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Ce mémoire rapporte deux approches de la synthèse des protéines à l'échelle de la molécule unique. Nous utilisons la microscopie de fluorescence en onde évanescente pour sonder l'activité traductionnelle de deux types de ribosomes. Les premiers, issus d'E. Coli (organisme procaryote), sont mutés afin de les marquer d'un nanocristal semiconducteur (QD). La fin de la traduction, qui correspond au décrochage du ribosome de l'ARNm lorsque celui-ci atteint le codon stop, est alors mise en évidence par la disparition du QD de la surface de l'échantillon. Le deuxième type de ribosome étudié est quant à lui extrait de cellules de lapins (organisme eucaryote) et est dit "sauvage", c'est à dire qu'il n'a pas subi de modification, tandis qu'un oligonucléotide marqué d'un fluorophore est hybridé à l'ARNm. L'activité hélicase du ribosome lui permettant de séparer deux brins complémentaires, l'oligonucléotide et donc le fluorophore disparaissent en même temps que le ribosome parcourt l'ARNm, permettant ainsi de sonder l'activité du ribosome. Nous donnons pour ces deux types de ribosomes une vitesse moyenne de la traduction dans des milieux contenant les facteurs de la traduction issus d'extraits cellulaires.La deuxième approche de la synthèse des protéines porte sur les propriétés de l'ARNm, support de l'information génétique codant pour la séquence des protéines. Nous avons développé un montage de pince optique permettant de manipuler et caractériser les propriétés mécaniques d'oligonucléotides, ainsi qu'une méthode originale de calibration de ce piège optique. La cohérence de nos mesures sur l'étirement d'un double brin d'ADN avec la littérature nous permettra de poursuivre notre étude sur la mesure des forces nécessaires pour ouvrir une structure secondaire de l'ARNm.

Les protéines sont responsables de pratiquement toutes les fonctions performées au sein du corps cellulaire et de ses alentours. Le contrôle de l’expression génique détermine l’abondance, la localisation et le moment de la production de protéines dans la cellule. Il s’agit de l’un des processus centraux à la régulation de la physiologie et du fonctionnement cellulaire. La moindre perte de balance dans ce complexe système engendre des conséquences majeures sur l’intégrité cellulaire, menant au développement de plusieurs maladies parfois incurables. La traduction de l’ARN messager en produit protéique constitue la dernière étape de l’expression génique. Elle est régulée de plusieurs façons, intrinsèques et extrinsèques à la séquence. Il s’agit également du processus cellulaire le plus coûteux en termes d’énergie. Le profilage des ribosomes (Ribo-Seq) figure parmi les récentes et prometteuses technologies ayant permis une meilleure étude des mécanismes de régulation de la traduction. Ces résultats contiennent toutefois la présence de variabilité et de bruits de nature infondée. Ce travail présente la mise en place d’une stratégie permettant la dissociation de signaux d’origine biologique de ceux ayant une origine technique. Ceci est effectué au travers de la mise en place de profiles consensus de densité ribosomale extrait d’une analyse comparative de plusieurs expériences de Ribo-Seq chez la levure (Saccharomyces cerevisiae). Les signaux biologiques dérivés par les profils consensus correspondent avec les signatures de pauses ribosomales connues, telles que les scores de repliements de l’ARNm et la charge des acides aminés. Épatamment, notre stratégie a également permis l’identification de séquences différentiellement transcrites (DT). Ces dernières jouent un rôle sur la cinétique de la phase d’élongation de la traduction, elles comportent notamment une surreprésentation de codons associés aux modifications des ARNs de transfert (tRNAs). Elles se retrouvent d’ailleurs impliquées dans le maintien de l’homéostase cellulaire, ayant une présence marquée chez des gènes prenants part aux mécanismes de biosynthèse de la macromolécule ribosomale ainsi que chez les ARNms aux sublocalisations cellulaires précises, notamment chez les mitochondries et le réticulum endoplasmique (ER). En plus de démontrer les possibilités de découvertes offertes par la technique du Ribo-Seq, cette étude présente une évidence de la nature dynamique et hétérogène du processus de traduction chez la cellule eucaryote. Elle démontre également le rôle de l’information directement encodée dans la séquence dans l’optimisation générale de l’homéostasie cellulaire. / Proteins are responsible for virtually all functions performed within and in the surroundings of a cell. The control of gene expression, which determines the amount, localisation and timing of protein production in the cell, is the central processes in the regulation of cellular physiology and function. Any disturbance in this complex system can generate important consequences on cellular integrity, sometimes leading to incurable diseases. The translation of messenger RNA into a protein product is the last step of the gene expression mechanism. It can be regulated in manifold ways, both intrinsically and extrinsically to the transcript sequence. It is also the costliest cellular process in terms of energy. Ribosome profiling (Ribo-Seq) is one of the recent and promising technologies making it possible to better study the mechanisms of translation regulation. Its results have however been shown to display variability in reproducibility and to contain noise of uncharted sources. This work presents the implementation of a strategy for dissociating signals of biological origin from those of technical origin. This is performed by the computation of a consensus profile of ribosomal density derived from a comparative analysis of several Ribo-Seq experiments in yeast (Saccharomyces cerevisiae). The biological signals derived by the consensus profiles correspond with signatures of known ribosomal pauses, such as mRNA folding strength and amino acid charges. Amazingly, our strategy also enabled the identification of differentially transcribed (DT) sequences. The latter have shown an over-representation of codons associated with modifications of transfer RNAs (tRNAs). They are also involved in the control of cellular homeostasis, exhibiting a marked presence in genes involved in ribosome biosynthesis as well as in mRNAs with precise translation sub-localization, particularly in mitochondria and the endoplasmic reticulum (ER). In addition to demonstrating the possibilities of discovery offered by the Ribo-Seq technique, this study also presents evidence of the dynamic and heterogeneous nature of the translation process in the eukaryotic cell. It also showcases its diverse regulatory mechanisms and the role of information directly encoded in the sequence in the general optimization of cellular homeostasis.

Malgré les thérapies anti-cancéreuses ciblées, beaucoup de patients récidivent à cause de la résistance aux traitements qui constitue un problème clinique majeur. Cette résistance est soutenue par la reprogrammation métabolique et traductionnelle. La synthèse des protéines oncogéniques fait appel au complexe d’initiation de la traduction eucaryote 4F (eIF4F), compris des facteurs : eIF4A, eIF4E et eIF4G. Il est ainsi possible de cibler la synthèse protéique spécifique aux cellules cancéreuses par des inhibiteurs de l’initiation de la traduction. Nous proposons que le ciblage de la machinerie traductionnelle, via l’inhibition du eIF4A (eIF4Ai), affecte particulièrement les cellules cancéreuses. Mais est-ce qu’il est en mesure d’atténuer la résistance aux inhibiteurs de kinase (IKs) et d’en empêcher l’adaptation et la reprogrammation métabolique? L’efficacité des eIF4Ais est vérifiée par l’évaluation de la croissance et de la mort cellulaire (Annexine V) dans des cellules de mélanome, sensibles et résistantes aux IKs. Celle-ci est accompagnée de la réduction de la synthèse protéique évaluée par profilage polysomique, de la baisse des cibles de l'eIF4Ai (BCL-2, CDK4...) quantifiées par western-blots, d’un important stress bioénergétique mesuré par Seahorse et du contrôle des principales voies métaboliques analysées par GCMS. L’analyse du profilage polysomique, de l’ARNseq et du métabolome permettront de mettre en évidence les réseaux qui soutiennent l’efficacité des eIF4Ais et les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’efficacité de cette thérapie. Ces derniers seront par la suite validés par des approches génétiques évaluant les principaux gènes et voies métaboliques qui y sont impliqués. Cette étude comblera de grosses lacunes dans les connaissances relatives aux mécanismes moléculaires qui soutiennent la résistance aux IKs afin d’améliorer leur efficacité en clinique. / Despite advances in research and development of targeted cancer therapies, many patients relapse due to treatment resistance. This is the case of melanoma resistant to BRAF inhibitors (BRAFi). 40-50% of melanoma cancer cells express the constitutively active oncoprotein BRAFV600E, leading to metabolic and translational reprogramming that is proposed to support resistance to cancer therapies. Studies have shown the importance of the eukaryotic translation initiation complex 4F (eIF4F), including factors: eIF4A, eIF4E and eIF4G, in the oncogenic proteins’ synthesis (e.g. growth factors, metabolic factors, etc.). The cancer cells translatome is distinct from the normal cells translatome. It is thus possible to target protein synthesis specific to cancer cells using molecules that inhibit translation initiation, the limiting phase in this process, affecting the cancer cells specifically. We propose that targeting the translational machinery via eIF4A inhibitors (eIF4Ai) would attenuate resistance to kinase inhibitors (KIs) and we seek to dissect the underlying molecular mechanisms. The efficacy of eIF4Ais in BRAFi sensitive and/or resistant melanoma is evaluated showing that eIF4Ais inhibit cell growth and induce melanoma cells death, using growth curves and FACS (Annexin_V). This is accompanied by a protein synthesis reduction, evaluated by polysome profiling showing a decrease in eIF4Ais treated cells and western-blots showing a decrease in translational targets of eIF4Ai (BCL-2, CDK4, etc.). A significant bioenergetic stress is measured by Seahorse and the control of the main metabolic pathways including glycolysis, TCA cycle and amino acids metabolism is analyzed by GCMS. Then the analysis of the translatome by polysome profiling and RNAseq and of the metabolome by GCMS/LCMS and Seahorse shed light on the translational networks that dictate metabolic reprogramming supporting eIF4Ai efficacy. Finally, the molecular mechanisms underlying the efficacy of eIF4Ai will be identified using genetic approaches to validate the main genes and metabolites and/or corresponding metabolic pathways involved in the response to eIF4Ai of the kinase inhibitor resistant melanoma. This study will fill large gaps in knowledge about the molecular mechanisms that support resistance to KIs in order to improve their clinical efficacy.