Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques de la lignée B (LAL-B) sont les cancers pédiatriques les plus fréquents. Dans ce type de leucémie, l'une des anomalies génétiques les plus fréquentes est la translocation t(12 ;21) aboutissant à la protéine de fusion ETV6-RUNX1. Cette pathologie est décrite comme un modèle à deux « hits ». Le premier, se produit in utero et génère la protéine de fusion. Le second, correspond à l’acquisition d’anomalies génétiques après la naissance. Ces réarrangements génomiques aberrants ont été décrits comme provenant d’une activité anormale de la recombinasse RAG. Notre travail a consisté dans un premier temps à compléter le modèle de leucémogénèse à plusieurs « hits ». En continuant notre étude des LAL B à translocation ETV6-RUNX1, nous nous sommes concentrés sur le rôle de RUNX1, gène dérégulé dans ce type de leucémie.L’ensemble de nos résultats confirme le rôle prépondérant de RUNX1 dans l’hématopoïèse et la leucémogenèse grâce à sa capacité à s’associer à des protéines aux fonctions différentes et grâce à son implication dans la transcription de gènes clé en hématologie. Nos résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la compréhension du contrôle de l’activité transcriptionnelle de RUNX1 et dans son rôle dans les hémopathies malignes. / B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is the most common pediatric cancer. In this type of leukemia, one of the most common genetic abnormalities is the ETV6-RUNX1 rearrangement. This malignancy is described as a two "hits" model. The first event occurs mainly in utero and generates the fusion gene ETV6-RUNX1. The second event consists in the acquisition of additional genetic abnormalities after birth. These aberrant genomic modifications have been described as resulting from abnormal activity of the RAG recombinase. Our work consisted initially in completing the leukemogenesis model. In continuing our study of ETV6-RUNX1 B-ALL, we focused on the role of RUNX1, an upregulated gene in this type of leukemia. All results confirm the predominant role of RUNX1 in hematopoiesis and leukemogenesis thanks to its ability to associate with proteins with different functions and its involvement in the transcription of key genes in hematology. Our results therefore open new perspectives in understanding the control of transcriptional activity of RUNX1 and its role in malignant hematology.

Malgré l'amélioration des traitements, environ 20% des patients atteints de leucémie aigue lymphoblastiques (LAL) rechutent dans la moelle osseuse ou dans des sites extra-médullaires tels que les ovaires et les testicules, ce qui est particulièrement fréquent dans les rechutes tardives de LAL-B présentant un remaniement ETV6/RUNX1. Les travaux réalisés par Virginie Gandemer en 2007, ont montré que l'expression de CD9 permettait de distinguer les leucémies ETV6/RUNX1 des autres types de leucémie. Le gène CD9 code pour une protéine de la famille des tétraspanines dont l'expression a été corrélée avec le risque métastatique et la survie des patients. Par ailleurs il a été démontré que la protéine CD9 était impliquée dans le homing et la prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques et leucémiques. Nous avons donc émis l'hypothèse qu'à travers ses propriétés fonctionnelles sur la migration et le homing, CD9 pourrait être un acteur clé des rechutes de LAL-B. Le but de ce travail de thèse était donc premièrement de déterminer le mode de régulation de CD9 dans les LAL-B ETV6/RUNX1 et deuxièmement de déterminer les effets de l'expression de CD9 sur la motilité et la prise de greffe des LAL-B. Les analyses préalablement réalisées au laboratoire avaient suggéré que CD9 pouvait être régulé par des miARNs. Nous avons identifié un cluster de 3 miARNs potentiellement impliqués dans la régulation de CD9 dans les LAL-B ETV6/RUNX1. Ces résultats doivent cependant être complétés par d'autres analyses fonctionnellles afin d'être confirmés. Nous avons étudié le rôle de la protéine CD9 dans la dissémination des cellules de LAL-B. Nous avons démontré que CD9 était un régulateur potentiel de l'adhésion et un nouveau facteur impliqué dans la migration et le homing dépendants de CXCR4 en favorisant l'activation de RAC1 et les réarrangements de l'actine en réponse au CXCL12. Enfin, nous avons décrit pour la première fois l'influence de CD9 sur la migration et le homing dans les testicules via RAC1. Nos résultats montrent donc que CD9 favorise la dissémination des cellules de LAL-B dans les testicules et suggèrent que cette protéine pourrait constituer un acteur majeur des rechutes tardives de LAL-B dont les mécanismes d'apparitions sont peu connus. / Despite improvements in survival rates, approximately 20% of children suffering from acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) present relapses from bone marrow or from B-extramedullary sites, such as the testes or ovaries, particularly in cases of late relapse of ETV6/RUNX1-ALL. Virgine Gandemer showed in 2007, that the expression of CD9, a protein from the tetraspanin superfamily, can be used to distinguish ETV6/RUNX1 lymphoblastic leukemia from other types of ALL. CD9 expression has been correlated with the risk of metastasis and is associated with a poor clinical outcome in various types of cancer. Moreover CD9 has been implicated in hematopoietic and leukemic stem cell homing. We hypothesized, that CD9 protein, through its functional properties on migration and homing, could be a key actor of B-ALL relapses. The purpose of our study was then to investigate, first the transcriptional regulation of CD9 in ETV6/RUNX1 B-ALL and secondly, the effect of CD9 expression on motility and engrafment of B lymphoblasts. The analysis of CD9 transcriptional regulation previously made in the team, suggested that it could be regulated by miRNAs. We identified a cluster of 3 miRNAs potentially implicated in the regulation of CD9 expression in ETV6/RUNX1 B-ALL. This result has to be confirmd by more functional analysis. We investigated the role of CD9 in the dissemination of B-ALL. We identified CD9 as a potential regulator of B-ALL cell adhesion and a new factor involved in CXCR4-mediated migration and homing, through the promotion of actin rearrangement in response to CXCL12. We also characterized the effect of CD9 protein expression on RAC1 activation, which had an impact on blast migration and engraftment. Finally, we described, for the first time, the influence of CD9, mediated by RAC1 signaling, on B-cell chemotactic migration and homing in the testis. Our work provides evidence for an impact of CD9 on the ability of pre-B leukemic cells to disseminate to testes, through its effects on migration and homing, and suggests that CD9 may be a key player in late relapses of B-ALL, which are currently poorly understood.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) sont le cancer le plus fréquent chez l’enfant et dérivent le plus souvent de précurseurs lymphoïdes B. D’importants progrès thérapeutiques ont permis d’améliorer considérablement le pronostic. Néanmoins, 15 à 20 % des enfants rechutent encore. Ces rechutes peuvent survenir de façon isolée ou combinée dans la moelle osseuse, le site primitif des lymphoblastes, et/ou dans des organes extramédullaires tels que le testicule ou le système nerveux central. Notre équipe a montré que la protéine transmembranaire CD9 jouait un rôle majeur dans la migration des blastes dans ces sites et notamment le testicule, par l’activation de la voie RAC1 en réponse à la stimulation des cellules par le CXCL12. Ici, nous avons mis en évidence qu’un faible niveau d’oxygène, caractéristique commune aux niches médullaire et extramédullaires, régulait positivement l’expression de CD9 aux niveaux transcriptionnel et protéique, via la voie majeure de réponse à l’hypoxie, dépendante du facteur de transcription Hypoxia Inducible Factor 1a (HIF1a). Nous montrons que HIF1a se fixe directement sur le promoteur de CD9 pour induire sa transcription. Nous montrons aussi que la protéine CD9 est essentielle aux propriétés d’adhérence et de migration des blastes dans des conditions de basse oxygénation, et que son action pourrait s’exercer à travers RAC1 comme en normoxie. Nos résultats dans des expériences de xénogreffe à des souris indiquent que la voie HIF1a favorise la dissémination des blastes, possiblement à travers la régulation qu’elle exerce sur CD9. Ainsi, ce travail contribue à mieux comprendre le rôle de CD9 dans la pathogenèse des LAL de l’enfant. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) are the most frequent cancer in children and derive most often from B-cell precursors. Huge therapeutic improvements have allowed to reach high survival rates near 90% at 10 years from diagnosis. However, 15-20% of children still relapse with a significant risk of death. Relapses can occur in bone marrow and/or extramedullary sites such as testis or central nervous system, usually referred as “sanctuary sites”. Our previous work showed that the transmembrane protein CD9 plays a major role in lymphoblasts migration into these sites, especially in testis, through the activation of RAC1 signaling upon blasts stimulation with C-X-C chemokine ligand 12 (CXCl12). Here, we addressed the question of putative common factors shared by bone marrow and extramedullary niches which could upregulate CD9 expression and function. Consequently, we found that low oxygen levels could actually enhance CD9 expression both at mRNA and protein levels. We further determined that Hypoxia Inducible Factor 1a (HIF1a), the master transcription factor involved in hypoxia response, binds directly CD9 promoter to induce its transcription. We also showed that CD9 protein is crucial for leukemic cell adhesion and migration at low oxygen levels, possibly through its action on RAC1 signaling. Mouse xenograft experiments indicate that HIF1a signaling pathway favors ALL cells dissemination, which may involve CD9 as well. The present work increments our understanding of CD9 implication in ALL pathogenesis.

Childhood acute leukemias are genetically complex disorders, with recurrent or random aberrations found in most patients. Their proper functional characterization is crucial for understanding the role they play in the process of leukemogenesis. We aimed to identify and characterize the genetic background of two leukemic entities. The transient myeloproliferative disorder (TMD) is a preleukemic condition that occurs in 10% of newborns with Down syndrome. Trisomy 21 together with in-utero gained mutations in the GATA1 gene are essential in TMD and represent an ideal "multi-hit" model to study leukemogenesis. We investigated an alternative pathogenic mechanism enabling TMD development in a confirmed absence of trisomy 21. Novel deletions in the GATA1 and JAK1 genes were described as potential drivers of this TMD. The deletion D65_C228 in GATA1 results in the expression of an aberrant isoform, which is predicted to lose transactivation potential and, more importantly, to partially lose the ability of recognizing physiological DNA binding sites, possibly triggering TMD alone. Our thorough characterization of JAK1 F636del questions its role in TMD development. Analysis of JAK/STAT signaling suggested decrease of kinase activity upon F636 loss. Cells harboring the aberrant JAK1 did not obtain cytokine-...

Childhood acute leukemias are genetically complex disorders, with recurrent or random aberrations found in most patients. Their proper functional characterization is crucial for understanding the role they play in the process of leukemogenesis. We aimed to identify and characterize the genetic background of two leukemic entities. The transient myeloproliferative disorder (TMD) is a preleukemic condition that occurs in 10% of newborns with Down syndrome. Trisomy 21 together with in-utero gained mutations in the GATA1 gene are essential in TMD and represent an ideal "multi-hit" model to study leukemogenesis. We investigated an alternative pathogenic mechanism enabling TMD development in a confirmed absence of trisomy 21. Novel deletions in the GATA1 and JAK1 genes were described as potential drivers of this TMD. The deletion D65_C228 in GATA1 results in the expression of an aberrant isoform, which is predicted to lose transactivation potential and, more importantly, to partially lose the ability of recognizing physiological DNA binding sites, possibly triggering TMD alone. Our thorough characterization of JAK1 F636del questions its role in TMD development. Analysis of JAK/STAT signaling suggested decrease of kinase activity upon F636 loss. Cells harboring the aberrant JAK1 did not obtain cytokine-...

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Plusieurs réarrangements chromosomiques ont été associés à cette maladie, dont la translocation t(12;21), qui est observée dans 25% des cas de LAL de type pré-B. Cette translocation engendre l’expression de la protéine de fusion ETV6-AML1. Toutefois, celle-ci n’est pas suffisante pour initier seule une leucémie, ce qui suggère que des mutations additionnelles sont nécessaires à la transformation oncogénique. Or, on observe que l’allèle non-réarrangé d’ETV6 est perdu dans 75% des cas de t(12;21). Cette délétion entraîne l’inactivation complète du facteur de transcription ETV6 et l’abolition de sa fonction biologique. Puisqu’ETV6 semble jouer un rôle de suppresseur de tumeurs, nous croyons que son inactivation favoriserait le développement de la leucémie via la dérégulation de ses gènes cibles. Ce projet visait donc à identifier de nouvelles cibles transcriptionnelles d’ETV6, afin d’élucider son implication dans la leucémie. Une expérience de RNA-Seq a permis d’identifier plus de 200 gènes dont l’expression est corrélée avec celle d’ETV6 dans des cellules souches hématopoïétiques CD34+. Parmi ceux-ci, plusieurs gènes sont impliqués dans la réponse immunitaire et inflammatoire, la migration cellulaire, l’homéostasie ionique et la signalisation intracellulaire. Nous avons également mis en place une approche d’immunoprécipitation de la chromatine afin d’identifier les régions auxquelles le facteur de transcription ETV6 peut se lier. À l’aide de cette méthode, nous avons démontré une interaction entre ETV6 et SLCO2B1, un gène dont l’expression est également co-régulée avec ETV6. Finalement, notre étude suggère qu’ETV6 contribuerait à la leucémogenèse en dérégulant l’expression de certains gènes ayant des propriétés oncogéniques. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common childhood cancer. Many chromosomal rearrangements have been identified in leukemia, including the translocation t(12;21), which is observed in approximately 25% of children diagnosed with pre-B ALL. This translocation results in the expression of the ETV6-AML1 chimera. However, the fusion protein ETV6-AML1 is not sufficient to initiate leukemia by itself, suggesting that additional mutations are required to promote oncogenic transformation. Accordingly, the expression of the non-rearranged ETV6 allele is lost in 75% of the t(12;21) cases. This deletion leads to the complete inactivation of ETV6 transcription factor and the abolition of its biological function. Because ETV6 seems to be a tumor suppressor, we believe that its inactivation could promote the development of leukemia through the deregulation of its downstream target genes. This project aimed to identify new transcriptional targets of ETV6, in order to elucidate its role in leukemogenesis. A RNA-Seq experiment has led to the identification of more than 200 genes whose expression is correlated with ETV6 mRNA levels in CD34 + hematopoietic stem cells. Among these, several genes are involved in immune and inflammatory responses, cell migration, ion homeostasis and intracellular signaling. We also implemented a chromatin immunoprecipitation approach to identify the binding sites of ETV6. This approach confirmed an interaction between ETV6 and SLCO2B1 gene, whose expression is also co-regulated with ETV6. This study suggests that ETV6 may contribute to leukemogenesis by deregulating the expression levels of several oncogenes.

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