Bioinformática estrutural de proteínas modificadas por eventos de splicing alternativo / Structural Bioinformatics of Proteins modified by Alternative Splicing

Inibidores de proteases - moléculas capazes de inibir a atividade catalítica de enzimas proteolíticas - compreendem uma das mais abundantes classes de proteínas em plantas. Nas sementes, as funções destas moléculas estão relacionadas com o controle de proteínas endógenas e com mecanismo de defesa contra insetos fitófagos. Este trabalho teve como objetivo isolar, purificar, caracterizar estruturalmente e testar algumas aplicações biotecnológicas de um inibidor de serinoprotease das sementes de Cassia leptophylla. Após extração salina, a partir de cotilédones de sementes secas, o inibidor foi purificado por meio de cromatografia de filtração molecular sobre coluna Superdex75 e cromatografia de troca iônica em uma coluna Mono-Q. A proteína purificada apresentou PI de aproximadamente 4,5 e massa molecular estimado por eletroforese (SDS-PAGE) de 20kDa, sendo constituída por duas cadeias polipeptídicas de l6kDa e 4kDa. A seqüência N-terminal da cadeia de 4kDA (ATEDEKKDLGISIDDCCNRRLVVK) revelou similaridade com outros inibidores de serinoproteases tipo Kunitz isolados de Adenanthera pavonina, Prosopsis juliflora e Acacia confusa; o inibidor em estudo foi denominado CLTI (Cassia 1eptophyZZa trypsin inhibitor). A investigação da seqüência N-terminal da cadeia de 16 kDa, por meio da degradação de Edman automatizada, não deu sinal positivo, indicando provável bloqueio do primeiro resíduo de aminoácido. O espectro de dicroísmo circular (CD) do inibidor revelou que os componentes de estrutura secundária são constituídos predominantemente de folhas-&#946, voltas e estruturas não ordenadas. O espectro de emissão de fluorescência deste inibidor apresentou máximo de emissão em 226 nm, típico de proteínas com os resíduos de triptofano protegidos do solvente. CLTI quando submetido a pHs extremos (ácidos e básicos) revelou alterações de estrutura secundária e foi estável até cerca de 55&#176C (temperatura de transição 59&#176C), ambos investigados por CD e emissão de fluorescência. Ensaios de atividade biológica in vitro revelaram que CLTI inibiu a coagulação de plasma humano citratado, a ação das enzimas tripsina (KI 1,92&#956M), quimotripsina (KI 14,5&#956M), e calicreína plasmática humana (KI 1,5&#956M), mas não apresentou inibição sobre elastase porcina. CLTI formou um complexo estável com a tripsina demonstrado pela eluição do mesmo em coluna de filtração molecular. Este inibidor também mostrou atividade fungicida sobre as cepas de Fusarium monifome e Fusarium gramineanim e atividade fungistática sobre as cepas de Colletotrichum sp. F37 e Colletotrichum sp. P10. / Proteinase inhibitors are molecules able to inhibit the catalytic activity of proteolytic enzymes. They are the most abundant class of plant proteins. The function of these molecules in seeds is related to the control of endogenous proteins and defense mechanisms against phytopathogens. The objectives of this work are the isolation and structural characterization of a serine proteinase inhibitor from seeds of Cassza leptophylla. Besides, some biotechnological properties of this inhibitor were tested. After saline extraction from dry seed cotyledons, the inhibitor was purified by gel filtration chromatography on a Superdex75 column and ion exchange chromatography on a Mono-Q column. The purified protein presents a pI of approximately pH 4,5 and 20 kDa molecular mass estimated by electrophoresis (SDS-PAGE). This protein is constituted by two polypeptide chains, one of l6kDa and other of 4kDa. The N-terminal sequence of 4kDa peptide (ATEDEKKDLGISIDDCCNRRLVVK) reveals homology with other Kunitz type serine proteases inhibitors isolated from Adenanthera pavonina, Prosopsis juliflora and Acacia confisa. The studied inhibitor was named CLTI (Cassza leptophylla trypsin inhibitor). N-terminal sequencing of the l6kDa chain, using Edman degradation, did not show positive signal probably indicating blocked amino acid residues. The circular dichroism spectrum (CD) of this inhibitor reveals that the components of the secondary structure are constituted predominantly by sheets-&#946 and unordered structures. The fluorescence emission spectrum of this inhibitor presents the maximum emission at 226nm typical of proteins with tryptophan residues solvent inaccessible. CLTI secondary structure was revealed to change at extremely acid and alkaline pHs. It remained stable at temperatures up to 55 &#176C (transition temperature of this protein is 59&#176C). All these data were investigated by CD and fluorescence emission. Tests of biological activity in vitro revealed that CLTI inhibits blood clotting of citrated human plasm. Tests also showed inhibitory activity against trypsin (Ki 1,92&#956M), chymotrypsin (Ki 14,5&#956M) and human plasm kallikrein (Ki 1,5&#956M), but did not present inhibition against porcine pancreatic elastase. CLTI showed to form a stable complex with trypsin when eluted in gel filtration chromatography. This inhibitor also showed fungicide activity against the strains of Fusarium moniforme and Fusarium graminearum, and fungistatic activity against Colletotrichum sp. F37 and Colletotrichum sp. P10 strains.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T10:54:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 896783 bytes, checksum: da2d7082fa8f5e79329235b48767490e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T10:54:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 896783 bytes, checksum: da2d7082fa8f5e79329235b48767490e (MD5) Previous issue date: 2002-08-05 / O desdobramento no equilíbrio para a β-tripsina, induzido por desnaturação térmica, foi caracterizado termodinamicamente. O desdobramento foi acompanhado através de absorção no ultravioleta (UV) e espectroscopia de dicroísmo circular (DC) no UV próximo e distante. Além disso, experimentos utilizando a técnica de calorimetria diferencial de varredura (DSC) foram realizados. As curvas de transição térmica foram reversíveis mostrando um desdobramento altamente cooperativo, e os dados experimentais foram bem ajustados à um modelo de transição de dois-estados, para o desdobramento dessa proteína. O gráfico da fração desnaturada versus temperatura, calculado a partir das curvas de desnaturação térmica, em diferentes comprimentos de onda, mostra coincidência dessas curvas. Além disso, a razão entre a entalpia de desnaturação calorimétrica e a entalpia de van ́t Hoff, obtidas por DSC, é próxima à unidade, o que suporta o modelo de dois-estados. O espectro de DC da enzima nativa foi registrado na faixa espectral de 184 a 260 nm e utilizado para se estimar as porcentagens dos elementos da estrutura secundária, pelos métodos VARSCL e SELCON. A estimativa da estrutura secundária, em solução, correspondeu aos resultados de difração de raios-X. As mudanças na estrutura da β-tripsina, resultante de desnaturação por calor e por uréia foram monitoradas por meio de espectroscopia de DC no UV próximo e distante. A quantidade dos vários elementos de estrutura secundária foi estimada para essas mudanças espectrais, através dos espectros no UV distante, utilizando o método CCA (“Convex Constraint Algorithm”). De acordo com as estimativas, os estados desdobrados para essa proteína, ou seja, a 70 o C e em uréia 2,6 M, apresentaram quantidades consideráveis de estrutura secundária regular. Os espectros de fluorescência intrínsica dos resíduos de triptofano, registrados em diferentes concentrações de uréia, mostram a presença de um estado intermediário no equilíbrio, que apresenta grande afinidade pela sonda bis-ANS. Além disso, a ausência de contatos terciários e a presença de estrutura secundária para esse estado, verificados por meio de espectros de DC no UV próximo e distante, são consistentes com as características de um molten globule. As mudanças na atividade da β-tripsina foram observadas em concentrações de uréia nas quais não foram visualizadas nenhuma alteração espectroscópica da estrutura terciária da proteína. Os parâmetros cinéticos, k cat e K M , determinados na ausência e na presença de uréia, mostraram que o decréscimo na atividade da enzima, em baixas concentrações de uréia, foi provavelmente devido à formação do complexo EI, formado entre a β-tripsina e a uréia, um inibidor competitivo dessa enzima. / The unfolding equilibrium of β-trypsin induced by thermal denaturation was thermodynamically characterized. Thermal unfolding equilibrium were monitored using UV absorption and both far- and near-UV CD spectroscopy. In addition, experiments using differential scanning calorimetry (DSC), were performed. Thermal transition curves showed to be reversible and cooperative, and the data could be reasonably fitted using a two-state model for the unfolding of this protein. Plots of the fraction denatured, calculated from thermal denaturation curves at different wavelengths, versus temperature were coincident. In addition, the ratio of the enthalpy of denaturation obtained by scanning calorimetry to the van ́t Hoff enthalpy was close to one, which supports the two-state model. The dichroism circular (CD) spectrum of the native protein was taken over the wavelength range of 184- 260 nm, and the amount of various secondary structures were estimated using VARSLC and SELCON methods. The CD estimation of secondary strucutre, showed excellent agreement with X-ray results. The CD spectra of β-trypsin, as a function of temperature and urea, were monitored by far- and near-UV CD, and the relative proportions of secondary structures calculated by CCA method. According to CD estimation, although the secondary structure changed upon denaturation, its denatured state still has considerable amounts of ordered structure. The intrinsic fluorescence emission spectra of β-trypsin, at different urea concentration, showed an intermediate equilibrium state, with great affinity by bis-ANS. Besides, the absence of terciary contacts and the presence of secondary structure for this state, are consistent with the molten globule characteristics. Changes on the activity of β-trypsin were observed at urea concentrations in which terciary structure changes were not detected. Kinetic parameters, k cat and K M , determined in the presence and absence of urea, showed that the decreases in enzyme activity, at low concentrations of urea, were probably due to a development of the enzyme-inhibitor complex between β-trypsin and urea, a competitive inhibitor of this enzyme. / Tese importada do Alexandria

Inibidores de proteases - moléculas capazes de inibir a atividade catalítica de enzimas proteolíticas - compreendem uma das mais abundantes classes de proteínas em plantas. Nas sementes, as funções destas moléculas estão relacionadas com o controle de proteínas endógenas e com mecanismo de defesa contra insetos fitófagos. Este trabalho teve como objetivo isolar, purificar, caracterizar estruturalmente e testar algumas aplicações biotecnológicas de um inibidor de serinoprotease das sementes de Cassia leptophylla. Após extração salina, a partir de cotilédones de sementes secas, o inibidor foi purificado por meio de cromatografia de filtração molecular sobre coluna Superdex75 e cromatografia de troca iônica em uma coluna Mono-Q. A proteína purificada apresentou PI de aproximadamente 4,5 e massa molecular estimado por eletroforese (SDS-PAGE) de 20kDa, sendo constituída por duas cadeias polipeptídicas de l6kDa e 4kDa. A seqüência N-terminal da cadeia de 4kDA (ATEDEKKDLGISIDDCCNRRLVVK) revelou similaridade com outros inibidores de serinoproteases tipo Kunitz isolados de Adenanthera pavonina, Prosopsis juliflora e Acacia confusa; o inibidor em estudo foi denominado CLTI (Cassia 1eptophyZZa trypsin inhibitor). A investigação da seqüência N-terminal da cadeia de 16 kDa, por meio da degradação de Edman automatizada, não deu sinal positivo, indicando provável bloqueio do primeiro resíduo de aminoácido. O espectro de dicroísmo circular (CD) do inibidor revelou que os componentes de estrutura secundária são constituídos predominantemente de folhas-&#946, voltas e estruturas não ordenadas. O espectro de emissão de fluorescência deste inibidor apresentou máximo de emissão em 226 nm, típico de proteínas com os resíduos de triptofano protegidos do solvente. CLTI quando submetido a pHs extremos (ácidos e básicos) revelou alterações de estrutura secundária e foi estável até cerca de 55&#176C (temperatura de transição 59&#176C), ambos investigados por CD e emissão de fluorescência. Ensaios de atividade biológica in vitro revelaram que CLTI inibiu a coagulação de plasma humano citratado, a ação das enzimas tripsina (KI 1,92&#956M), quimotripsina (KI 14,5&#956M), e calicreína plasmática humana (KI 1,5&#956M), mas não apresentou inibição sobre elastase porcina. CLTI formou um complexo estável com a tripsina demonstrado pela eluição do mesmo em coluna de filtração molecular. Este inibidor também mostrou atividade fungicida sobre as cepas de Fusarium monifome e Fusarium gramineanim e atividade fungistática sobre as cepas de Colletotrichum sp. F37 e Colletotrichum sp. P10. / Proteinase inhibitors are molecules able to inhibit the catalytic activity of proteolytic enzymes. They are the most abundant class of plant proteins. The function of these molecules in seeds is related to the control of endogenous proteins and defense mechanisms against phytopathogens. The objectives of this work are the isolation and structural characterization of a serine proteinase inhibitor from seeds of Cassza leptophylla. Besides, some biotechnological properties of this inhibitor were tested. After saline extraction from dry seed cotyledons, the inhibitor was purified by gel filtration chromatography on a Superdex75 column and ion exchange chromatography on a Mono-Q column. The purified protein presents a pI of approximately pH 4,5 and 20 kDa molecular mass estimated by electrophoresis (SDS-PAGE). This protein is constituted by two polypeptide chains, one of l6kDa and other of 4kDa. The N-terminal sequence of 4kDa peptide (ATEDEKKDLGISIDDCCNRRLVVK) reveals homology with other Kunitz type serine proteases inhibitors isolated from Adenanthera pavonina, Prosopsis juliflora and Acacia confisa. The studied inhibitor was named CLTI (Cassza leptophylla trypsin inhibitor). N-terminal sequencing of the l6kDa chain, using Edman degradation, did not show positive signal probably indicating blocked amino acid residues. The circular dichroism spectrum (CD) of this inhibitor reveals that the components of the secondary structure are constituted predominantly by sheets-&#946 and unordered structures. The fluorescence emission spectrum of this inhibitor presents the maximum emission at 226nm typical of proteins with tryptophan residues solvent inaccessible. CLTI secondary structure was revealed to change at extremely acid and alkaline pHs. It remained stable at temperatures up to 55 &#176C (transition temperature of this protein is 59&#176C). All these data were investigated by CD and fluorescence emission. Tests of biological activity in vitro revealed that CLTI inhibits blood clotting of citrated human plasm. Tests also showed inhibitory activity against trypsin (Ki 1,92&#956M), chymotrypsin (Ki 14,5&#956M) and human plasm kallikrein (Ki 1,5&#956M), but did not present inhibition against porcine pancreatic elastase. CLTI showed to form a stable complex with trypsin when eluted in gel filtration chromatography. This inhibitor also showed fungicide activity against the strains of Fusarium moniforme and Fusarium graminearum, and fungistatic activity against Colletotrichum sp. F37 and Colletotrichum sp. P10 strains.

Bioinformática estrutural de proteínas modificadas por eventos de splicing alternativo / Structural Bioinformatics of Proteins modified by Alternative Splicing

A contração muscular esquelética é regulada pelo complexo troponina/tropomiosina de maneira dependente de Ca2+. O complexo troponina consiste de três subunidades: a troponina C (TnC), a troponina I (TnI) e a troponina T (TnT). A troponina C é a subunidade que liga Ca2+, a TnI é a subunidade inibitória e a TnT liga-se fortemente à tropomiosina. A TnI e a TnT são altamente insolúveis a baixas forças iônicas, a não ser que estejam complexadas com a TnC. O complexo troponina pode ser reconstituído \"in vitro\" a partir das subunidades isoladas simplesmente misturando-se as subunidades em razões equimolares em uréia, que depois é removida através de diálise. Na primeira parte deste trabalho um vetor para a co-expressão da TnC, TnI e TnT em E.coli foi construído. Utilizando este vetor nós produzimos um complexo troponina funcional montado no citoplasma de E.coli. A presença da TnT é requerida para regulação dependente de Ca2+ da contração muscular esquelética. O papel da TnT em conferir sensibilidade ao Ca2+ à atividade ATPásica da acto-miosina foi analisado. Mutantes de deleção da TnT foram construídos através de mutação sítio-dirigida e expressos em E.coli. Complexos troponina contendo os mutantes de TnT e/ou mutantes de TnI foram reconstituídos e analisados em ensaios de ligação ao filamento fino e ensaios de atividade ATPásica. Baseado nestes resultados a TnT foi subdividida em três domínios: o domínio ativatório (aminoácidos 157-216), o domínio inibitório (aminoácidos 157-216) e o domínio de ancoragem do dímero TnC/TnI (aminoácidos 216-263). Nós demonstramos que o dímero TnC/TnI está ancorado ao filamento fino através da interação entre a região amino-terminal da TnI e da região carbóxi-terminal da TnT (aminoácidos 216-263). Um modelo para o papel da TnT na regulação da contração muscular dependente de Ca2+ é proposto. / The contraction of skeletal muscle is regulated by troponin and tropomyosin in a Ca2+ dependent manner. The troponin complex consists of three subunits: troponin C (TnC), troponin I (TnI) and troponin T (TnT). Troponin C is the Ca2+ binding subunit, TnI is the inhibitory subunit and TnT binds tightly to tropomyosin. TnI and TnT are highly insoluble proteins at low ionic strengths, unless they are complexed with TnC. The troponin complex can be reconstituted \"in vitro\" from the isolated subunits simply by mixing the subunits at equimolar ratios in urea, which is then removed by dialysis. In the first part of this work a vector for the co-expression of TnC, TnI and TnT in E.coli was constructed. Using this vector we were able to produce a functional troponin complex assembled \"in vivo\" in the E.coli cytoplasm The presence of TnT is required for the Ca2+ dependente regulation of the skeletal muscle contraction. The role of TnT in conferring full Ca2+ sensitivity to the ATPase activity of acto-myosin was analyzed. Deletion mutants of TnT were constructed by site-directed mutagenesis and expressed in E.coli. Troponin complexes containing the TnT deletion mutants and/or TnI deletion mutants, were reconstituted and analyzed in thin filament binding assays and in ATPase activity assays. Based on these studies, TnT was subdivided into three domains: the activation domain (comprised of aminoacids 1-157), the inhibitory domain (comprised of amino acids 157-216) and the TnC/TnI dimer anchoring domain (aminoacids 216-263). We demonstrated that the TnC/TnI is anchored to the thin filament through interaction between the amino-terminal domain of TnI and the region comprised of aminoacids 216-263 of TnT. A model for the role of TnT in the Ca2+ dependent regulation of muscle contraction is proposed.

Foi desenvolvido um conjunto de peças plásticas que permitem a montagem e representação dos aminoácidos mais comuns, bem como a construção de estruturas protéicas. Durante e após o desenvolvimento o material foi submetido a várias etapas de avaliação por professores (do ensino básico e universitário), alunos de pós-graduação e de graduação. A primeira etapa foi o desenvolvimento dos modelos em ambiente computacional, seguida da prototipagem das peças. Após discussão com a comunidade científica (apresentados na XXXVI Reunião Anual da SBBq em 2007) as sugestões foram implementadas nos modelos computacionais. Quatro moldes para injeção termoplástica foram projetados, detalhados e construídos, sob nossa orientação. As peças representando as estruturas que compõe os aminoácidos e ligações foram produzidas em grande escala e iniciou-se o processo final de avaliação. As peças apresentaram boas relações geométricas com as fórmulas estruturais dos aminoácidos obtidas de bancos de dados e livros didáticos. As conexões C&alpha;-amina e C&alpha;-carboxila permitem verificar a liberdade de rotação característica das cadeias polipeptídicas e as possibilidades dos ângulos de torção &Psi; e &Phi;, visualizando a restrição de rotação da ligação peptídica. Montando um conjunto de aminoácidos é possível construir uma cadeia polipeptídica e, através das ligações de hidrogênio, montar as estruturas secundárias principais (hélice-&alpha; e estruturas &beta;). Duas avaliações preliminares foram realizadas e a avaliação final ocorreu em uma oficina de atividades com 256 professores das áreas de ciências da natureza da rede publica do Estado de SP. Os resultados da avaliação foram extremamente positivos, sendo importante destacar a quantidade e o teor dos comentários elogiosos ao potencial de utilização do material, notadamente, dos professores de biologia e química. O material poderá inclusive auxiliar no preenchimento de lacunas conceituais que existem na formação dos professores e que foram observadas durante as atividades de avaliação. Este conjunto de peças, organizado na forma de um kit: Construindo Estruturas de Aminoácidos e Proteínas, foi submetido à avaliação do MEC e certificado por este órgão, passando a integrar o Guia de Tecnologias Educacionais 2008.<b/> / It was developed a set of plastic pieces that allow the assembly and representation of the most common amino acids, as well as the construction of protein structures. During and after development the material was submitted to several stages of evaluation by teachers (primary and university), graduate and undergraduate students. The first step was the development of models in the computing environment, followed by prototyping of parts. After discussion with the scientific community (presented at the XXXVI Annual Meeting of SBBq in 2007) suggestions were implemented in the computational models. Four thermoplastic injection molds were designed, detailed and constructed under our supervision. Parts representing the structures of amino acids and bonds were produced in large scale and it was started the final process of evaluation. The pieces had good geometric relationships with the structural formulas of amino acids obtained from databases and textbooks. The connections C&alpha;-amine and C&alpha;-arboxyl permit to check the freedom of rotation of the polypeptide chains and the possibility of torsion angles &Phi; and &Psi;, visualizing the restriction of rotation of the peptide bond. Assembling a set of amino acids is possible to build a polypeptide chain and, through hydrogen bonding, to assemble the main secondary structures (&alpha;-helix and &beta;-structures). Two preliminary evaluations were conducted and the final evaluation took place in a workshop with 256 teachers of the fields of natural sciences from public schools of the São Paulo State. The results of the evaluation were extremely positive and it is important to highlight the amount and content of approving comments for the potential of use of the material, especially from biology and chemistry teachers. The material may even assist in filling in conceptual gaps that exist in teacher instruction and that were observed during the evaluation activities. This set of pieces, arranged in the form of a kit: Building Structures of Amino Acids and Proteins, was submitted to MEC and certified by this organization, starting to integrate the Guide of Educational Technology 2008<b/>.

A contração muscular esquelética é regulada pelo complexo troponina/tropomiosina de maneira dependente de Ca2+. O complexo troponina consiste de três subunidades: a troponina C (TnC), a troponina I (TnI) e a troponina T (TnT). A troponina C é a subunidade que liga Ca2+, a TnI é a subunidade inibitória e a TnT liga-se fortemente à tropomiosina. A TnI e a TnT são altamente insolúveis a baixas forças iônicas, a não ser que estejam complexadas com a TnC. O complexo troponina pode ser reconstituído \"in vitro\" a partir das subunidades isoladas simplesmente misturando-se as subunidades em razões equimolares em uréia, que depois é removida através de diálise. Na primeira parte deste trabalho um vetor para a co-expressão da TnC, TnI e TnT em E.coli foi construído. Utilizando este vetor nós produzimos um complexo troponina funcional montado no citoplasma de E.coli. A presença da TnT é requerida para regulação dependente de Ca2+ da contração muscular esquelética. O papel da TnT em conferir sensibilidade ao Ca2+ à atividade ATPásica da acto-miosina foi analisado. Mutantes de deleção da TnT foram construídos através de mutação sítio-dirigida e expressos em E.coli. Complexos troponina contendo os mutantes de TnT e/ou mutantes de TnI foram reconstituídos e analisados em ensaios de ligação ao filamento fino e ensaios de atividade ATPásica. Baseado nestes resultados a TnT foi subdividida em três domínios: o domínio ativatório (aminoácidos 157-216), o domínio inibitório (aminoácidos 157-216) e o domínio de ancoragem do dímero TnC/TnI (aminoácidos 216-263). Nós demonstramos que o dímero TnC/TnI está ancorado ao filamento fino através da interação entre a região amino-terminal da TnI e da região carbóxi-terminal da TnT (aminoácidos 216-263). Um modelo para o papel da TnT na regulação da contração muscular dependente de Ca2+ é proposto. / The contraction of skeletal muscle is regulated by troponin and tropomyosin in a Ca2+ dependent manner. The troponin complex consists of three subunits: troponin C (TnC), troponin I (TnI) and troponin T (TnT). Troponin C is the Ca2+ binding subunit, TnI is the inhibitory subunit and TnT binds tightly to tropomyosin. TnI and TnT are highly insoluble proteins at low ionic strengths, unless they are complexed with TnC. The troponin complex can be reconstituted \"in vitro\" from the isolated subunits simply by mixing the subunits at equimolar ratios in urea, which is then removed by dialysis. In the first part of this work a vector for the co-expression of TnC, TnI and TnT in E.coli was constructed. Using this vector we were able to produce a functional troponin complex assembled \"in vivo\" in the E.coli cytoplasm The presence of TnT is required for the Ca2+ dependente regulation of the skeletal muscle contraction. The role of TnT in conferring full Ca2+ sensitivity to the ATPase activity of acto-myosin was analyzed. Deletion mutants of TnT were constructed by site-directed mutagenesis and expressed in E.coli. Troponin complexes containing the TnT deletion mutants and/or TnI deletion mutants, were reconstituted and analyzed in thin filament binding assays and in ATPase activity assays. Based on these studies, TnT was subdivided into three domains: the activation domain (comprised of aminoacids 1-157), the inhibitory domain (comprised of amino acids 157-216) and the TnC/TnI dimer anchoring domain (aminoacids 216-263). We demonstrated that the TnC/TnI is anchored to the thin filament through interaction between the amino-terminal domain of TnI and the region comprised of aminoacids 216-263 of TnT. A model for the role of TnT in the Ca2+ dependent regulation of muscle contraction is proposed.

Foi desenvolvido um conjunto de peças plásticas que permitem a montagem e representação dos aminoácidos mais comuns, bem como a construção de estruturas protéicas. Durante e após o desenvolvimento o material foi submetido a várias etapas de avaliação por professores (do ensino básico e universitário), alunos de pós-graduação e de graduação. A primeira etapa foi o desenvolvimento dos modelos em ambiente computacional, seguida da prototipagem das peças. Após discussão com a comunidade científica (apresentados na XXXVI Reunião Anual da SBBq em 2007) as sugestões foram implementadas nos modelos computacionais. Quatro moldes para injeção termoplástica foram projetados, detalhados e construídos, sob nossa orientação. As peças representando as estruturas que compõe os aminoácidos e ligações foram produzidas em grande escala e iniciou-se o processo final de avaliação. As peças apresentaram boas relações geométricas com as fórmulas estruturais dos aminoácidos obtidas de bancos de dados e livros didáticos. As conexões C&alpha;-amina e C&alpha;-carboxila permitem verificar a liberdade de rotação característica das cadeias polipeptídicas e as possibilidades dos ângulos de torção &Psi; e &Phi;, visualizando a restrição de rotação da ligação peptídica. Montando um conjunto de aminoácidos é possível construir uma cadeia polipeptídica e, através das ligações de hidrogênio, montar as estruturas secundárias principais (hélice-&alpha; e estruturas &beta;). Duas avaliações preliminares foram realizadas e a avaliação final ocorreu em uma oficina de atividades com 256 professores das áreas de ciências da natureza da rede publica do Estado de SP. Os resultados da avaliação foram extremamente positivos, sendo importante destacar a quantidade e o teor dos comentários elogiosos ao potencial de utilização do material, notadamente, dos professores de biologia e química. O material poderá inclusive auxiliar no preenchimento de lacunas conceituais que existem na formação dos professores e que foram observadas durante as atividades de avaliação. Este conjunto de peças, organizado na forma de um kit: Construindo Estruturas de Aminoácidos e Proteínas, foi submetido à avaliação do MEC e certificado por este órgão, passando a integrar o Guia de Tecnologias Educacionais 2008.<b/> / It was developed a set of plastic pieces that allow the assembly and representation of the most common amino acids, as well as the construction of protein structures. During and after development the material was submitted to several stages of evaluation by teachers (primary and university), graduate and undergraduate students. The first step was the development of models in the computing environment, followed by prototyping of parts. After discussion with the scientific community (presented at the XXXVI Annual Meeting of SBBq in 2007) suggestions were implemented in the computational models. Four thermoplastic injection molds were designed, detailed and constructed under our supervision. Parts representing the structures of amino acids and bonds were produced in large scale and it was started the final process of evaluation. The pieces had good geometric relationships with the structural formulas of amino acids obtained from databases and textbooks. The connections C&alpha;-amine and C&alpha;-arboxyl permit to check the freedom of rotation of the polypeptide chains and the possibility of torsion angles &Phi; and &Psi;, visualizing the restriction of rotation of the peptide bond. Assembling a set of amino acids is possible to build a polypeptide chain and, through hydrogen bonding, to assemble the main secondary structures (&alpha;-helix and &beta;-structures). Two preliminary evaluations were conducted and the final evaluation took place in a workshop with 256 teachers of the fields of natural sciences from public schools of the São Paulo State. The results of the evaluation were extremely positive and it is important to highlight the amount and content of approving comments for the potential of use of the material, especially from biology and chemistry teachers. The material may even assist in filling in conceptual gaps that exist in teacher instruction and that were observed during the evaluation activities. This set of pieces, arranged in the form of a kit: Building Structures of Amino Acids and Proteins, was submitted to MEC and certified by this organization, starting to integrate the Guide of Educational Technology 2008<b/>.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-13T12:31:48Z No. of bitstreams: 2 TESE Marina Marcuschi.pdf: 36600890 bytes, checksum: 8fe67b125b035ecb70519097b1f641d1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T12:31:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Marina Marcuschi.pdf: 36600890 bytes, checksum: 8fe67b125b035ecb70519097b1f641d1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / FINEPE; CAPES; CNPq; FACEPE / A presente tese reporta a estrutura, função e aplicação como aditivo pré lavagem de uma tripsina do peixe amazônico tambaqui (Colossoma macropomum). O capítulo um traz a aplicação de tripsinas purificada dos peixes tambaqui e tilapia do Nilo (Oreochromis niloticus) como componentes para soluções de pré-lavagem de roupas, comparando-as com tripsina de porco, subtilisina bacteriana e quimotripsina bovina. No capítulo dois, o efeito do cálcio sobre a tripsina do tambaqui e do porco foi comparado através de ensaios bioquímicos, eletroforéticos, de espectrometria de massas e de fluorescência intrínseca. Já o capítulo três abordou o uso de dinâmica molecular e dicroísmo circular na análise da estrutura da tripsina do tambaqui, porco e salmão submetidas a variações de temperatura, bem como a criação de um banco de dados com sequências aniônicas e catiônicas de tripsinas de peixes e animais homeotérmicos. Com os resultados apresentados na presente tese, pode-se afirmar que a tripsina do tambaqui apresenta uma estrutura mais flexível que a do porco, e que consegue suportar um leque maior de temperaturas e agentes denaturantes, principalmente por conta de sua baixa propensão à autodigestão. Assim, considerando que a tripsina do tambaqui é mais ativa e robusta do que as tripsinas de mamíferos, pode-se dizer que ela apresenta potencial para aplicações industriais, principalmente aquelas que se dão em presença de agentes denaturantes e em temperaturas entre 25 e 60 °C.