A fibrose e a cirrose hepática são doenças crônicas do fígado que representam uma das maiores causas de mortalidade humana. A GRX é uma linhagem representativa das células estreladas hepáticas (HSC), que estão associadas ao desenvolvimento da fibrose que, em último estágio, acarreta em cirrose. No fígado saudável, estas células apresentam um fenótipo quiescente ou lipocítico, caracterizado pela sua capacidade de armazenar gotas lipídicas. Danos contínuos ao fígado desencadeiam uma resposta que gera estímulos autócrinos e parácrinos mediados por citocinas e espécies reativas de oxigênio. Este quadro leva a uma modulação destas células ao fenótipo ativado ou miofibroblástico, relacionada com um aumento da capacidade de produzir componentes de matriz extracelular, cuja deposição exagerada configura o estado patológico da fibrose. O resveratrol (RSV - 3,4',5-tri-hidroxi-trans-estilbeno) é uma fitoalexina produzida por algumas espécies de plantas, ao qual são atribuídos inúmeros efeitos benéficos devido a sua capacidade antioxidante, antiproliferativa e pró-apoptótica.Recentemente, tem se discutido um possível efeito pró-oxidante desta molécula em alguns sistemas celulares. O presente estudo mostra que a dose de 50 μM de RSV induziu uma diminuição da viabilidade e da proliferação celular nas células GRX devido a um efeito pró-oxidante observado nas primeiras 24 horas de tratamento. Essas alterações foram atenuadas ao longo de 120 horas de exposição. Observamos um aumento da atividade da superóxido dismutase (SOD) e uma diminuição da atividade da catalase (CAT) no grupo que recebeu 50 μM de RSV em 120 horas de tratamento, que resulta em um desequilíbrio na atividade de ambas enzimas e possivelmente gera uma produção alta de H2O2. As células que receberam 50 μM de RSV apresentaram dano mediado por lipoperoxidação, tanto em 24 horas quanto em 120 horas de exposição, embora este parâmetro tenha sido menor no modelo crônico. De maneira complementar, avaliamos os efeitos do RSV sobre os parâmetros de migração das células GRX. Observamos um aumento na capacidade de migração destas células já nas primeiras 8 horas de exposição às doses de 1, 10 e 50 μM de RSV. Estes resultados mostraram que o RSV induz um aumento de migração e uma adaptação das células GRX que sobrevivem ao choque tóxico das primeiras 24 horas. / Fibrosis and hepatic cirrosis are chronic diseases of the liver, standing for one of the highest causes of human mortality. GRX cell line is representative of hepatic stellate cells (HSC) that are associated to fibrosis development which, at its last stage, turns into cirrosis. In a healthy liver, such cells present a quiescent or lipocytic phenotype, characterized by its capacity to store lipid droplets. Continuous injuries to the liver generate autocrine and paracrine stimuli mediated by cytokines and reactive oxygen species (ROS). This may cause modulation to the activated or myofibroblastic phenotype, related to an increase of cells capacity to produce matrix components which excessive deposition is responsible for the pathologic condition of fibrosis. Resveratrol (RSV - 3,4',5-tri-hidroxi-trans-stilbeno) is a phytoalexin produced by some species of plants. Several beneficial effects are attributed to this molecule due to its antioxidant, antiproliferative and pro-apoptotic capacity. Recently, a possible pro-oxidant effect of this molecule in some cell systems has been put into discussion. The present study shows that 50 μM of RSV induced a decreased cell viability and proliferation of GRX cells due a pro-oxidant effect during the first 24 hours of treatment. These alterations were attenuated during 120 hours of exposure. We observed an increased SOD activity as well as a decreased CAT activity, in the 50 μM RSV-treated group at 120 hours of treatment, leading to an imbalance in the ratio of both enzymes activities, and possibly resulting in an over-production of H2O2. The cells that received 50 μM RSV presented oxidative damage, mediated by lipoperoxidation, at 24 hours as well as at 120 hours, although some of these parameters were smaller in the chronic model. Additionally, we evaluated RSV effects on the GRX cell migration. We observed an increase in the migration capacity of these cells during the first 8 hours of exposition to the 1, 10 and 50 μM RSV. Such results demonstrate that RSV induces migration increase as well as an adaptation of GRX cells which survive the first 24-hour toxic shock.

A fibrose e a cirrose hepática são doenças crônicas do fígado que representam uma das maiores causas de mortalidade humana. A GRX é uma linhagem representativa das células estreladas hepáticas (HSC), que estão associadas ao desenvolvimento da fibrose que, em último estágio, acarreta em cirrose. No fígado saudável, estas células apresentam um fenótipo quiescente ou lipocítico, caracterizado pela sua capacidade de armazenar gotas lipídicas. Danos contínuos ao fígado desencadeiam uma resposta que gera estímulos autócrinos e parácrinos mediados por citocinas e espécies reativas de oxigênio. Este quadro leva a uma modulação destas células ao fenótipo ativado ou miofibroblástico, relacionada com um aumento da capacidade de produzir componentes de matriz extracelular, cuja deposição exagerada configura o estado patológico da fibrose. O resveratrol (RSV - 3,4',5-tri-hidroxi-trans-estilbeno) é uma fitoalexina produzida por algumas espécies de plantas, ao qual são atribuídos inúmeros efeitos benéficos devido a sua capacidade antioxidante, antiproliferativa e pró-apoptótica.Recentemente, tem se discutido um possível efeito pró-oxidante desta molécula em alguns sistemas celulares. O presente estudo mostra que a dose de 50 μM de RSV induziu uma diminuição da viabilidade e da proliferação celular nas células GRX devido a um efeito pró-oxidante observado nas primeiras 24 horas de tratamento. Essas alterações foram atenuadas ao longo de 120 horas de exposição. Observamos um aumento da atividade da superóxido dismutase (SOD) e uma diminuição da atividade da catalase (CAT) no grupo que recebeu 50 μM de RSV em 120 horas de tratamento, que resulta em um desequilíbrio na atividade de ambas enzimas e possivelmente gera uma produção alta de H2O2. As células que receberam 50 μM de RSV apresentaram dano mediado por lipoperoxidação, tanto em 24 horas quanto em 120 horas de exposição, embora este parâmetro tenha sido menor no modelo crônico. De maneira complementar, avaliamos os efeitos do RSV sobre os parâmetros de migração das células GRX. Observamos um aumento na capacidade de migração destas células já nas primeiras 8 horas de exposição às doses de 1, 10 e 50 μM de RSV. Estes resultados mostraram que o RSV induz um aumento de migração e uma adaptação das células GRX que sobrevivem ao choque tóxico das primeiras 24 horas. / Fibrosis and hepatic cirrosis are chronic diseases of the liver, standing for one of the highest causes of human mortality. GRX cell line is representative of hepatic stellate cells (HSC) that are associated to fibrosis development which, at its last stage, turns into cirrosis. In a healthy liver, such cells present a quiescent or lipocytic phenotype, characterized by its capacity to store lipid droplets. Continuous injuries to the liver generate autocrine and paracrine stimuli mediated by cytokines and reactive oxygen species (ROS). This may cause modulation to the activated or myofibroblastic phenotype, related to an increase of cells capacity to produce matrix components which excessive deposition is responsible for the pathologic condition of fibrosis. Resveratrol (RSV - 3,4',5-tri-hidroxi-trans-stilbeno) is a phytoalexin produced by some species of plants. Several beneficial effects are attributed to this molecule due to its antioxidant, antiproliferative and pro-apoptotic capacity. Recently, a possible pro-oxidant effect of this molecule in some cell systems has been put into discussion. The present study shows that 50 μM of RSV induced a decreased cell viability and proliferation of GRX cells due a pro-oxidant effect during the first 24 hours of treatment. These alterations were attenuated during 120 hours of exposure. We observed an increased SOD activity as well as a decreased CAT activity, in the 50 μM RSV-treated group at 120 hours of treatment, leading to an imbalance in the ratio of both enzymes activities, and possibly resulting in an over-production of H2O2. The cells that received 50 μM RSV presented oxidative damage, mediated by lipoperoxidation, at 24 hours as well as at 120 hours, although some of these parameters were smaller in the chronic model. Additionally, we evaluated RSV effects on the GRX cell migration. We observed an increase in the migration capacity of these cells during the first 8 hours of exposition to the 1, 10 and 50 μM RSV. Such results demonstrate that RSV induces migration increase as well as an adaptation of GRX cells which survive the first 24-hour toxic shock.

A fibrose hepática é uma característica comum de diversas doenças crônicas do fígado e é caracterizada pela deposição excessiva de matriz extracelular no órgão. Em última instância, essa alteração anormal do parênquima hepático acarreta em hipertensão portal, cirrose e insuficiência do fígado, o que pode levar o paciente à morte. As células estreladas hepáticas (HSC) participam ativamente deste processo, modificando seu fenótipo quiescente, rico em gotas lipídicas no citoplasma, para o fenótipo ativado, em resposta a um insulto hepático. A linhagem GRX é um modelo de HSC ativadas. As caveolas são pequenas invaginações de 50-100 nm da membrana plasmática que são ricas em glicoesfingolipídeos, colesterol e proteínas GPI ancoradas. Elas são caracterizadas pela presença de caveolina, uma proteína estrutural específica desta organela. Estas pequenas organelas, consideradas especializações dos “rafts” lipídicos, estão presentes nos mais diversos tipos celulares e podem funcionar como plataformas onde se ancoram várias proteínas de membrana. Estas proteínas reconhecem sinais externos e transmitem sinais moduladores da atividade celular, regulando ou facilitando o transporte de ácidos graxos e de lipídeos, e também são responsáveis pelo transporte de vesículas de membrana. As caveolinas são as principais proteínas estruturais das caveolas, sendo a caveolina-1 (Cav-1) a mais importante. A Cav-1 é encontrada em todos os tipos celulares e está relacionada com a transformação oncogênica e tumorogênese. Estudos já mostraram a interação entre as caveolas e os filamentos de actina, os microtúbulos, e os filamentos intermediários. Em fígados cirróticos foi encontrado um aumento da expressão de Cav-1 nas células endoteliais sinusoidais e nas HSC. Em trabalho anterior, utilizamos o plasmídeo pCav1EGFP para a obtenção de uma linhagem permanente que superexpressa a Cav-1 e a proteína EFGP, a GRXEGFP-Cav. Neste trabalho, nós caracterizamos, bioquímica e morfologicamente, essa linhagem e realizamos outra transfecção com o plasmídeo vazio pCineoEGFP para estabelecer uma linhagem controle, a GRXEGFPpCineo . Através de métodos de análise bioquímica, de imunocitoquímica, de citometria de fluxo e de microscopia confocal e eletrônica de transmissão, mostramos que a superexpressão de Cav-1, aumentou a proliferação e a adesão celular, alterou a morfologia e a estrutura do citoesqueleto das células, a capacidade de migração e de endocitose da GRXEGFP-Cav. A análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão revelou o aumento do número de caveolas na membrana plasmática. As alterações do citoesqueleto de actina e o aumento da afinidade célula-célula são indicativos de maior mobilidade celular. Esses resultados somados ao aumento do conteúdo de αSMA e Col-I sugerem a modulação da GRXEGFP-Cav para um fenótipo de miofibroblasto ativado característico de situações de dano hepático. Como a distribuição e a significância da expressão de Cav-1 em fígados normais e cirróticos são pouco conhecidas, e considerando o papel das HSC nas doenças hepáticas, entendemos que a linhagem permanente GRXEGFP-Cav pode ser uma ferramenta experimental muito interessante para o estudo destas patologias. / Liver fibrosis is a common feature of several chronic hepatic diseases and is characterized by the excessive deposition of extracellular matrix in the organ. Usually, this abnormal change of the hepatic parenchyma causes portal hypertension, cirrhosis and liver failure, which can lead to the patient death. Hepatic stellate cells (HSC) participate actively in this process through modifying their quiescent phenotype rich in lipid droplets in the cytoplasm to the activated phenotype in response to the liver injury. GRX line is a model of activated HSC. The caveolae are small invaginations of plasma membrane that reaches 50-100nm of size, rich in glycosphingolipids, cholesterol, and GPI-anchored proteins. These organelles are characterized by the presence of caveolin, a structural and specific protein. These small organelles, which are considered specializations of lipid "rafts" and can be present in several cell types, can act as anchoring platforms for several membrane proteins. These proteins recognize external signals and transmit these signals to modulate the cell activity through regulating or facilitating the transport of fatty acids and lipids, being also responsible for the transport of membrane vesicles. Caveolins are the main structural proteins of caveolae and caveolin-1 (Cav-1) is the most important. Cav-1 is found in all cell types and is related to the oncogenic transformation and tumorigenesis. Previous studies have shown the interaction among caveolae, actin filaments, microtubules, and intermediate filaments. Also, it was found an increase of Cav-1 expression in sinusoidal endothelial cells and HSC of cirrhotic livers, which was suggested to be related to the portal hypertension that accompanies the process of fibrosis. In a previous work, we used the pCav1EGFP plasmid to obtain a permanent cell strain that overexpresses Cav-1 protein and EFGP, which was named GRXEGFP-Cav. In this work we biochemical and morphologically characterized this strain. We also did another cell transfection with an empty pCineoEGFP plasmid to establish a permanent control cell line, which was named GRXEGFPpCineo. Through biochemical analysis, immunocytochemistry, flow cytometry, confocal and electron transmission microscopy, we showed that Cav-1overexpression increased cell proliferation and adhesion, changed cell morphology and cytoskeleton structure, and the cell migration and endocytosis capacity of GRXEGFP-Cav. The actin cytoskeletal changes and the increased cell-cell affinity are indicative of greater cell motility. These results associated to the increase of αSMA and Col-I contents suggest the GRXEGFP-Cav modulation be the activated myofibroblast that characterizes liver damage. As the distribution and the significance of Cav-1 expression in normal and cirrhotic livers are little known and considering the role of HSC in liver diseases, we believe that the permanent GRXEGFP-Cav line can be a very interesting experimental tool for the study of these pathologies.

A fibrose hepática é uma característica comum de diversas doenças crônicas do fígado e é caracterizada pela deposição excessiva de matriz extracelular no órgão. Em última instância, essa alteração anormal do parênquima hepático acarreta em hipertensão portal, cirrose e insuficiência do fígado, o que pode levar o paciente à morte. As células estreladas hepáticas (HSC) participam ativamente deste processo, modificando seu fenótipo quiescente, rico em gotas lipídicas no citoplasma, para o fenótipo ativado, em resposta a um insulto hepático. A linhagem GRX é um modelo de HSC ativadas. As caveolas são pequenas invaginações de 50-100 nm da membrana plasmática que são ricas em glicoesfingolipídeos, colesterol e proteínas GPI ancoradas. Elas são caracterizadas pela presença de caveolina, uma proteína estrutural específica desta organela. Estas pequenas organelas, consideradas especializações dos “rafts” lipídicos, estão presentes nos mais diversos tipos celulares e podem funcionar como plataformas onde se ancoram várias proteínas de membrana. Estas proteínas reconhecem sinais externos e transmitem sinais moduladores da atividade celular, regulando ou facilitando o transporte de ácidos graxos e de lipídeos, e também são responsáveis pelo transporte de vesículas de membrana. As caveolinas são as principais proteínas estruturais das caveolas, sendo a caveolina-1 (Cav-1) a mais importante. A Cav-1 é encontrada em todos os tipos celulares e está relacionada com a transformação oncogênica e tumorogênese. Estudos já mostraram a interação entre as caveolas e os filamentos de actina, os microtúbulos, e os filamentos intermediários. Em fígados cirróticos foi encontrado um aumento da expressão de Cav-1 nas células endoteliais sinusoidais e nas HSC. Em trabalho anterior, utilizamos o plasmídeo pCav1EGFP para a obtenção de uma linhagem permanente que superexpressa a Cav-1 e a proteína EFGP, a GRXEGFP-Cav. Neste trabalho, nós caracterizamos, bioquímica e morfologicamente, essa linhagem e realizamos outra transfecção com o plasmídeo vazio pCineoEGFP para estabelecer uma linhagem controle, a GRXEGFPpCineo . Através de métodos de análise bioquímica, de imunocitoquímica, de citometria de fluxo e de microscopia confocal e eletrônica de transmissão, mostramos que a superexpressão de Cav-1, aumentou a proliferação e a adesão celular, alterou a morfologia e a estrutura do citoesqueleto das células, a capacidade de migração e de endocitose da GRXEGFP-Cav. A análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão revelou o aumento do número de caveolas na membrana plasmática. As alterações do citoesqueleto de actina e o aumento da afinidade célula-célula são indicativos de maior mobilidade celular. Esses resultados somados ao aumento do conteúdo de αSMA e Col-I sugerem a modulação da GRXEGFP-Cav para um fenótipo de miofibroblasto ativado característico de situações de dano hepático. Como a distribuição e a significância da expressão de Cav-1 em fígados normais e cirróticos são pouco conhecidas, e considerando o papel das HSC nas doenças hepáticas, entendemos que a linhagem permanente GRXEGFP-Cav pode ser uma ferramenta experimental muito interessante para o estudo destas patologias. / Liver fibrosis is a common feature of several chronic hepatic diseases and is characterized by the excessive deposition of extracellular matrix in the organ. Usually, this abnormal change of the hepatic parenchyma causes portal hypertension, cirrhosis and liver failure, which can lead to the patient death. Hepatic stellate cells (HSC) participate actively in this process through modifying their quiescent phenotype rich in lipid droplets in the cytoplasm to the activated phenotype in response to the liver injury. GRX line is a model of activated HSC. The caveolae are small invaginations of plasma membrane that reaches 50-100nm of size, rich in glycosphingolipids, cholesterol, and GPI-anchored proteins. These organelles are characterized by the presence of caveolin, a structural and specific protein. These small organelles, which are considered specializations of lipid "rafts" and can be present in several cell types, can act as anchoring platforms for several membrane proteins. These proteins recognize external signals and transmit these signals to modulate the cell activity through regulating or facilitating the transport of fatty acids and lipids, being also responsible for the transport of membrane vesicles. Caveolins are the main structural proteins of caveolae and caveolin-1 (Cav-1) is the most important. Cav-1 is found in all cell types and is related to the oncogenic transformation and tumorigenesis. Previous studies have shown the interaction among caveolae, actin filaments, microtubules, and intermediate filaments. Also, it was found an increase of Cav-1 expression in sinusoidal endothelial cells and HSC of cirrhotic livers, which was suggested to be related to the portal hypertension that accompanies the process of fibrosis. In a previous work, we used the pCav1EGFP plasmid to obtain a permanent cell strain that overexpresses Cav-1 protein and EFGP, which was named GRXEGFP-Cav. In this work we biochemical and morphologically characterized this strain. We also did another cell transfection with an empty pCineoEGFP plasmid to establish a permanent control cell line, which was named GRXEGFPpCineo. Through biochemical analysis, immunocytochemistry, flow cytometry, confocal and electron transmission microscopy, we showed that Cav-1overexpression increased cell proliferation and adhesion, changed cell morphology and cytoskeleton structure, and the cell migration and endocytosis capacity of GRXEGFP-Cav. The actin cytoskeletal changes and the increased cell-cell affinity are indicative of greater cell motility. These results associated to the increase of αSMA and Col-I contents suggest the GRXEGFP-Cav modulation be the activated myofibroblast that characterizes liver damage. As the distribution and the significance of Cav-1 expression in normal and cirrhotic livers are little known and considering the role of HSC in liver diseases, we believe that the permanent GRXEGFP-Cav line can be a very interesting experimental tool for the study of these pathologies.

A fibrose hepática é uma característica comum de diversas doenças crônicas do fígado e é caracterizada pela deposição excessiva de matriz extracelular no órgão. Em última instância, essa alteração anormal do parênquima hepático acarreta em hipertensão portal, cirrose e insuficiência do fígado, o que pode levar o paciente à morte. As células estreladas hepáticas (HSC) participam ativamente deste processo, modificando seu fenótipo quiescente, rico em gotas lipídicas no citoplasma, para o fenótipo ativado, em resposta a um insulto hepático. A linhagem GRX é um modelo de HSC ativadas. As caveolas são pequenas invaginações de 50-100 nm da membrana plasmática que são ricas em glicoesfingolipídeos, colesterol e proteínas GPI ancoradas. Elas são caracterizadas pela presença de caveolina, uma proteína estrutural específica desta organela. Estas pequenas organelas, consideradas especializações dos “rafts” lipídicos, estão presentes nos mais diversos tipos celulares e podem funcionar como plataformas onde se ancoram várias proteínas de membrana. Estas proteínas reconhecem sinais externos e transmitem sinais moduladores da atividade celular, regulando ou facilitando o transporte de ácidos graxos e de lipídeos, e também são responsáveis pelo transporte de vesículas de membrana. As caveolinas são as principais proteínas estruturais das caveolas, sendo a caveolina-1 (Cav-1) a mais importante. A Cav-1 é encontrada em todos os tipos celulares e está relacionada com a transformação oncogênica e tumorogênese. Estudos já mostraram a interação entre as caveolas e os filamentos de actina, os microtúbulos, e os filamentos intermediários. Em fígados cirróticos foi encontrado um aumento da expressão de Cav-1 nas células endoteliais sinusoidais e nas HSC. Em trabalho anterior, utilizamos o plasmídeo pCav1EGFP para a obtenção de uma linhagem permanente que superexpressa a Cav-1 e a proteína EFGP, a GRXEGFP-Cav. Neste trabalho, nós caracterizamos, bioquímica e morfologicamente, essa linhagem e realizamos outra transfecção com o plasmídeo vazio pCineoEGFP para estabelecer uma linhagem controle, a GRXEGFPpCineo . Através de métodos de análise bioquímica, de imunocitoquímica, de citometria de fluxo e de microscopia confocal e eletrônica de transmissão, mostramos que a superexpressão de Cav-1, aumentou a proliferação e a adesão celular, alterou a morfologia e a estrutura do citoesqueleto das células, a capacidade de migração e de endocitose da GRXEGFP-Cav. A análise ultraestrutural por microscopia eletrônica de transmissão revelou o aumento do número de caveolas na membrana plasmática. As alterações do citoesqueleto de actina e o aumento da afinidade célula-célula são indicativos de maior mobilidade celular. Esses resultados somados ao aumento do conteúdo de αSMA e Col-I sugerem a modulação da GRXEGFP-Cav para um fenótipo de miofibroblasto ativado característico de situações de dano hepático. Como a distribuição e a significância da expressão de Cav-1 em fígados normais e cirróticos são pouco conhecidas, e considerando o papel das HSC nas doenças hepáticas, entendemos que a linhagem permanente GRXEGFP-Cav pode ser uma ferramenta experimental muito interessante para o estudo destas patologias. / Liver fibrosis is a common feature of several chronic hepatic diseases and is characterized by the excessive deposition of extracellular matrix in the organ. Usually, this abnormal change of the hepatic parenchyma causes portal hypertension, cirrhosis and liver failure, which can lead to the patient death. Hepatic stellate cells (HSC) participate actively in this process through modifying their quiescent phenotype rich in lipid droplets in the cytoplasm to the activated phenotype in response to the liver injury. GRX line is a model of activated HSC. The caveolae are small invaginations of plasma membrane that reaches 50-100nm of size, rich in glycosphingolipids, cholesterol, and GPI-anchored proteins. These organelles are characterized by the presence of caveolin, a structural and specific protein. These small organelles, which are considered specializations of lipid "rafts" and can be present in several cell types, can act as anchoring platforms for several membrane proteins. These proteins recognize external signals and transmit these signals to modulate the cell activity through regulating or facilitating the transport of fatty acids and lipids, being also responsible for the transport of membrane vesicles. Caveolins are the main structural proteins of caveolae and caveolin-1 (Cav-1) is the most important. Cav-1 is found in all cell types and is related to the oncogenic transformation and tumorigenesis. Previous studies have shown the interaction among caveolae, actin filaments, microtubules, and intermediate filaments. Also, it was found an increase of Cav-1 expression in sinusoidal endothelial cells and HSC of cirrhotic livers, which was suggested to be related to the portal hypertension that accompanies the process of fibrosis. In a previous work, we used the pCav1EGFP plasmid to obtain a permanent cell strain that overexpresses Cav-1 protein and EFGP, which was named GRXEGFP-Cav. In this work we biochemical and morphologically characterized this strain. We also did another cell transfection with an empty pCineoEGFP plasmid to establish a permanent control cell line, which was named GRXEGFPpCineo. Through biochemical analysis, immunocytochemistry, flow cytometry, confocal and electron transmission microscopy, we showed that Cav-1overexpression increased cell proliferation and adhesion, changed cell morphology and cytoskeleton structure, and the cell migration and endocytosis capacity of GRXEGFP-Cav. The actin cytoskeletal changes and the increased cell-cell affinity are indicative of greater cell motility. These results associated to the increase of αSMA and Col-I contents suggest the GRXEGFP-Cav modulation be the activated myofibroblast that characterizes liver damage. As the distribution and the significance of Cav-1 expression in normal and cirrhotic livers are little known and considering the role of HSC in liver diseases, we believe that the permanent GRXEGFP-Cav line can be a very interesting experimental tool for the study of these pathologies.

Submitted by PPG Biologia Celular e Molecular (bcm@pucrs.br) on 2017-08-15T12:27:16Z No. of bitstreams: 1 BRUNO_DE_SOUZA_BASSO_DIS.pdf: 1709254 bytes, checksum: 167b84b794ff4ea4955b2ef79229ab4e (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-08-16T13:04:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 BRUNO_DE_SOUZA_BASSO_DIS.pdf: 1709254 bytes, checksum: 167b84b794ff4ea4955b2ef79229ab4e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-16T13:39:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 BRUNO_DE_SOUZA_BASSO_DIS.pdf: 1709254 bytes, checksum: 167b84b794ff4ea4955b2ef79229ab4e (MD5) Previous issue date: 2017-03-03 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The genus Baccharis belongs to the family Asteraceae and has several species widely used in folk medicine and own many compounds of pharmaceutical interest. The aim of this work was to evaluate the cytotoxic, antiproliferative effect and phenotypic reversion of Baccharis anomala extract on activated hepatic stellate cells (HSCs) and identify the compounds present in the extract. In order to evaluate the cytotoxic and antiproliferative effect of the fractionated extract, lactate dehydrogenase (LDH) release and the trypan blue exclusion method were used. The phenotype reversion was evaluated by staining with Oil Red and PPAR-? expression by RT-PCR. The fractions obtained from the methanolic extract were characterized for their phenolic composition by HPLC. The results showed that two fractions of methanolic extract decreased cell proliferation without increasing LDH release levels. Cell cycle arrest was evaluated using 7-AAD and DAPI staining was used to evaluate indications of apoptosis. Fractions of B.anomala induced cell cycle arrest in G1 phase, while DAPI staining did not reveal cell death by apoptosis. Oil-Red (ORO) staining showed the ability of fractions to induce phenotypic reversion and the evaluation of PPAR-? mRNA expression was not altered, suggesting that there is an independent PPAR-? pathway involved. The main components identified in the fractions that presented biological activity were hydroxybenzoic, chlorogenic and coumaric acid. Our study was able to show the antiproliferative effect of methanolic extract fractions of B.anomala, its potential to reverse the activated phenotype of hepatic stellate cells and showed its potential for the treatment of liver fibrosis. / O g?nero Baccharis pertence ? fam?lia Asteraceae e tem v?rias esp?cies amplamente utilizadas na medicina popular, possuindo muitos compostos de interesse farmac?utico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito citot?xico, antiproliferativo e a revers?o fenot?pica do extrato de Baccharis anomala em c?lulas estreladas hep?ticas ativadas (HSCs) e identificar os compostos presentes no extrato. Para avaliar o efeito citot?xico e antiproliferativo do extrato fracionado, foram utilizadas a libera??o de lactato desidrogenase (LDH) e o m?todo de exclus?o de azul de Tripan. A revers?o do fen?tipo foi avaliada por colora??o com Oil Red e pela express?o de PPAR-? por RT-PCR. As fra??es obtidas a partir do extrato metan?lico foram caracterizadas pela sua composi??o fen?lica por HPLC. Os resultados mostraram que duas fra??es do extrato metan?lico diminu?ram a prolifera??o celular sem aumentar os n?veis de libera??o de LDH. A parada do ciclo celular foi avaliada usando 7-AAD e colora??o por DAPI foi utilizada para avaliar a apoptose celular. As fra??es de B.anomala induziram a parada do ciclo celular em fase G1, a colora??o por DAPI n?o revelou morte celular por apoptose. Colora??o por Oil-RedO (ORO) mostrou a capacidade de indu??o da revers?o fenot?pica, a avalia??o da express?o mRNA de PPAR-y por RT-PCR n?o foi alterada, sugerindo que exista uma via independente de PPAR-y envolvida. Os principais componentes identificados nas fra??es que apresentaram atividade biol?gica foram os ?cidos hidroxibenz?ico, clorog?nico e cum?rico. Nosso estudo foi capaz de mostrar o efeito antiproliferativo das fra??es de extrato metan?lico de B.anomala, seu potencial para reverter o fen?tipo ativado das c?lulas estreladas hep?ticas e mostrou seu potencial para o tratamento da fibrose hep?tica.

O objetivo principal deste trabalho é o estudo das funções univalentes e de suas propriedades. Este estudo é direcionado principalmente aos polinômios univalentes e à investigação de prolemas extremos envolvendo seus coeficientes, seus zeros e suas propriedades geométricas. Encontramos uma relação interessante entre os polinômios univalentes e os polinômios univalentes definida por Suffridge. Geramos várias funções univalentes estreladas e convexas através de suas propriedades geométricas e da localização de seus zeros. / The main aim of this work is the study of univalent functions and their properties. This study is focused speciall on the univalent polynomials and theinvestigation of extremal problems involving their coefficients, zeros and geometric properties. We find a very ineresting relation between univalent polynomials through a class of univalent starlike and convex functions involving their geometric properties and the location of their zeros.

Made available in DSpace on 2015-03-03T14:02:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JussaraMCM_Tese.pdf: 1097860 bytes, checksum: 122136921e4dddbf8d0e434cbbbd3653 (MD5) Previous issue date: 2009-12-03 / The activation of hepatic stellate cells (HSC) is considered the most important event in hepatic fibrogenesis. The precise mechanism of this process is unknown in autoimmune hepatitis (AIH), and more evidence is needed on the evolution of fibrosis. The aim of this study was to assess these aspects in children with type 1 AIH. We analyzed 16 liver biopsy samples from eight patients, paired before treatment and after clinical remission, performed an immunohistochemical study with anti-actin smooth muscle antibody and graded fibrosisand inflammation on a scale of 0:4 (Batts and Ludwig scoring system). We observedthere was no significant reduction in fibrosis scores after 24? 18 months (2.5 ? 0.93 vs. 2.0? 0.53, P = 0.2012). There was an important decrease in inflammation: portal (2.6 ?0.74 vs. 1.3? 0.89, P = 0.0277), periportal/periseptal (3.0 ?0.76 vs. 1.4 ? 1.06, P = 0.0277), and lobular (2.8 ? 1.04 vs. 0.9? 0.99, P =0.0179). Anti-actin smooth muscle antibodies were expressed in the HSC of the initial biopsies (3491.93 ?2051.48 lm2), showing a significant reduction after remission (377.91 ?439.47 lm2) (P = 0.0117). HSC activation was demonstrated in the AIH of children. The reduction of this activation after clinical remission, which may precede a decrease in fibrosis, opens important perspectives in the follow-up of AIH. / A ativa??o das c?lulas hep?ticas estreladas (CHE) ? considerada o evento mais importante na fibrog?nese hep?tica. Na hepatite autoimune (HAI) este mecanismo ? desconhecido e maiores evid?ncias s?o necess?rias quanto ? evolu??o da fibrose. O objetivo desse estudo foi avaliar a ativa??o das CHE e a evolu??o da fibrose hep?tica em crian?as portadoras de HAI tipo 1. Foram analisadas 16 bi?psias hep?ticas pareadas de oito pacientes, antes do tratamento e ap?s a remiss?o cl?nica atrav?s de estudo imuno-histoqu?mico com anticorpo anti-??-actina de m?sculo liso e realizada a grada??o da fibrose e da inflama??o empregando-se o sistema de escores de Batts e Ludwig (0-4). N?o houve significante redu??o nos escores de fibrose ap?s intervalo de tempo de 24? 18 meses entre as bi?psias (2,5 ? 0,93 vs. 2,0? 0,53, P = 0,2012). Observou-se redu??o significante na inflama??o: portal (2,6?0,74 vs. 1,3? 0,89, P = 0,0277), periportal/perisseptal (3,0 ?0,76 vs. 1,4 ? 1,06, P =0,0277) e lobular (2,8 ? 1,04 vs. 0,9? 0,99, P =0,0179). A -actina de m?sculo liso nas CHE foi expressa em bi?psias hep?ticas iniciais (3491,93 ?2051,48 ?m2) e mostrou significante redu??o ap?s a remiss?o cl?nica (377,91 ?439,47 ?m2) (P = 0,0117). A ativa??o de CHE foi demonstrada em crian?as portadoras de HAI tipo 1. A redu??o de sua ativa??o ap?s remiss?o cl?nica, a qual pode preceder a redu??o da fibrose, abre importantes perspectivas no follow-up da HAI

O objetivo principal deste trabalho é o estudo das funções univalentes e de suas propriedades. Este estudo é direcionado principalmente aos polinômios univalentes e à investigação de prolemas extremos envolvendo seus coeficientes, seus zeros e suas propriedades geométricas. Encontramos uma relação interessante entre os polinômios univalentes e os polinômios univalentes definida por Suffridge. Geramos várias funções univalentes estreladas e convexas através de suas propriedades geométricas e da localização de seus zeros. / The main aim of this work is the study of univalent functions and their properties. This study is focused speciall on the univalent polynomials and theinvestigation of extremal problems involving their coefficients, zeros and geometric properties. We find a very ineresting relation between univalent polynomials through a class of univalent starlike and convex functions involving their geometric properties and the location of their zeros.

A fibrose hepática resulta da cronicidade da injúria celular, ocasionando acúmulo dos componentes da matriz extracelular (MEC) pela ativação, principalmente, de células estreladas e fibroblastos portais em miofibroblastos. Estas células se conectam através de junções comunicantes do tipo gap, formadas por proteínas denominadas conexinas (Cx). As junções gap são responsáveis pelo fluxo de moléculas e íons entre as células, desempenhando importante função no controle da homeostasia tecidual. Diversos tipos de conexinas foram descritas nas células hepáticas. Os hepatócitos expressam Cx32 e Cx26, enquanto as demais células não-parenquimatosas expressam Cx43. Alguns estudos analisaram a expressão das conexinas e das junções gap em processos de reparação e fibrogênese em diferentes tecidos, no entanto, poucos avaliaram seu papel na fibrogênese hepática. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os aspectos morfológicos, histopatológicos e moleculares da fibrose hepática, induzida por tetracloreto de carbono (CCl4), em animais deficientes para as conexinas 43 (Cx43+/-) ou 32 (Cx32-/-). Foram analisados dados biométricos, histopatológicos, ultra-estruturais, imuno-histoquímicos e bioquímicos, além da expressão gênica e protéica das conexinas. Os aspectos moleculares da fibrose hepática foram analisados pela expressão de genes relacionados com a deposição e degradação da matriz extracelular por PCR em tempo real. As análises macroscópicas e de varredura demonstraram um processo de micronodulação da superfície hepática mais acentuado nos camundongos Cx43+/- fibróticos em relação aos animais wild-type (Cx43+/+) fibróticos. Adicionalmente, estes animais apresentaram maior proporção volumétrica de colágeno no tecido hepático; redução na atividade necroinflamatória tecidual; redução nas concentrações séricas de AST e ALT; redução na proliferação celular dos hepatócitos e redução na expressão dos genes: colágeno tipo I, TGFβ-1, MMP-2, MMP-13 e TIMP-1. Por sua vez, os camundongos Cx32-/- fibróticos apresentaram aumento na deposição de colágeno no parênquima hepático; aumento na atividade necroinflamatória tecidual e aumento nos níveis séricos das enzimas hepáticas AST, ALT e fosfatase alcalina em comparação aos animais wild-type (Cx32+/+) fibróticos. Também foram observadas redução na proliferação hepatocelular e maior quantidade de corpúsculos apoptóticos no tecido hepático. Baseando-se em todos os resultados obtidos, observou-se que ambos os modelos animais apresentaram aumento da fibrose hepática, aparentemente ocasionada por diferentes modos de ação. Os animais deficientes em Cx43 apresentaram menor capacidade de degradação do colágeno, ocasionando seu acúmulo no tecido hepático. Por outro lado, os animais deficientes em Cx32 apresentaram maior deposição de colágeno em resposta à injúria hepatocelular mais acentuada, aliada ao desequilíbrio entre as taxas de proliferação celular e apoptose. Em conclusão, os resultados obtidos neste trabalho demonstraram a importante participação das conexinas no controle da fibrogênese hepática, e que podem representar potenciais alvos terapêuticos para o tratamento das doenças hepáticas crônicas em humanos e animais. / Hepatic fibrosis results from chronic cell injury, leading to accumulation of components of extracellular matrix (ECM) through activation mainly of hepatic stellate cells and portal fibroblasts into myofibroblasts. These cells communicate through intercellular gap junctions composed of proteins known as connexins (Cx). Gap junctions are responsible for the exchange of molecules and ions among cells, playing an important role in the control of tissue homeostasis. Several subtypes of connexins were described among hepatic cells. Hepatocytes express Cx32 and Cx26, while the other non-parenchymal cells express Cx43. Some studies analyzed the expression of connexins and gap junctions on processes of healing and fibrogenesis in different tissues; however, few studies evaluated its role on hepatic fibrogenesis. Thus, the objective of this study was to evaluate morphological, histopathological and molecular aspects of hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride (CCl4) in animals with connexin 43 (Cx43+/-) or 32 (Cx32-/-) deficiency. We analyzed biometric, histopathological, ultrastructural, immunohistochemical and biochemical data, besides gene and protein expression of connexins. Molecular aspects of hepatic fibrosis were analyzed with the expression of genes related to deposition and degradation of extracellular matrix by real time PCR. Macroscopic and Scanning Electron Microscopy analyses showed a process of micronodulation of hepatic surface more accentuated on Cx43+/- fibrotic mice when compared to fibrotic wild-type (Cx43+/+) animals. Additionally, these animals presented a higher collagen volumetric proportion on hepatic tissue; reduction of tissue necroinflammatory activity; reduction of serum AST and ALT; reduction of hepatocytes proliferation and reduction of expression type I collagen, TGFβ-1, MMP-2, MMP-13 and TIMP-1 genes. Fibrotic Cx32-/- mice presented an increase of collagen deposition in hepatic parenchyma; increase of tissue necro-inflammatory activity and increase of liver enzymes AST, ALT and alkaline phosphatase when compared to fibrotic wild-type (Cx32+/+) animals. Reduction of hepatocellular proliferation and a higher amount of apoptotic bodies on hepatic tissue were also observed. Based on the results obtained, we observed that both animal models showed an increase of hepatic fibrosis, apparently caused by different modes of action. Cx43 deficient animals showed a reduced capacity to degrade collagen, causing its accumulation in the hepatic tissue. Cx32 deficient animals showed an increased collagen deposition in response to accentuated hepatocellular injury, together to an unbalance between rates of cellular proliferation and apoptosis. In conclusion, results obtained on this study demonstrate an important role of connexins on the control of hepatic fibrogenesis, which could represent potential therapeutical targets for the treatment of chronic liver diseases in humans and animals.