting sugarcane and banana. Non-tree-like evolution evidenced a complex pattern of recombination, and at least 23 independent events were detected with recombination breakpoints occurring predominantly in the ORF III and in the intergenic region. By the analysis of nucleotide diversity of the partial RT/RNaseH region in 12 badnavirus population, a high genetic variability was observed. These results showed that mutation and recombination are important evolutionary mechanisms acting on the diversification of badnaviruses, and that the partial RT/RNaseH sequence is sufficient to determine the taxonomic placement of most viral species described in this genus. / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A família Caulimoviridae compreende fitovírus com genomas semicirculares de DNA de fita dupla encapsidados em partículas isométricas ou baciliformes, sendo dividida em oito gêneros. O gênero Badnavirus é o mais importante devido ao seu alto número de espécies relatadas infectando plantas cultivadas em todo o mundo. O presente estudo teve como objetivo avaliar a variabilidade genética de populações e o posicionamento taxonômico/filogenético de espécies de badnavírus. Inicialmente, sequências completas para o genoma das espécies de badnavírus foram obtidas a partir do banco de dados não-redundante GenBank. Alinhamentos múltiplos das sequências nucleotídicas foram obtidos para os seguintes conjuntos de dados: genoma completo, ORFIII, RT/RNaseH completa (1020nt) e parcial (579nt). Comparações pareadas de sequências, análises filogenéticas, de recombinação e variabilidade genética foram realizadas para os conjuntos de dados. Um total de 127 isolados foram obtidos, representando 53 espécies de badnavírus. As comparações de sequências de nucleotídeos para o conjunto de dados RT/RnaseH (completa e parcial) mostraram que algumas espécies de badnavírus relatadas como distintas apresentam entre 57,1-82,5% de identidade, superior ao limite de 80,0% atualmente utilizado para a demarcação de espécies em Badnavirus. Resultados similares foram observados para os dados da ORFIII e genoma completo, reforçando que sequências parciais do domínio RT/RNaseH são suficiente para determinar o posicionamento taxonômico da maioria das espécies descritas neste gênero. Quatro grupos (clusters 1-4) bem suportados foram observados nas árvores filogenéticas para genoma completo e ORFIII, com os cluster 1 e 3 formando grupos irmãos compreendendo espécies/isolados infectando predominantemente cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e banana (Musa spp.). Análise de evolução em rede evidenciou alguns possíveis eventos de recombinação afetando a diversificação de espécies de badnavírus, com pelo menos 23 eventos independentes sendo detectados com pontos de recombinação ocorrendo predominantemente na ORFIII e região intergênica. Finalmente, altos índices de diversidade nucleotídica foram observados para a região RT/RnaseH parcial em populações de 12 espécies distintas de badnavírus. Estes resultados mostram que mutação e recombinação são mecanismos importantes atuando na evolução dos badnavírus.

O ferro é um nutriente essencial para quase todas as espécies vivas e desempenha muitos papéis essenciais nos sistemas biológicos, como transporte de oxigênio, respiração, metabolismo energético, destruição de peróxidos e síntese de DNA. A deficiência de ferro no organismo pode acarretar diversas desordens fisiológicas, como por exemplo, a anemia ferropriva, que está relacionada com os níveis de hemoglobinas no sangue. Uma das maneiras de se obter as necessidades diárias desse nutriente e, dessa forma evitar as desordens fisiológicas ocasionadas pela deficiência do mesmo, é o consumo de frutas, hortaliças e carnes na dieta, uma vez que esses alimentos são ricos nesse elemento. Dessa forma, foram feitas determinações para avaliar as quantidades totais e a bioacessibilidade (através de métodos in vitro) de ferro, e de outros macro e micronutrientes, em diferentes tipos de alimentos. Além disso, visando buscar correlações com os resultados obtidos, a composição centesimal e o conteúdo de ácido fítico dos alimentos analisados também foram determinados. A concentração de ferro heme foi determinada para as amostras de fígado bovino. As quantidades totais e bioacessíveis dos elementos permitiram constatar que dentre todos os alimentos analisados, o espinafre foi o alimento que apresentou a maior quantidade de ferro total, porém verificou-se que a bioacessibilidade deste nutriente é muito baixa, sendo inferior a 20%. Isto pode estar relacionado ao elevado teor de oxalatos e fitatos (que possuem capacidade complexante) presente neste tipo de alimento. Ainda com relação a bioacessibilidade deste nutriente, o fígado bovino cru foi o alimento que apresentou a maior quantidade de ferro bioacessível. Porém, quando o mesmo é submetido ao processo de cocção, o valor da bioacessibilidade deste nutriente diminui consideravelmente, o que está correlacionado com a quebra do complexo de ferro heme presente em maior parte neste alimento, transformando-se em ferro iônico, que possui uma menor biodisponibilidade no organismo humano, pois é absorvido de forma menos eficaz que o ferro heme. Além disso, com relação aos alimentos de origem vegetal, os resultados mostraram que o potássio (K) possui as maiores quantidades totais e bioacessíveis para os alimentos analisados, resultado que se encontra em concordância com o fato deste elemento ser fundamental no crescimento de qualquer espécie vegetal. A determinação do conteúdo de ácido fítico (fitatos) permitiu evidenciar que os mesmos possuem diferentes intensidades de ligação com os cátions dos nutrientes presentes nos alimentos avaliados, e desse modo a influência dos fitatos na bioacessibilidade dos elementos analisados é maior para alguns e menor para outros, dependendo da estabilidade dos complexos formados entre os minerais e os fitatos. As concentrações de ferro heme obtidas para as amostras de fígado bovino demonstraram que o aquecimento provoca uma diminuição considerável na porcentagem de ferro heme presentes nas amostras, variando entre 33 e 43 %. Esta diminuição está relacionada à clivagem oxidativa do anel porfirínico em que o Fe está coordenado, e essa redução é relativamente alta uma vez que a liberação do ferro do complexo heme só ocorre em temperaturas elevadas, de 85 a 100 °C. / Iron is an essential nutrient for almost all living species and plays essential roles in many biological systems, such as oxygen transport, respiration, energy metabolism, destruction of peroxides, and DNA synthesis. Iron deficiency in the body may cause various physiological disorders, such as anemia, which is related to hemoglobin levels in blood. One way to obtain the daily requirement of this nutrient and thus avoid the physiological disorders caused by its deficiency is to ingest fruits, vegetables, and meat, because they are rich in this element. This work evaluated the bioaccessibility (by in vitro methods) and the total amounts of iron and other macro and micronutrients in different types of food. Seeking correlations with the results, the percent composition and phytic acid content of the analyzed foods were also determined, and the concentration of heme iron in samples of bovine liver was analyzed. The total and bioaccessibles amounts of elements allowed to observe that among all foods, spinach contained the highest amount of total iron, but the bioaccessibility of this nutrient was low, below 20%, probably due to the high levels of oxalates and phytates (which have complexing capacity) in this type of food. Still regarding the bioaccessibility of this nutrient, bovine liver was the food with the highest amount of bioaccessible iron. However, cooking considerably reduced bioaccessibility of this nutrient. This decrease is correlated with the breakdown of the heme iron complex present in bovine liver, wich generated the less bioavailable and the less efficiently absorbed ionic iron. Concerning plant species, the results showed that potassium (K) had the highest total and bioaccessible amounts for the analyzed foods, a result that agreed with the fact that this element is essential for the growth of any kind vegetable. Determination of phytic acid (phytates) content showed that they correlated with the cations of the nutrients in the tasted foods differently; i. e., phytates affected the bioaccessibility of the analyzed elements to different degrees, depending on the stability of the complexes formed between the minerals present in a given food and phytic acid. The heme iron concentrations in bovine liver samples revealed that heating significantly lowered the percentage of heme iron present in the samples, which ranged from 33 to 43%. This decrease was related to the oxidative cleavage of the porphyrin ring. The reduction in heme iron was relatively large, since the release of heme iron complex only occurs at elevated temperatures from 85 to 100 ° C.

Alguns dos padrões ecológicos mais consistentemente encontrados na natureza, como as relações espécie-área e as distribuições de rank-abundância, podem ser previstas por uma classe de modelos neutros. Nesse contexto, neutralidade quer dizer que há equivalência demográfica entre os indivíduos de todas as espécies. Para os modelos dessa classe, extinções causadas por flutuações demográficas são contrabalanceadas por algum mecanismo de especiação. Cada modo de especiação deixa uma marca nos padrões ecológicos emergentes. Foi mostrado que um modelo com uma implementação mecanística de especiação gera padrões de diversidade que dependem de limites geográficos. Eu usei simulações baseadas em indivíduos com uma implementação mecanística de especiação para investigar se padrões espaciais intrínsecos das comunidades poderiam transformar os padrões de biodiversidade. Eu descobri que existe uma transição de fase no modo de especiação que depende da estrutura espacial da comunidade. Uma gama extensa de padrões encontrados na natureza puderam ser unificados em um único modelo dada essa transição de fase. Relações entre riqueza e idade de um clado podem ser melhor compreendidas considerando-se o efeito previsto de desaceleração crítica da diversificação. Uma nova interpretação foi dado ao efeito \"Clado Morto Andando\", característico dos períodos seguintes a extinções em massa. Uma redefinição objetiva e biologicamente razoável para especiação alopátrica é explorada, graças às propriedades da transição de fase descrita. Eu proponho a existência de um \"crédito de especiação\", e exploro suas possíveis implicações para a conservação a longo prazo da biodiversidade / Some of the most consistent ecological patterns encountered in nature, such as species-area relationships and rank-abundance distributions, can be predicted from a class of neutral models. In this context, neutrality means demographic equivalence between individuals of all species. Within this class of neutral models, species extinction by demographic fluctuations is counterbalanced by some speciation mechanism. Each particular speciation mode leaves an imprint in the resulting patterns. A model with a mechanistic speciation implementation was shown to generate patterns dependent on geographic constraints. I used individual based simulations with a mechanistic speciation implementation to investigate whether the intrinsic spatial patterning of organisms could transform biodiversity patterns. I found out that there is a phase transition on speciation modes that is dependent on the spatial structure of the community. An extended range of the biodiversity patterns found in nature can be unified into a single model because of this phase transition. Clade richness and age relationships may be understood by the predicted critical slowdowns in diversification. A new interpretation is given to the post mass extinction \"Dead Clade Walking\" effect. An objective and biologically reasonable redefinition of allopatric speciation is explored by exploiting the phase transition. I propose the \"speciation credit\" effect, and its potential implications for long term biodiversity conservation

A flow injection (FI) system, which is coupled to an atomic absorption spectrometer, is proposed for organic and inorganic mercury speciation. The FI system consists basically of three three way-solenoid valves, a gas/liquid separator and a gold-gauze column. Hg0 and volatile organic mercury species (mainly methylmercury - MeHgH) are generated by reacting inorganic mercury (as Hg(II)) and organic mercury (mainly MeHg+) species with sodium tetraborohydride in HCl medium. The speciation analysis involves two separated steps. In the first, only the volatile mercury obtained by inorganic mercury (Hg(II)) reduction is transported to the quartz cell of the spectrometer where it is measured. In the second step, all volatile mercury species are conducted to a gold-gauze column where they are trapped. Subsequently, the column is heated for mercury releasing, which is then transported to the quartz cell. In this step the total mercury concentration is measured. The concentrations of organic and inorganic mercury are obtained by subtracting the signal measured in the first step from that measured in the second one. The main parameters that influence the FI system performance and mercury speciation were evaluated. The best conditions found were: NaBH4 0.050 % (m/v), HCl 1.0 mol L-1, carrier gas (Ar) flow rate of 25 mL min-1, mercury releasing from the gold-gauze at 500 oC, sample and NaBH4 solutions flow rate of 10 mL min-1 and 2 mL min-1, respectively. The limits of detection, calculated for 10 mL of sample solution processing, were 9.5 ng L-1 of MeHg and 68 ng L-1 of Hg(II). The relative standard deviation (RSD) was typically 2.5%, whereas the calibration curves of Hg(II) and MeHg were linear in the range of 100 to 5000 ng L-1 and 50 to 2000 ng L-1, respectively. The method was applied for organic and inorganic mercury speciation in mineral and underground water. With the proposed FI system it was possible to perform up to 24 measurements per hour. Recovery of spiked organic and inorganic mercury ranged from 97 to 102%. It was concluded that the proposed FI system coupled to atomic absorption spectrometer is very useful and feasible for speciation of very low organic and inorganic mercury. Simplicity, low reagent and sample consumption and good sample throughput are the main characteristics of the system. / Neste trabalho foi desenvolvido um sistema em fluxo para análise de especiação de mercúrio envolvendo a separação e pré-concentração das espécies de Hg. O sistema foi acoplado a um espectrômetro de absorção atômica. A especiação de Hg é conduzida a partir das determinações seqüenciais de mercúrio (II) e mercúrio total. Na primeira etapa são gerados os vapores de Hg0 a partir de Hg(II) e hidreto de metilmercúrio (HMeHg) a partir do MeHg. Nesta etapa é feita somente a medição de Hg0. Na segunda etapa também são gerados Hg0 e HMeHg, porém as duas espécies na fase vapor são adsorvidas numa coluna de ouro. Após é feita a dessorção térmica das espécies de Hg da coluna e a detecção do Hg0 formado. Desta forma obtém-se a concentração total das espécies voláteis de Hg presentes na amostra. Por diferença se obtém a concentração de MeHg. O sistema em fluxo é composto por três válvulas solenóides, que tem a função de controlar a introdução das soluções de amostra/padrão e de NaBH4, bem como direcionar as espécies voláteis de Hg formadas para a coluna de Au ou diretamente para a cela de leitura do espectrômetro. A dessorção térmica das espécies de Hg da coluna de Au, formando Hg0, é feita através de aquecimento a uma temperatura em torno de 500 0C através de uma lâmpada halógena. Soluções de Hg(II) e MeHg de 100 a 1000 ng L-1 foram utilizadas para avaliar as variáveis que influenciam no sistema proposto, como, vazões de amostra e de argônio e concentrações dos reagentes (HCl e NaBH4). Nas condições estabelecidas para o sistema proposto é possível trabalhar em uma faixa de 100 até 5000 ng L-1 de Hg para determinação de Hg(II) e de 50 a 2000 ng L-1 de Hg para determinação de Hg total. Os limites de detecção calculados foram de 9,5 ng L-1 para MeHg e 68 ng L- 1 para Hg(ll). Com o sistema proposto é possível efetuar 24 medições por hora. O desvio padrão relativo é inferior a 2% na determinação de Hg(II) para uma solução de 500 ng L-1 e inferior a 2,5% para MeHg e 3% para Hg(ll) na determinação do Hg total para soluções de 100 ng L-1. As recuperações dos testes de adição de 10 e 100 ng de Hg total em três amostras de água variaram de 97 a 101%. O sistema FI-CVG AAS proposto para especiação de Hg é caracterizado pela fácil implementação, uso de apenas HCl e NaBH4 como reagentes, baixo consumo de reagentes (2,0 e 0,5 mL, respectivamente) e amostras (2,0 mL para Hg(II) e 6,8 mL para Hg total). Além disso, o sistema é de custo relativamente baixo e adequado para a análise de especiação de mercúrio em amostras de águas naturais.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In this work, the aim of this study is to evaluate sample preparation procedures and liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry (LC-ICP-MS) and LC coupled to chemical vapor generation (CVG) and ICP-MS (LC-CVG-ICP-MS) for identification and quantification of As species in mollusks collected in BTS. Conditions related to As species extraction were assessed with the use of microwave assisted extraction (MAE) and ultrasound-assisted extraction (UAE). The influence of the main parameters involved in extraction of As species such as the type and concentration of extraction solution, sample mass, temperature and extraction time were evaluated. The extraction was possible by using water at 80 °C (0.2 g sample and 6 mL of w ater) for 6 min using MAE. For the chromatographic separation the type of mobile phase [(NH4)2CO3 and (NH4)2HPO4] concentration (1 to 20 mmol L-1), pH (5.0 to 9.0), flow rate (1.05 to 1.45 mL min-1) and elution mode (isocratic and gradient) were evaluated. The volume of sample injected into the chromatograph was fixed to 200 μL. For the separation of As species an anion exchange column (Hamilton PRP-X100, 250 x 4.1 mm) was used. Six As species were detected in the mollusks being identified arsenobetaine (AsB), As(III), dimethylarsenic acid (DMA) and ρ- arsanilic acid (ρ-ASA). The best separation of the As species was obtained by gradient elution mode and using the following program: 0 to 1.4 min using 6 mmol L-1 (NH4)2HPO4 to 1.4 to 2.7 min using 20 mmol L-1 (NH4)2CO3 and 2.7 to 15 min using 6 mmol L-1 (NH4)2HPO4). The mobile phase flow rate was set at 1.25 mL min-1. CVG parameters were evaluated and the concentrations of NaBH4 and HCl, and carrier gas flow rate were set to 1.0% (m/v) 1.0 mol L-1 and 1.15 L min-1, respectively. The extraction procedures and determination of total As were evaluated using certified reference materials BCR 627 (Tuna Fish Tissue), DORM-2 (Dogfish Muscle) and NIST 1566b (Oyster tissue). The agreement of the results obtained was 95 ± 3 to 101 ± 5%, respectively. The sum of the concentrations of As species determined by LC-ICP-MS and the total As concentration in digested samples and extracts measured, determined by ICP OES were also in good agreement on a confidence level of 95% (Student t-Test). The developed methods by employing the LC-ICP-MS and LC-CVGICP- MS for As speciation analyses in bivalves mollusks are considered suitable. / Neste trabalho foi avaliado o preparo da amostra e o uso da cromatografia a líquido acoplada à espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (LC-ICP-MS) e LC acoplado ao sistema de geração química de vapor (CVG) e ICP-MS para a identificação e quantificação das espécies de As presentes em tecidos de moluscos bivalves. Condições relacionadas à extração das espécies de As foram avaliadas com o emprego de extração assistida por micro-ondas (MAE) e ultrassom (UAE). A influência dos principais parâmetros envolvidos na extração das espécies de As, como o tipo e concentração da solução extratora, massa de amostra, temperatura e o tempo de extração por MAE e o tempo de sonicação por US foram avaliados. Extração de As foi possível usando água a 80 °C (0,2 g de amostra e 6 mL de água) durante 6 min com MAE. Para a separação cromatográfica foram avaliados o tipo de fase móvel [(NH4)2CO3 e (NH4)2HPO4], a concentração (1 a 20 mmol L-1), o pH (5,0 a 9,0), a vazão (1,05 a 1,45 mL min-1) e o modo de eluição (isocrático e gradiente). O volume de amostra injetada no cromatógrafo foi fixado em 200 μL. Para a separação das espécies de As foi utilizada uma coluna de troca aniônica (Hamilton PRPX100, 250 x 4,1 mm). Foram detectadas seis espécies de As nos moluscos, sendo identificadas somente a arsenobetaína (AsB), o As(III), o dimetilarsênio (DMA) e o ácido ρ- arsanílico (ρ-ASA). A melhor separação das espécies de As foi obtida por eluição gradiente utilizando as seguintes condições: 0 a 1,4 min empregando 6 mmol L-1 de (NH4)2HPO4, 1,4 a 2,7 min empregando 20 mmol L-1 de (NH4)2CO3 e 2,7 a 15 min utilizando 6 mmol L-1 de (NH4)2HPO4. A vazão da fase móvel foi fixada em 1,25 mL min-1. Os parâmetros de CVG avaliados foram a concentração de NaBH4 e HCl e a vazão do gás de arraste, as quais foram fixadas em 1,0 % (m/v), 1,0 mol L-1 e 1,15 L min-1, respectivamente. Os procedimentos de extração e determinação de As total foram avaliados utilizando os materiais de referência certificados BCR 627 (Tuna Fish Tissue), DORM-2 (Dogfish Muscle) e NIST 1566b (Oyster tissue). A concordância entre os resultados obtidos foi de 95 ± 3 a 101 ± 5%, respectivamente. Os valores entre a soma das concentrações das espécies de As obtidos por LC-ICP-MS e As total nos digeridos e extratos obtidos, determinado por ICP OES também foram concordantes em um nível de confiança de 95% (Teste t-Student). Desta forma, o método desenvolvido empregando LC-ICP-MS e LC-CVG-ICP-MS foi considerado adequado para determinação de espécies de As em moluscos bivalves.

The family Caulimoviridae comprises viruses with semicircular double-stranded DNA genomes encapsulated into isometric or bacilliform particles, being divided into eight genera. The genus Badnavirus is the most important due to its high number of species reported infecting cultivated plants worldwide. The present study aimed to evaluate the taxonomic/phylogenetic positioning and population genetic variability into the genus Badnavirus. Initially, a data set comprising badnavirus full-length genome sequences was obtained from the non-redundant GenBank database. Multiple nucleotide sequence alignments were obtained for the data sets: complete genome; ORF III; full (1020pb) and partial (579pb) RT/RNaseH. Pairwise sequence comparisons, phylogenetic and recombination analyses were performed for all data sets. A total of 127 isolates were obtained, representing 53 badnavirus species. Nucleotide pairwise comparisons for the data sets RT/RNaseH and ORF III showed that a number of distinct badnavirus species shared up to 82,5% of identity, higher than the 80% threshold currently used for species demarcation in the genus. Bayesian phylogenetic trees showed four well supported clusters, with clusters 1 and 3 being sister groups comprising predominantly isolates infecting sugarcane and banana. Non-tree-like evolution evidenced a complex pattern of recombination, and at least 23 independent events were detected with recombination breakpoints occurring predominantly in the ORF III and in the intergenic region. By the analysis of nucleotide diversity of the partial RT/RNaseH region in 12 badnavirus population, a high genetic variability was observed. These results showed that mutation and recombination are important evolutionary mechanisms acting on the diversification of badnaviruses, and that the partial RT/RNaseH sequence is sufficient to determine the taxonomic placement of most viral species described in this genus. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A família Caulimoviridae compreende fitovírus com genomas semicirculares de DNA de fita dupla encapsidados em partículas isométricas ou baciliformes, sendo dividida em oito gêneros. O gênero Badnavirus é o mais importante devido ao seu alto número de espécies relatadas infectando plantas cultivadas em todo o mundo. O presente estudo teve como objetivo avaliar a variabilidade genética de populações e o posicionamento taxonômico/filogenético de espécies de badnavírus. Inicialmente, sequências completas para o genoma das espécies de badnavírus foram obtidas a partir do banco de dados não-redundante GenBank. Alinhamentos múltiplos das sequências nucleotídicas foram obtidos para os seguintes conjuntos de dados: genoma completo, ORFIII, RT/RNaseH completa (1020nt) e parcial (579nt). Comparações pareadas de sequências, análises filogenéticas, de recombinação e variabilidade genética foram realizadas para os conjuntos de dados. Um total de 127 isolados foram obtidos, representando 53 espécies de badnavírus. As comparações de sequências de nucleotídeos para o conjunto de dados RT/RnaseH (completa e parcial) mostraram que algumas espécies de badnavírus relatadas como distintas apresentam entre 57,1-82,5% de identidade, superior ao limite de 80,0% atualmente utilizado para a demarcação de espécies em Badnavirus. Resultados similares foram observados para os dados da ORFIII e genoma completo, reforçando que sequências parciais do domínio RT/RNaseH são suficiente para determinar o posicionamento taxonômico da maioria das espécies descritas neste gênero. Quatro grupos (clusters 1-4) bem suportados foram observados nas árvores filogenéticas para genoma completo e ORFIII, com os cluster 1 e 3 formando grupos irmãos compreendendo espécies/isolados infectando predominantemente cana-de-açúcar (Saccharum spp.) e banana (Musa spp.). Análise de evolução em rede evidenciou alguns possíveis eventos de recombinação afetando a diversificação de espécies de badnavírus, com pelo menos 23 eventos independentes sendo detectados com pontos de recombinação ocorrendo predominantemente na ORFIII e região intergênica. Finalmente, altos índices de diversidade nucleotídica foram observados para a região RT/RnaseH parcial em populações de 12 espécies distintas de badnavírus. Estes resultados mostram que mutação e recombinação são mecanismos importantes atuando na evolução dos badnavírus.

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