Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-18Bitstream added on 2014-06-13T20:26:09Z : No. of bitstreams: 1 silva_rb_dr_botfmvz.pdf: 496820 bytes, checksum: 055e35414ee23830cc537670a4ae215b (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Durante o desenvolvimento ovariano fetal, a formação folicular inicial é decisiva para a fertilidade da fêmea, pois define sua reserva gametogênica. Tem sido proposto que a progesterona e o estradiol desempenham papel regulatório na foliculogênese pré-antral, de forma que sua produção reduzida em ovários fetais bovinos antecede o surgimento de folículos primordiais e primários. Recentemente, os FGFs 10 e 18 foram reportados em folículos ovarianos bovinos como redutores dos níveis de esteróides, o que parece envolver a inibição da expressão de enzimas necessárias à esteroidogênese. Em adição, a expressão do FGF10 foi observada durante o desenvolvimento ovariano fetal bovino, e esteve positivamente associada ao aumento no número de folículos primários. O presente estudo investigou primeiramente o padrão de expressão do RNAm das enzimas esteroidogênicas (StAR, CYP11A1, 3β-HSD, CYP17A1, CYP19A1 e 17β-HSD) em ovários de fetos bovinos em idades gestacionais específicas (60, 75, 90, 120, 150 e 210 dias). Todos os genes investigados se mostraram expressos e regulados ao longo da gestação. Os níveis de RNAm da CYP19A1 diminuíram dos 60 para os 90 dias, sugerindo envolvimento desta enzima com a produção decrescente de estradiol observada previamente durante este período gestacional. A expressão das demais enzimas foi elevada ao longo da gestação, coincidente com o aumento da competência esteroidogênica descrito preliminarmente durante o desenvolvimento folicular inicial. Em adição, foi investigada a participação dos FGFs 10 e 18 na esteroidogênese ovariana fetal bovina. A expressão do FGF18 e de seus receptores (FGFR2C, FGFR3C e FGFR4) foi detectada em ovários fetais bovinos ao longo da gestação (60, 75, 90, 120, 150 e 210 dias). A abundância de RNAm do FGF18 aumentou... / During fetal ovarian development, early follicular formation is essential to female fertility, when the gametogenic reserve is defined. It has been proposed that progesterone and estradiol play regulatory role on preantral folliculogenesis, once its reduced production in bovine fetal ovaries precedes primordial and primary follicle assembly. Recentlly, FGFs 10 and 18 were reported in bovine ovarian follicles as reducers of steroids levels, and this seems to involve the inhibition of enzymes necessary to steroidogenesis. In addition, FGF10 expression was observed during bovine fetal ovary development, and it was positively associated with the elevation on primary follicles number. The present study first investigated the mRNA expression patterns for steroidogenic enzymes (StAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, CYP19A1 and HSD17B1) in bovine fetal ovaries at specific gestational ages (60, 75, 90, 120, 150 e 210 days). Expression of all investigated genes was detected and regulated through gestation. Messenger RNA levels of CYP19A1 decreased from days 60 to 90 of gestation, suggesting involvement of this enzyme on decrescent estradiol production previously observed during this gestational period. The expression of other enzymes was elevated during gestational period, which was coincident with the enhance of steroidogenic competence previously described during early follicular development. In addition, the participation of FGFs 10 and 18 on steroidogenesis in bovine fetal ovaries was investigated. The expression of FGF18 and its receptors (FGFR2C, FGFR3C and FGFR4) was detected in bovine fetal ovaries through gestation (60, 75, 90, 120, 150 e 210 days). The mRNA abundance of FGF18 enhanced between 90 and 120 days and decreased at 210 days. The expression of FGFR2C and FGFR4 did not vary during... (Complete abstract click electronic access below)

A amígdala medial (AMe) é um núcleo superficial do complexo amigdalóide e que ocupa seu aspecto rostromedial. A AMe modula uma série de comportamentos além de modular a memória e o aprendizado associado a estímulos olfativos e visuais. Em ratos é uma estrutura sexualmente dimórfica e está dividida em quatro subnúcleos: ântero-dorsal (AMeAD), ântero-ventral (AMeAV), póstero-dorsal (AMePD) e pósteroventral (AMePV). A AMe apresenta células com características morfológicas variadas e receptores para hormônios gonadais amplamente distribuídos entre todos os seus subnúcleos, mas principalmente na AMePD. O presente trabalho teve por objetivo estudar a ação dos esteróides sexuais na densidade de espinhos dendríticos na AMePD de ratas ovariectomizadas e se sua ação pode ser mediada pelos receptores do tipo NMDA. Para tanto, foram utilizadas ratas Wistar adultas (n = 6 por grupo experimental, descritos a seguir) que foram ovariectomizadas e injetadas com veículo oleoso (“O”; 0,1ml s.c.); benzoato de estradiol (“BE”; 10μg/0,1ml s.c.); benzoato de estradiol e progesterona (“BE+P”; 10μg/0,1ml e 500μg/0,1ml s.c.). Adicionalmente, foram estudadas fêmeas ovariectomizadas e que receberam benzoato de estradiol e salina (“BE+S”; 10μg/0,1ml s.c. e 0,2 ml i.p.) ou benzoato de estradiol e LY235959, antagonista específico dos receptores do tipo NMDA para o glutamato (“BE+LY235959”; 10μg/0,1ml s.c. e 3mg/Kg i.p.). Todas as injeções foram feitas ao longo de 4 dias. Cinco horas após a última injeção, os animais foram anestesiados e submetidos à técnica de Golgi do tipo “single-section”. Os encéfalos foram seccionados em vibrátomo e os cortes foram colocados, após fixação, em solução de bicromato de potássio e, a seguir, em nitrato de prata. Neurônios bem impregnados e indubitavelmente presentes na AMePD foram selecionados para estudo. Os espinhos presentes nos primeiros 40 μm dendríticos foram desenhados com auxílio de uma câmara clara acoplada a microscópio óptico em aumento de 1000X. Cada animal teve 8 ramos dendríticos selecionados, um por neurônio diferente, perfazendo 48 ramos ao total em cada grupo experimental. Os valores obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) de uma via e ao teste post hoc de Bonferroni (primeiros 3 grupos) ou ao teste “t” de Student não-pareado (últimos 2 grupos), ambos com α = 5%. Os resultados indicaram que as ratas que foram ovariectomizadas e tratadas com O, BE e BE+P apresentaram uma diferença estatisticamente significante entre si [F(2,143) = 104,24; p < 0,001]. Os grupos BE e BE+P (média ± epm = 1,91 ± 0,04 e 2,67 ± 0,05, respectivamente) apresentaram maior densidade de espinhos dendríticos na AMePD quando comparados ao grupo controle injetado com óleo (1,60 ± 0,05; p < 0,001). Adicionalmente, nos grupos BE+S e BE+LY235959, a densidade de espinhos dendríticos diminuiu no grupo que recebeu o antagonista dos receptores do tipo NMDA (2,02 ± 0,04) em relação ao que recebeu salina (2,15 ± 0,04; p = 0,04). O presente estudo sugere que a densidade de espinhos dendríticos na AMePD é afetada pelos hormônios gonadais femininos, sendo que a progesterona potencializa o efeito do estradiol. De forma muito interessante, a ação do estradiol parece ocorrer, pelo menos em parte, pela interação com receptores do tipo NMDA. Esses resultados podem contribuir para o entendimento da plasticidade morfológica e sináptica representada pela densidade de espinhos dendríticos na AMePD, a qual parece ser mediada pelos esteróides sexuais e em área do sistema nervoso relacionada com a modulação de comportamento reprodutivo feminino.

O fato de esteróides de plantas apresentarem tanto funções fisiológicas quanto ecológicas, talvez tenha sido fator limitante de seu uso em quimiossistemática. Até hoje, os trabalhos do nosso grupo têm se restringido a marcadores com apenas funções ecológicas. Neste trabalho, utilizamos esteróides como marcadores quimiossistemáticos, com o intuito de descobrir se eles poderiam ser analisados com a metodologia usual desenvolvida por nosso grupo. Devido à ampla distribuição dessas moléculas, limitamos o trabalho a angiospermas. Inicialmente, realizamos um levantamento bibliográfico no Chemical Abstracts (até dezembro de 1986) e, em uma segunda etapa, codificamos e armazenamos os dados em um microcomputador IBM-PC. A presença de alguns esteróis (campesterol, sitosterol, colesterol e estigmasterol) em praticamente todos organismos, levou-nos a eliminar deste trabalho esse grupo de substâncias, pois características imutáveis não têm valor quimiossistemático. Baseados em semelhanças estruturais, separamos os esteródes em oito tipos, a saber: esteróides, brassinolídeos, ecdisonas, sapogeninas, witanolídeos, pregnanos, cardenolídeos e bufodienolídeos. Esta classificação foi legitimada por análises estatísticas (testes não-paramétricos). Os índices de oxidação e especialização de esqueleto (metodologia do nosso grupo) não revelaram muitas diferenças dentro de cada tipo esteroidal. De um modo geral, estes tipos esteroidais apresentam-se predominantemente distribuídos em certos grupos de angiospermas. Este é, por exemplo, o caso das ecdisonas em Caryophyllales e Lamiales, dos witanolídeos em Solanales e, dos cardenolídeos e pregnanos em Gentianales. Por outro lado, enquanto superordens, como Magnoliiflorae, apresentam apenas esteróis (tipo menos oxidado e menos especializado), outras superordens, como Ranunculiflorae, Solaniflorae e Liliiflorae, apresentam uma fantástica diversidade de tipos. As monocotiledôneas se caracterizam pela presença de saponinas, e os outros tipos (exceto esteróis) aparecem com distribuição esparsa. Comparando nossos dados com os de pteridófitas gimnospermas (apenas esteróis e ecdisonas), podemos concluir que a diversidade dessa classe de micromoléculas em angiospermas coloca os esteróides na posição de uma característica evoluída de plantas. / Plant steroids perform not only ecological, but also physiological functions. Hence it was thought a priori that their use as chemosystematic markers should be of doubtful value. The present work aimed to evaluate the correctness of this concept. In view of the vast natural distribution of steroids we restricted our efforts to the angiosperms. Initially we undertook a literature survey in Chemical Abstracts (up to 1986) and then we codified and stored the data in a microcomputer IBM-PC. Some of the steroids (campesterol, colesterol, sitosterol and stigmasterol) occur practically in alI organisms. Since constant characters are of little systematic value, such compounds were omitted from our study. According to structural analogies we separated plant steroids in eight types: simple steroids, brassinolides, ecdysons, sapogenins, withanolides, pregnanes, cardenolides and bufodienolides. This classification was authenticated by statistical analyses (non parametric tests).The skeletal speciaIizations and the oxidation levels (according to methodology developed by our group) did not differ greatly wthin each steroidal group. However the general distribution of steroids in angiosperms is quite selective. This is the case e.g. for ecdysons in Caryophyllales and Lamiales. On the other hand, while superordens such as Magnoliiflorea are characterized only by steroids (the least specialized and oxygenated type), other superordens such as Ranunculiflorae, Solaniflorae and Liliiflorae are characterized by a very considerable number of types. The monocotyledons contain chiefly saponins, other types (except steroids) appearing more sparsly distributed. In contrast to angiosperms pteridophytes and gymnosperms posses only few steroidal types (simple steroids and ecdysons). Hence diversity of this micromolecular class is an indication of phylogenetic advance in the plant kingdom.

Orientador: Irani Quagio Grassiotto / Coorientador: Robie Allan Bombardelli / Banca: Evoy Zaniboni Filho / Banca: Hugo Pereira Godinho / Banca: Sérgio Ricardo Batlouni / Banca: Laura Satiko Okada Nakaghi / Resumo: Entender a dinâmica e os eventos reprodutivos de cada espécie é essencial para o controle e melhoria da reprodução em cativeiro. O surubim do Iguaçu faz parte um programa de repovoamento do rio Iguaçu e suas proles provêm de reprodução induzida, porém aspectos básicos de sua biologia reprodutiva, como idade em que acontece o primeiro ciclo de reprodução e os meses que representam o período reprodutivo, são desconhecidos ou pouco explorados. O trabalho foi conduzido a fim de levantar informações a respeito do desenvolvimento reprodutivo da espécie, em uma população de cativeiro. Foram utilizados peixes juvenis (n≈154), machos e fêmeas, a partir de um ano de idade que foram acompanhados, mensalmente, durante 24 e 36 meses, respectivamente. Foram avaliados parâmetros referentes ao desenvolvimento gonadal, alterações celulares e flutuação de esteroides sexuais (estradiol e testosterona) ao longo do tempo. Nas condições do experimento, os animais apresentaram crescimento corporal e ganho de peso gradual. Fêmeas apresentaram desenvolvimento sexual tardio e permaneceram imaturas até 48 meses (4 anos de idade). Observou-se o desenvolvimento celular e alteração nos níveis de esteroides, que acompanharam os picos verificados para os machos. Os machos apresentaram ciclo reprodutivo do primeiro para o segundo ano de vida e todas as fases reprodutivas foram observadas. O padrão de desenvolvimento gonadal, aliado às modificações celulares e flutuação de esteroides indica o período reprodutivo dos machos nos meses de setembro a novembro (primavera) / Abstract: Understand events and reproductive dynamics is essential for the appropriate management and control of reproductive function in captivity. The species, ―surubim do Iguaçu‖ is include in Iguaçu river reintroduction programs and offspring's were obtain by induce spawning, but reproductive biology aspects, as first maturation age and reproductive season are lower explored or no available. The research was realized to provide information about surubim's reproductive development, in captive conditions. Were evaluated juvenile individuals, with one year old, every month due 24 and 36 months, to male and female, respectively. Were evaluated gonad developments, cell modifications and steroids fluctuations (estradiol and testosterone), during all experimental time. The fish showed gradative growth and weight gain. Female present slow sexual development and stay in immature status after 48 months (4 years age). Cellular modifications and steroids elevation levels were verified, and peaked of steroids occur in same time of male peaked. Male showed reproductive cycle with two years old and all reproductive phases of were observed. The gonadal development with to cellular changes and steroids fluctuation indicates the breeding season the males in the months from September to November (spring) / Doutor

A concentração intratesticular de andrógenos no período fetal e neonatal é elevada, entretanto as células de Sertoli não expressam o receptor intracelular de andrógenos (iAR). Assim, neste período as células de Sertoli não respondem aos andrógenos através dos mecanismos clássicos. A importância fisiológica da elevada concentração de andrógenos ainda não é compreendida, acredita-se ser em virtude de sua ação através de mecanismos não-clássicos. Os hormônios T (testosterona) e FSH atuam sinergicamente para aumentar a eficiência da espermatogênese, entretanto estudos mostram que o FSH bloqueia a fosforilação ERK mediada pela ação não-clássica da T. Este estudo teve por objetivos: avaliar a expressão de iAR em células de Sertoli de ratos Wistar no 4º e 5º dpn; avaliar o efeito da T e da EpiT sobre a captação de cálcio em testículos de ratos no 4º dpn; avaliar o efeito da T sobre o potencial de membrana de células de Sertoli de ratos no 5º dpn; e avaliar a interação entre os efeitos eletrofisiológicos da T e epitestosterona (EpiT) com o FSH em células de Sertoli de ratos no 14º dpn. A técnica de imunoistoquímica foi utilizada para a avaliação a imunorreatividade ao iAR (n=5 por grupo). Na técnica de captação de 45Ca2+ testículos inteiros de ratos no 4º dpn foram pré-incubados com 45Ca2+ por 60 minutos e incubados com T (1 μM) ou EpiT (1 μM) por 5 minutos (n=5 por grupo). O potencial e a resistência de membrana das células de Sertoli foram registrados através da técnica eletrofisiológica de registro intracelular. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares de borossilicato preenchidos com KCl 3 M acoplados a um eletrômetro. Nos testículos de animais no 5º dpn foi realizada a aplicação de T (1 μM), n=4. Nos animais no 14º dpn foi realizada a aplicação de FSH (4 mU) seguida da aplicação de T (1 μM) ou e EpiT (1 μM), após 30 segundos (n=7 e 6, respectivamente); e EpiT (1μM) após 5 minutos (n=6). Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados foram analisados pelo teste T student para comparação entre dois grupos, ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni e teste de Friedmann, seguido do pós-teste de Dunn. Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA/UFRGS n° 22635. A imunorreação ao iAR foi observa nas células de Leydig e células peritubulares em todas as idades. Não foi observada marcação referente a iAR em células de Sertoli de ratos Wistar no 4º e 5º dpn. T e EpiT estimularam a captação de cálcio em testículos de ratos no 4º dpn. A aplicação tópica de T promoveu a despolarização do potencial de membrana de células de Sertoli de ratos no 4º dpn. A aplicação de FSH seguida da aplicação de T e EpiT promoveu uma redução da reposta dos dois hormônios. Já aplicação de EpiT 5 minutos após a aplicação do FSH resultou em um retardo da despolarização promovida pela EpiT. A resistência da célula também foi reduzida, em comparação com a resistência da aplicação isolada da EpiT. Concluímos que: as células de Sertoli de ratos Wistar não expressam iAR no 4º e 5º dpn; T e EpiT atuam através do mecanismo de ação não clássico estimulado a captação de cálcio em testículos inteiros de ratos no 4º dpn; e a T produz um efeito despolarizante sobre a membrana de células de Sertoli de ratos no 5º dpn similar ao já observado aos 15 dias. Este efeito não-clássico produzido pelos andrógenos é mediado por um receptor, ainda não identificado, localizado na membrana celular ou próximo a ela, estruturalmente diferente do iAR. A interação entre os efeitos do FSH e andrógenos sobre o potencial de membrana de células de Sertoli resulta na redução da resposta despolarizante desencadeada pelos hormônios. / The intratesticular testosterone concentration is high in the early postnatal period, but the intracellular androgen receptor expression is still absent in Sertoli cells. Thus, these cells do not respond to androgens, through classical mechanisms. The physiological importance of the high concentration of androgens in the testes is not fully understood, it is believed to be due to its action through non-classical mechanisms. Both FSH and T (testosterone) increase the spermatogenic efficiency, however studies show that FSH blocks testosterone-mediated activation of ERK mediated by non-classic action. This study aimed to evaluate iAR expression in Sertoli cells from Wistar rats on post-natal day (pnd) 4 and 5; the non-classical effects of testosterone and epitestosterone on calcium uptake and the electrophysiological effects of testosterone (1 μM) on Sertoli cells from rats on pdn 4 and 5 with lack of expression of intracellular androgen receptor (iAR), and evaluate the crosstalk on electrophysiological effects of testosterone and epitestosterone with FSH in Sertoli cells from rats on pnd 14. Immunohistochemistry was used to evaluate iAR immunoreactivity in Sertoli cells from Wistar rats (n = 5 each group). Calcium uptake was investigated using whole testes from rats on pdn 4. The testicular tissue was pre-incubated in Hank’s balanced salt solution (HBSS) with 45Ca2+ for 60 min (n=5 in each group). Then, testes were incubated in HBSS with 45Ca2+, with or without T (1 μM) or EpiT (1 μM) for five minutes. The membrane potential of Sertoli cells was recorded using a standard single microelectrode technique. The intracellular recording of Sertoli cells was performed using microcapillaries filled with 3 M KCl coupled to an electrometer. T (1 μM) it was apply in testis of rats on pnd 5 (n=5). In animals on pnd 14 FSH (4 mU) injection was followed by the application of T (1 μM) or EpiT (1 μM) after 30 seconds (n = 7 and 6, respectively) and EpiT (1μM), after 5 minutes (n = 6). The results are given as mean ± SEM. For statistical analyses it was used Student T-test, ANOVA for repeated measures followed by Bonferroni post-test and Friedman test followed by Dunn's post-test. This study was approved by the Ethics Committee for animal research of UFRGS (process number CEUA/UFRGS n° 22635). The iAR immunoreactivity was observed in Leydig and peritubular cells at all ages. No immunoreaction concerning of iAR was observed in Sertoli cells on pnd 4 and 5. At this age both, testosterone and epitestosterone increased 45Ca2+ uptake, within 5 minutes of incubation. Testosterone promoted membrane potential depolarization of Sertoli cells on pnd 5. FSH application followed by testosterone and epitestosterone reduced the depolarization of the two hormones. Application of epitestosterone five minutes after FSH resulted in a delay of epitestosterone-promoted depolarization. The cell resistance was also reduced in comparison with the resistance of the isolated application EpiT. Sertoli cells from rats on pnd 4 and 5 do not express iAR. Both T and EpiT act through non-classical mechanism stimulating calcium uptake in whole rat testes on dpn 4. T produces a depolarizing effect on the Sertoli cell membrane of rats on pnd 5 similar to observed at 15-day-old rats. This non classical action of androgens is mediated by a receptor, not yet identified, situated in the membrane cell or close to it, different from iAR. FSH, and testosterone/epitestosterone affect each other electrophysiological responses suggesting a cross talking in the intracellular signaling pathways.

A amígdala medial (AMe) é um núcleo superficial do complexo amigdalóide e que ocupa seu aspecto rostromedial. A AMe modula uma série de comportamentos além de modular a memória e o aprendizado associado a estímulos olfativos e visuais. Em ratos é uma estrutura sexualmente dimórfica e está dividida em quatro subnúcleos: ântero-dorsal (AMeAD), ântero-ventral (AMeAV), póstero-dorsal (AMePD) e pósteroventral (AMePV). A AMe apresenta células com características morfológicas variadas e receptores para hormônios gonadais amplamente distribuídos entre todos os seus subnúcleos, mas principalmente na AMePD. O presente trabalho teve por objetivo estudar a ação dos esteróides sexuais na densidade de espinhos dendríticos na AMePD de ratas ovariectomizadas e se sua ação pode ser mediada pelos receptores do tipo NMDA. Para tanto, foram utilizadas ratas Wistar adultas (n = 6 por grupo experimental, descritos a seguir) que foram ovariectomizadas e injetadas com veículo oleoso (“O”; 0,1ml s.c.); benzoato de estradiol (“BE”; 10μg/0,1ml s.c.); benzoato de estradiol e progesterona (“BE+P”; 10μg/0,1ml e 500μg/0,1ml s.c.). Adicionalmente, foram estudadas fêmeas ovariectomizadas e que receberam benzoato de estradiol e salina (“BE+S”; 10μg/0,1ml s.c. e 0,2 ml i.p.) ou benzoato de estradiol e LY235959, antagonista específico dos receptores do tipo NMDA para o glutamato (“BE+LY235959”; 10μg/0,1ml s.c. e 3mg/Kg i.p.). Todas as injeções foram feitas ao longo de 4 dias. Cinco horas após a última injeção, os animais foram anestesiados e submetidos à técnica de Golgi do tipo “single-section”. Os encéfalos foram seccionados em vibrátomo e os cortes foram colocados, após fixação, em solução de bicromato de potássio e, a seguir, em nitrato de prata. Neurônios bem impregnados e indubitavelmente presentes na AMePD foram selecionados para estudo. Os espinhos presentes nos primeiros 40 μm dendríticos foram desenhados com auxílio de uma câmara clara acoplada a microscópio óptico em aumento de 1000X. Cada animal teve 8 ramos dendríticos selecionados, um por neurônio diferente, perfazendo 48 ramos ao total em cada grupo experimental. Os valores obtidos foram submetidos à análise de variância (ANOVA) de uma via e ao teste post hoc de Bonferroni (primeiros 3 grupos) ou ao teste “t” de Student não-pareado (últimos 2 grupos), ambos com α = 5%. Os resultados indicaram que as ratas que foram ovariectomizadas e tratadas com O, BE e BE+P apresentaram uma diferença estatisticamente significante entre si [F(2,143) = 104,24; p < 0,001]. Os grupos BE e BE+P (média ± epm = 1,91 ± 0,04 e 2,67 ± 0,05, respectivamente) apresentaram maior densidade de espinhos dendríticos na AMePD quando comparados ao grupo controle injetado com óleo (1,60 ± 0,05; p < 0,001). Adicionalmente, nos grupos BE+S e BE+LY235959, a densidade de espinhos dendríticos diminuiu no grupo que recebeu o antagonista dos receptores do tipo NMDA (2,02 ± 0,04) em relação ao que recebeu salina (2,15 ± 0,04; p = 0,04). O presente estudo sugere que a densidade de espinhos dendríticos na AMePD é afetada pelos hormônios gonadais femininos, sendo que a progesterona potencializa o efeito do estradiol. De forma muito interessante, a ação do estradiol parece ocorrer, pelo menos em parte, pela interação com receptores do tipo NMDA. Esses resultados podem contribuir para o entendimento da plasticidade morfológica e sináptica representada pela densidade de espinhos dendríticos na AMePD, a qual parece ser mediada pelos esteróides sexuais e em área do sistema nervoso relacionada com a modulação de comportamento reprodutivo feminino.

A concentração intratesticular de andrógenos no período fetal e neonatal é elevada, entretanto as células de Sertoli não expressam o receptor intracelular de andrógenos (iAR). Assim, neste período as células de Sertoli não respondem aos andrógenos através dos mecanismos clássicos. A importância fisiológica da elevada concentração de andrógenos ainda não é compreendida, acredita-se ser em virtude de sua ação através de mecanismos não-clássicos. Os hormônios T (testosterona) e FSH atuam sinergicamente para aumentar a eficiência da espermatogênese, entretanto estudos mostram que o FSH bloqueia a fosforilação ERK mediada pela ação não-clássica da T. Este estudo teve por objetivos: avaliar a expressão de iAR em células de Sertoli de ratos Wistar no 4º e 5º dpn; avaliar o efeito da T e da EpiT sobre a captação de cálcio em testículos de ratos no 4º dpn; avaliar o efeito da T sobre o potencial de membrana de células de Sertoli de ratos no 5º dpn; e avaliar a interação entre os efeitos eletrofisiológicos da T e epitestosterona (EpiT) com o FSH em células de Sertoli de ratos no 14º dpn. A técnica de imunoistoquímica foi utilizada para a avaliação a imunorreatividade ao iAR (n=5 por grupo). Na técnica de captação de 45Ca2+ testículos inteiros de ratos no 4º dpn foram pré-incubados com 45Ca2+ por 60 minutos e incubados com T (1 μM) ou EpiT (1 μM) por 5 minutos (n=5 por grupo). O potencial e a resistência de membrana das células de Sertoli foram registrados através da técnica eletrofisiológica de registro intracelular. O registro intracelular da célula de Sertoli foi realizado utilizando microcapilares de borossilicato preenchidos com KCl 3 M acoplados a um eletrômetro. Nos testículos de animais no 5º dpn foi realizada a aplicação de T (1 μM), n=4. Nos animais no 14º dpn foi realizada a aplicação de FSH (4 mU) seguida da aplicação de T (1 μM) ou e EpiT (1 μM), após 30 segundos (n=7 e 6, respectivamente); e EpiT (1μM) após 5 minutos (n=6). Os resultados foram dados como média ± SEM. Os dados foram analisados pelo teste T student para comparação entre dois grupos, ANOVA para medidas repetidas com o pós-teste de Bonferroni e teste de Friedmann, seguido do pós-teste de Dunn. Este projeto foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA/UFRGS n° 22635. A imunorreação ao iAR foi observa nas células de Leydig e células peritubulares em todas as idades. Não foi observada marcação referente a iAR em células de Sertoli de ratos Wistar no 4º e 5º dpn. T e EpiT estimularam a captação de cálcio em testículos de ratos no 4º dpn. A aplicação tópica de T promoveu a despolarização do potencial de membrana de células de Sertoli de ratos no 4º dpn. A aplicação de FSH seguida da aplicação de T e EpiT promoveu uma redução da reposta dos dois hormônios. Já aplicação de EpiT 5 minutos após a aplicação do FSH resultou em um retardo da despolarização promovida pela EpiT. A resistência da célula também foi reduzida, em comparação com a resistência da aplicação isolada da EpiT. Concluímos que: as células de Sertoli de ratos Wistar não expressam iAR no 4º e 5º dpn; T e EpiT atuam através do mecanismo de ação não clássico estimulado a captação de cálcio em testículos inteiros de ratos no 4º dpn; e a T produz um efeito despolarizante sobre a membrana de células de Sertoli de ratos no 5º dpn similar ao já observado aos 15 dias. Este efeito não-clássico produzido pelos andrógenos é mediado por um receptor, ainda não identificado, localizado na membrana celular ou próximo a ela, estruturalmente diferente do iAR. A interação entre os efeitos do FSH e andrógenos sobre o potencial de membrana de células de Sertoli resulta na redução da resposta despolarizante desencadeada pelos hormônios. / The intratesticular testosterone concentration is high in the early postnatal period, but the intracellular androgen receptor expression is still absent in Sertoli cells. Thus, these cells do not respond to androgens, through classical mechanisms. The physiological importance of the high concentration of androgens in the testes is not fully understood, it is believed to be due to its action through non-classical mechanisms. Both FSH and T (testosterone) increase the spermatogenic efficiency, however studies show that FSH blocks testosterone-mediated activation of ERK mediated by non-classic action. This study aimed to evaluate iAR expression in Sertoli cells from Wistar rats on post-natal day (pnd) 4 and 5; the non-classical effects of testosterone and epitestosterone on calcium uptake and the electrophysiological effects of testosterone (1 μM) on Sertoli cells from rats on pdn 4 and 5 with lack of expression of intracellular androgen receptor (iAR), and evaluate the crosstalk on electrophysiological effects of testosterone and epitestosterone with FSH in Sertoli cells from rats on pnd 14. Immunohistochemistry was used to evaluate iAR immunoreactivity in Sertoli cells from Wistar rats (n = 5 each group). Calcium uptake was investigated using whole testes from rats on pdn 4. The testicular tissue was pre-incubated in Hank’s balanced salt solution (HBSS) with 45Ca2+ for 60 min (n=5 in each group). Then, testes were incubated in HBSS with 45Ca2+, with or without T (1 μM) or EpiT (1 μM) for five minutes. The membrane potential of Sertoli cells was recorded using a standard single microelectrode technique. The intracellular recording of Sertoli cells was performed using microcapillaries filled with 3 M KCl coupled to an electrometer. T (1 μM) it was apply in testis of rats on pnd 5 (n=5). In animals on pnd 14 FSH (4 mU) injection was followed by the application of T (1 μM) or EpiT (1 μM) after 30 seconds (n = 7 and 6, respectively) and EpiT (1μM), after 5 minutes (n = 6). The results are given as mean ± SEM. For statistical analyses it was used Student T-test, ANOVA for repeated measures followed by Bonferroni post-test and Friedman test followed by Dunn's post-test. This study was approved by the Ethics Committee for animal research of UFRGS (process number CEUA/UFRGS n° 22635). The iAR immunoreactivity was observed in Leydig and peritubular cells at all ages. No immunoreaction concerning of iAR was observed in Sertoli cells on pnd 4 and 5. At this age both, testosterone and epitestosterone increased 45Ca2+ uptake, within 5 minutes of incubation. Testosterone promoted membrane potential depolarization of Sertoli cells on pnd 5. FSH application followed by testosterone and epitestosterone reduced the depolarization of the two hormones. Application of epitestosterone five minutes after FSH resulted in a delay of epitestosterone-promoted depolarization. The cell resistance was also reduced in comparison with the resistance of the isolated application EpiT. Sertoli cells from rats on pnd 4 and 5 do not express iAR. Both T and EpiT act through non-classical mechanism stimulating calcium uptake in whole rat testes on dpn 4. T produces a depolarizing effect on the Sertoli cell membrane of rats on pnd 5 similar to observed at 15-day-old rats. This non classical action of androgens is mediated by a receptor, not yet identified, situated in the membrane cell or close to it, different from iAR. FSH, and testosterone/epitestosterone affect each other electrophysiological responses suggesting a cross talking in the intracellular signaling pathways.

Existe una amplia gama de fármacos capaces de producir un potente y selectivo efecto en la inhibición de la nocicepción o transmisión dolorosa, tanto a nivel experimental como a nivel clínico. Entre los agentes que provocan tal respuesta se tiene a los agentes analgésicos antiinflamatorios no esteroidales (AINEs). Los AINEs son fármacos muy usados en los diferentes tipos de dolor, tanto agudos como crónicos y por lo tanto, son de los más estudiados. Sin embargo, ellos independientes de su eficacia, presentan una serie de reacciones adversas que limitan su uso. El estudio sistemático de la acción combinada de AINEs no ha sido completamente abordado, con tal fin en el presente trabajo se estudió la interacción entre ibuprofeno con paracetamol en el test de las contorsiones abdominales. Se utilizaron ratones de la cepa CF-1, a los que se les administró por vía i.p., al tiempo del máximo efecto, proporciones fijas (1/2, 1/4, 1/8 y 1/16) de la DE50 de ibuprofeno y paracetamol y se determinó por análisis isobolográfico la naturaleza de la interacción que resultó ser de tipo sinérgica. El efecto del sistema opioide se evaluó con animales pretratados con naltrexona 1 mg/kg i.p., antagonista opioide, y se comprobó que no existe modificación de la naturaleza de la interacción entre ibuprofeno y paracetamol. Los resultados del presente trabajo comprueban un efecto sinérgico en la actividad antinociceptiva de la co-administración sistémica de ibuprofeno con paracetamol en el cual no participa el sistema opioide.

El dolor es la primera causa de consulta al odontólogo. Por esto que es de suma importancia saber tratarlo correctamente para poder brindar a nuestros pacientes una solución eficaz a su problema. En las últimas décadas se ha centrado el estudio del dolor en animales mediante el uso de métodos algesiométricos que permitan evaluar el efecto antinociceptivo de distintos fármacos analgésicos y sus combinaciones. Un grupo de éstos son los analgésicos antiinflamatorios no esteroidales (AINEs) los cuales son ampliamente utilizados en el dolor, sin embargo, su uso conlleva una serie de efectos adversos que limitan su uso. Para contrarrestarlos, se han desarrollado combinaciones de fármacos que permitan aumentar los efectos analgésicos y disminuir las reacciones adversas. En este trabajo se estudian dos AINEs, paracetamol y meloxicam, para evaluar su interacción en el ensayo de dolor agudo térmico denominado tail-flick o test de la cola. Se utilizaron ratones de la cepa CF/1 a los que se le administró vía intraperitoneal, al tiempo del máximo efecto, las drogas en proporciones fijas de 1/2, 1/4, 1/8 y 1/16 de las DE25 de paracetamol y meloxicam, y mediante un análisis isobolográfico se determinó que la interacción, es de tipo supraaditiva o sinérgica. Se evaluó el efecto del sistema opioide por el pretramiento de los animales con el antagonista opioide, naltrexona, y se comprobó que no existe modificación de la naturaleza de la interacción. Los resultados obtenidos en este trabajo demuestran que existe un efecto sinérgico en la actividad antinociceptiva que desarrollan el paracetamol y meloxicam al administrarlos conjuntamente, y que el sistema opioide no modifica esta interacción. Estos hallazgos, son de relevancia para el desarrollo de nuevas asociaciones de fármacos que produzcan mayor analgesia con los menores efectos tóxicos, lo que sin duda es un área prometedora en el estudio del tratamiento farmacológico del dolor.

Doctora en Bioquímica / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento hasta diciembre de 2015 / El endometrio es un tejido que requiere de la acción de los esteroides para su correcta función; de modo que patologías que alteren la concentración de esteroides inducen fallas en la fisiología endometrial, como es el caso del Síndrome de Ovario Poliquístico (PCOS). Los endometrios de mujeres con PCOS (PCOSE) presentan un incremento de los procesos de proliferación celular, caracterizados por altos niveles de proteínas ciclina D1, Ki67 y disminución de p27. En este contexto, se sabe que los estrógenos generan efectos pro-proliferativos en el tejido endometrial. Los esteroides pueden ser originados por la metabolización intratisular (origen intracrino) desde precursores como la DHEAS que son convertidos en esteroides con actividad estrogénica y/o androgénica. Para esto se requiere que los precursores sulfatados ingresen a las células a través de transportadores de las familias OATPs y OATs. Además, se necesita la expresión y actividad de enzimas que metabolizan los esteroides. Previamente, hemos reportado que en PCOSE existe un incremento en la metabolización de DHEA a androstenediol, un metabolito con actividad estrogénica. En el presente trabajo se propuso como objetivo general evaluar si el ingreso a la célula de esteroides sulfatados a través de transportadores y su metabolización intracelular está alterado en endometrio de mujeres con PCOS. Además, establecer si esto genera altas concentraciones intracelulares de esteroides que permitan el incremento del proceso de proliferación celular. Para ello, se propuso dos modelos, uno ex vivo y un modelo in vitro con células de la línea T-HESC, St-T1b y células endometriales obtenidas desde cultivo primario. Para el primer objetivo específico se determinó que existe un incremento de los niveles de androstenediol en PCOSE al compararlo con controles (CE) (p=0,002). Además, se evaluó la actividad de la enzima 3β-hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSD) en los tejidos en estudio, no detectándose diferencias significativas. En el segundo objetivo específico se analizó la expresión y actividad de los transportadores OATP-B, D y E, y OAT4 en el modelo ex vivo e in vitro, por western blot, RT-PCR convencional y ensayo de captación de DHEAS. En el modelo in vitro se utilizó estímulos con androstenediol, testosterona y estradiol. Se determinó que los niveles proteicos de los transportadores OATP-B y OATP-E están incrementados en PCOSE versus CE (p=0,049 y p=0,007, respectivamente). Los ensayos in vitro de la actividad de transportadores nos permitieron determinar que existe un menor ingreso de DHEAS en células estimuladas con testosterona (p=0,02). Los niveles proteicos de OATP-E se ven disminuidos con los estímulos de androstenediol y testosterona (p=0,04 y p=0,04, respectivamente). El tercer objetivo tenía la finalidad de determinar si altas concentraciones de esteroides (androstenediol, testosterona y estradiol) por 48 h modifican los procesos de proliferación celular en células de la línea T-HESC y St-T1b. Para esto se utilizó las técnicas de western blot, inmunocitoquímica y citometría de flujo. Se determinó que estímulos con estradiol y androstenediol incrementan los niveles de ciclina D1 (p<0,05) y disminuyen los niveles del represor de ciclo celular p27 (p<0,05); además, androstenediol aumenta el porcentaje de núcleos positivos a Ki67 en células St-T1b (p=0,05). Por otro lado, el estímulo con testosterona por 48 h disminuye los niveles de Ki67 y de ciclina D1, e incrementa los de p27 (p<0,05). Sin embargo, estos estímulos no modifican el porcentaje de células en las distintas fases del ciclo celular, evaluado por citometría de flujo. Finalmente, con el cuarto objetivo se evaluó los posibles mecanismos involucrados que generarían los cambios en las moléculas reguladoras del ciclo celular dadas en el modelo in vitro. Para eso, mediante la técnica de western blot, se evaluó las vías de MAPK (ERK1/2) y PI3K/Akt, además se utilizó inhibidores de estas vías, antagonistas de receptores de estrógenos y andrógenos, y un inhibidor de RNA polimerasa II. Se determinó que androstenediol es capaz de incrementar los niveles de fosforilación de ERK1/2 y de Akt con los estímulos de 48 h (p<0,05), pero no así con estímulos de 20 min. Por otro lado, testosterona por 48 h disminuye la activación de la vía PI3K-Akt (p<0,05). La utilización de antagonistas de receptores de estrógenos (ICI 182,780 y MPP dihidrocloruro), nos permitió determinar que el efecto sobre p27 y ciclina D1 sería a través del receptor de estrógenos (ER) α (p<0,05). Adicionalmente, los cambios en las fosforilaciones desaparecen cuando está presente un inhibidor de la RNA polimerasa II (α-amanitina) (p<0,05), por lo que probablemente requiere de la transcripción de alguna o algunas proteína/s que permitan los cambios observados en los reguladores del ciclo celular. Para determinar si se requiere las vías de PI3K/Akt ó MAPK (ERK1/2), se utilizó inhibidores de PI3K (LY-194,002) y MEK1/2 (U-0126). La presencia de LY-194,002 inhibe los cambios dados por androstenediol en ciclina D1 y p27 (p<0,05), mientras que U-0126 evita solo el incremento de ciclina D1 dado por androstenediol (p<0,05). Por lo tanto, la fosforilación de Akt sería relevante para la modulación de ambas vías reguladoras del ciclo, mientras que la fosforilación de ERK1/2 sería necesaria solo para ciclina D1. El presente trabajo propone diversas metodologías para caracterizar a través de qué mecanismo se genera el incremento en la proliferación celular presente en PCOSE y el rol que tiene la intracrinología en estas alteraciones, donde androstenediol tendría un rol relevante. Los resultados obtenidos en los estudios in vitro nos permiten concluir que androstenediol potenciaría la proliferación celular, actuando como un estrógeno en nuestro modelo, a través del ER α, y que río abajo se activen las vías de MAPK (ERK1/2) y PI3K-Akt. Esto explicaría, en parte, la desregulación del proceso proliferativo ocurrido en PCOSE y la fisiopatología de la hiperplasia y adenocarcinoma endometrial de alta prevalencia en las mujeres con este síndrome / The endometrium is a tissue that requires the action of steroids for its adequate function; therefore, pathologies altering the concentration of steroids induced endometrial physiology failures, as seen in polycystic ovary syndrome (PCOS). Previous reports have indicated that the endometrium of women with PCOS (PCOSE) show increased cell proliferation processes, characterized by high levels of cyclin D1 protein, Ki67 and p27 decreased. In this context, it is known that estrogens enhance proliferation of endometrial tissue. The intratisular steroid metabolism (intracrine) from precursors such as DHEAS could convert into steroids with oestrogenic and/or androgenic activity. This requires sulfated precursors entering the cells through transporters OATs and OATPs families. Furthermore, expression and activity of steroid metabolizing enzymes is needed. We have previously reported in PCOSE an increased DHEA metabolism to androstenediol, a metabolite with estrogenic activity. In this work, it was proposed as a general objective to evaluate whether DHEAS entry the cell via sulfated steroid transporters and if intracellular metabolism is altered in the endometrium of women with PCOS. Furthermore, to establish whether this generates high intracellular concentrations of steroids that could allow the increased in the cell proliferation process. To achieve this, we proposed two models, an ex vivo and an in vitro cell line model of T-HESC and St-T1b and also, endometrial cells obtained from primary cultures. The results of the first specific objective show a significative increase in PCOSE androstenediol levels compared to controls (EC) (p=0.002). Moreover, no significant differences were detected in the activity of the enzyme 3β-HSD in the tissues under study. In the second objective, the expression and activity of transporters OATP-B, D and E, and OAT4 was tested in the model ex vivo and in vitro, western blot, RT-PCR and conventional DHEAS uptake assay. In the in vitro model, stimuli with androstenediol, testosterone and estradiol were used. It was determined that the protein levels of the transporters OATP-B and OATP-E are increased in CE versus PCOSE (p=0.049 and p=0.007, respectively). In vitro activity of transporters assays allowed us to determine that there is less uptake of DHEAS in testosterone stimulated cells (p=0.02). Protein levels of OATP-E are diminished with androstenediol and stimuli of testosterone (p=0.04 and p=0.04, respectively). The third objective aimed to determine whether high levels of steroid (androstenediol, testosterone and estradiol) for 48 h modified the cell proliferation process in T-HESC and St-T1b cell lines. To achieve this purpose, western blot, immunocytochemistry and flow cytometry techniques were used. It was determined that estradiol and androstenediol stimuli increase levels of cyclin D1 (p<0.05) and lower levels of the cell cycle repressor p27 (p<0.05); additionally, androstenediol increases the percentage of positive nuclei for Ki67 in St-T1b cells (p=0.05). On the other hand, stimulation with testosterone for 48 h affected negatively the levels of Ki67 and Cyclin D1 and positively p27 levels (p<0.05). However, these stimuli do not modify the percentage of cells in the different phases of the cell cycle assessed by flow cytometry. Finally, the fourth objective evaluated some possible mechanisms involved in changes in cell cycle regulatory molecules given in the in vitro model. For this, MAPK (ERK1/2) and PI3K/Akt levels and activity were evaluated by Western blotting. We used inhibitors of these pathways, estrogens and androgens receptors antagonists, and an inhibitor of RNA polymerase II. Androstenediol was able to increase the levels of ERK1/2 and Akt phosphorylation with the stimulus of 48 h (p<0.05), but not with stimuli of 20 min. Moreover, 48 h-testosterone stimulation decreased the activation of the PI3K-Akt (p<0.05) pathway. The use of estrogen receptor antagonists (ICI 182,780 and MPP dihidrocloruro), allowed us to determine that the effect on p27 and cyclin D1 would be through the estrogen receptor α (p<0.05). Additionally, those changes in phosphorylation disappeared when an inhibitor of RNA polymerase II (α-amanitin) was used (p<0.05). These data indicate requirement of transcription or some protein/s that allow the observed changes in cell cycle regulators. To determine whether PI3K/Akt or MAPK (ERK1/2) is required, PI3K (LY-194.002) and MEK1/2 (U-0126) inhibitors were used. The presence of LY-194.002 inhibits changes given by androstenediol in cyclin D1 and p27 (p<0.05), while U-0126 only prevents the increase of cyclin D1 given androstenediol (p<0.05). Therefore, the phosphorylation of Akt could be relevant for both modulation cycle regulatory pathways, while phosphorylation of ERK1/2 would be required only for cyclin D1. This paper proposes several methods to characterize the mechanism involved in the increased cell proliferation observed in PCOSE, where intracrinology has a role in these alterations, particularly androstenediol could have a significant role. The results obtained in the in vitro studies allow us to conclude that androstenediol could enhance cell proliferation, acting as an estrogen in our model, through estrogen receptor α, where MAPK (ERK1/2) and PI3K-Akt pathways are activated. This could explain, in part, the deregulation occurred in PCOSE proliferative process and the pathophysiology of high prevalence of endometrial hyperplasia and adenocarcinoma in women with this pathology / Conicyt Fondecyt