Les mutations sont la principale source de diversité sur laquelle agit la sélection pour permettre aux espèces de s'adapter. Les études de l'effet des mutations sur la survie et du taux de mutation sont donc essentielles pour mieux comprendre l'évolution. Par une approche d'expérience d'accumulation de mutations, nous étudions ces deux questions chez cinq modèles d'algues vertes (Ostreococcus tauri, O. mediterraneus, Bathycoccus prasinos, Micromonas pusilla, et Picochlorum RCC4223). Il est mis en évidence une diminution de la fitness au cours du temps en raison des mutations délétères, et une importante interaction génotype-environnement sur l'effet des mutations. Le taux de mutation varie aux échelles intra-génomique et inter-spécifique, avec deux principaux résultats: une augmentation du taux de mutation dans les régions non codantes et une augmentation du taux de mutation avec la taille du génome chez les eucaryotes et en fonction de l'écart à l'équilibre en GC du génome. Aussi, l'assemblage et l'annotation d'une picoalgue du genre Picochlorum permettent d'étudier le rôle des transferts horizontaux de gènes chez les Chlorophytes. / Mutations are the main source of diversity on which selection acts to allow species to adapt. Studies of the effect of mutations on survival and estimation of spontaneous mutation rates are essential to better understand evolution. Using mutation accumulation experimental approach, we investigated the issues of mutation effects and mutation rate in five models of green algae (Ostreococcus tauri, O. mediterraneus, Bathycoccus Prasinos, Micromonas pusilla, and Picochlorum RCC4223). It highlighted a decline in fitness over time because of deleterious mutations, and a significant genotype-environment interaction on the fitness effect of mutations. The mutation rate varies at inter-specific and intra-genomic scales, with two main results: a raise of the mutation rate in non-coding regions in accordance with trancriptional-coupled repair, and an increase of the mutation rate with an increase of the genome size in eukaryotes and the GC content deviation from the equilibrium. Also, a new Picochlorum genome is provided to investigate the role of horizontal gene transfer in the Chlorophyta group.

Les introns sont des portions de gènes transcrites dans l’ARN messager, mais retirées pendant l’épissage avant la synthèse des produits du gène. Chez les eucaryotes, on rencontre les introns splicéosomaux, qui sont retirés de l’ARN messager par des splicéosomes. Les introns permettent plusieurs processus importants, tels que l'épissage alternatif, la dégradation des ARNs messagers non-sens, et l'encodage d'ARNs fonctionnels. Leurs rôles nous interrogent sur l'influence de la sélection naturelle sur leur évolution. Nous nous intéressons aux mutations qui peuvent modifier les produits d'un gène en changeant les sites d'épissage des introns. Ces mutations peuvent influencer le fonctionnement d'un organisme, et constituent donc un sujet d'étude intéressant, mais il n'existe actuellement pas de logiciels permettant de les étudier convenablement. Le but de notre projet était donc de concevoir une méthode pour détecter et analyser les changements des sites d'épissage des introns splicéosomaux. Nous avons finalement développé une méthode qui repère les évènements évolutifs qui affectent les introns splicéosomaux dans un jeu d'espèces données. La méthode a été exécutée sur un ensemble d'espèces d'oomycètes. Plusieurs évènements détectés ont changé les sites d’épissage et les protéines, mais de nombreux évènements trouvés ont modifié les introns sans affecter les produits des gènes. Il manque à notre méthode une étape finale d'analyse approfondie des données récoltées. Cependant, la méthode actuelle est facilement reproductible et automatise l'analyse des génomes pour la détection des évènements. Les fichiers produits peuvent ensuite être analysés dans chaque étude pour répondre à des questions spécifiques. / Introns are portions of genes transcribed into messenger RNA, but removed during RNA splicing. In eukaryotes, they are called spliceosomal introns as they are removed by spliceosomes. Introns allow many important processes such as alternative splicing, nonsense-mediated decay and functional-RNA coding. These roles leads to the question of the influence of natural selection on evolution of introns. We focus on mutations that are able to change gene products by modifing introns splice sites. These mutations seems to be an interesting topic as they can affect proteins, but there is currently no software to study them properly. The aim of our project was to design a method to detect and analyze changes in splice sites of spliceosomal introns. We finally developed a method that locates the evolutionary events on splice sites of spliceosomal introns in a given species set. The method was performed on a set of oomycetes. Several detected events change splice sites and proteins, but there is also many events that seems to modify introns without affecting gene products. Our method lacks a final step for thorough analysis of the collected events. However, the current method is easily reusable and automates genome analysis for the detection of events. The resulting files can then be analyzed in each study to answer specific questions.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compréhension est un enjeu du domaine biomédical. Les études en molécule unique permettent d’observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènements asynchrones difficilement observables en mesure d’ensemble, tels la traduction de protéines.Cette thèse présente les premiers résultats en molécule unique sur la traduction par un ribosome eucaryote (mammifère). Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueurs fluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s’hybrider sur les séquences d’ARN traduites. L’observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en onde évanescente (TIRF), les ARN étant fixés sur une lamelle de microscope. En lisant l’ARN, le ribosome détache les marqueurs, et leurs instants de départs donnent des informations sur le passage du ribosome à différentes positions sur l’ARN. Cette méthode permet d’obtenir des données cinétiques sur un grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être interpolées par des lois de probabilité. Nous obtenons par cette méthode des mesures de la cinétique in vitro de l’élongation eucaryote et nous observons un délai dû à une initiation non-canonique. En effet, nous complexons le ribosome sur l’ARN grâce à une structure de type IRES. Dans nos conditions d’expérience, l’incorporation d’un acide aminé prend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieurs dizaines de secondes. Ces résultats ouvrent des perspectives d’étude cinétique dans des cas plus complexes tels le franchissement de structures secondaires de l’ARN. / Protein synthesis is a central mechanism of cellular life and understanding it is a challenge in biomedical research. Single molecule studies permit each reactive system to be observed individually and provide access to asynchronous events difficult to observe in ensemble experiments, such as protein translation.This thesis presents the first results on single molecule eukaryotic (mammalian) translation. We observe the translational systems using fluorophores linked to oligonucleotides annealed to the RNA translated sequences. The observation of these fluorophores is done by total internal reflection fluorescence microscopy, the RNA being attached to a microscope slide. When reading the RNA, the ribosome unzips the fluorescent oligonucleotides and their departure times provide information about the position of the ribosome at different locations on the RNA strand. This method provides kinetic data on a large number of parallel translational systems that can be fitted using probability laws.With this method, we measure the in vitro kinetics of eukaryotic elongation and we reveal a delay due to a non-canonical initiation of the ribosome. Indeed, in our experiments, the ribosome is initially complexed on an RNA structure called Internal Ribosome Entry Site. In our experimental conditions, each incorporation of an amino acid in the nascent protein takes about one second while the IRES structure induces a delay of several tens of seconds on the first incorporation. These results open new perspectives for kinetic studies in more complex configurations such as the passage of the ribosome through RNA secondary structures.

Le ribosome est un complexe macromoléculaire impliqué dans la synthèse protéique de toutes les cellules vivantes. L’étape d’élongation de cette synthèse est un processus itératif débutant par la sélection au sein du ribosome d’un ARNt aminoacylé suivie par le transfert du peptide du site P- vers le site A- et de la translocation de l’ARNm et de l’ARNt. Le facteur d’élongation 2 (eEF2), qui catalyse la translocation, est l’un des acteurs majeur de cette étape d’élongation chez les eucaryotes. Cependant le mécanisme par lequel eEF2 induit ce processus est encore aujourd’hui inconnu. Dans cette étude structurale, nous présentons la première structure à haute résolution (3.1 Å) du complexe de pré-translocation résolu par cristallographie aux rayons X. La structure obtenue nous a permis d’identifier les différents composants du complexe de translocation et de proposer le rôle de l’His699 et celui de la diphtamide, modification post-traductionnelle d’eEF2, lors du stade de pré-translocation. / Elongation is the longest stage of protein synthesis that takes place on the ribosome and represents a cycle that begins with an aminoacyl-tRNA selection followed by the catalysis of peptide transfer from the P- to the A-site and mRNA-tRNA translocation. Elongation factor 2 (eEF2) is one of the key player of elongation cycle in eukaryotes that catalyzes translocation of mRNA and tRNA on the ribosome. However the mechanism how eEF2 induces translocation on the ribosome is unknown. Current work investigates the structural aspect of protein synthesis machinery in eukaryotes. In particular we present first high resolution structure of functional pretranslocation complex solved at 3.1 A by X-ray crystallography. The obtained structure allowed us to see several features of translocation complex and to propose the role of His699 and post translational modification of eEF2 diphthamide during at pretranslocation stage.

Ces travaux de recherche, menés par une approche écosystémique et par la mise en œuvre de plusieurs méthodes moléculaires (TSA-FISH, qPCR et pyroséquençage), ont eu pour objectif (i) d'acquérir des données quantitatives concernant divers groupes eucaryotes unicellulaires présents dans la fraction picoplanctonique lacustre, (ii) d'explorer la dynamique spatiale et temporelle de ces groupes picoeucayotes tant en terme d'abondance que de diversité phylogénétique, et ceci à différentes échelles d'observation, et (iii) d' apporter une profondeur d'analyse supplémentaire de la diversité et de la structure des picoeucaryotes par l'utilisation de séquençage massif. L'utilisation de sondes oligonucléotidiques spécifiques a mis en évidence l'importance quantitative d'organismes photosynthétiques appartenant aux Chrysophycées, Chlorophycées, ainsi que la présence récurrente de groupes potentiellement parasites-saprophytes (Perkinsozoa, Fungi, LKM11). L'étude de la répartition spatiale (verticale) et géographique (trois lacs) de ces groupes par cette même approche a mis en lumière des différences d'abondance selon le statut trophique et la profondeur. Ainsi, la présence dans des proportions significatives d'organismes pigmentés (Chlorophycées, Haptophycées) en zone hypolimnique non éclairée nous a conduit à émettre l'hypothèse de l'importance de la mixotrophie au sein de la fraction picoplanctonique. Par ailleurs, l'utilisation du séquençage à haut débit a permis de révéler une importante diversité (1017 OTUs) 10 à 100 fois supérieure à celle décrite classiquement (clonage-séquençage de l'ADNr 18S). Son application à une échelle temporelle fine (2/3 jours) a permis de mettre en évidence d'importants et continuels remaniements au sein de la communauté picoeucaryote impliquant principalement les 21 OTUs appartenant au “core taxa” (>1% des séquences), et des taxa présentant des abondances intermédiaires (0,01-1% des séquences). A contrario, l'assemblage des taxa rares (<0,01%) composant plus de la moitié de la diversité décrite, s'avère quant à lui relativement stable au cours du temps. Les données acquises au cours de ce travail contribuent à alimenter les débats concernant les patrons de diversité microbienne et suggèrent la nécessité de mieux intégrer la notion de diversité fonctionnelle dans ces réflexions. / The studies reported in this manuscript aimed (i) to acquire quantitative data on various unicellulareukaryotes detected in the lacustrine picoplanktonic size fraction, (ii) to explore the spatial and temporaldynamics of these picoeucayotic groups both in terms of abundance and phylogenetic diversity, atdifferent scales of observation, and (iii) to bring an additional in-depth analysis of the picoeukaryotesdiversity and structure by using massive sequencing. These questions were investigated by an ecosystemicapproach, and, by coupling different molecular techniques (TSA-FISH, qPCR and pyrosequencing).Theuse of specific oligonucleotide probes highlighted the quantitative importance of photosyntheticorganisms (Chrysophyceae, Chlorophyceae), especially in summer, and the recurrent presence of putativeparasites-saprophytes groups (Perkinsozoa, Fungi, LKM11) was also confirmed. The study of the spatial(vertical) and geographical distribution (three lakes) of these groups showed differences in abundanceaccording to the trophic status and depth. The presence, in the hypolimnion, of pigmented organisms insignificant proportions (Chlorophyceae, Haptophyceae) suggested a mixotrophic activity exerted by thesegroups. Furthemore, the analyses of the picoeucaryote community by high-throughput sequencingrevealed an important diversity (1017 OTUs), 1 to 2 orders of magnitude larger than classically obtainedby cloning-sequencing of 18S rDNA. Its application at short time scales (2/3 days) revealed important andcontinual rearrangements in the picoeukaryote community which mainly involved 21 OTUs belonging tothe "core taxa" (> 1% of sequences), and taxa with intermediate abundances (0.01 to 1% of sequences).Conversely, the rare taxa community (<0.01%), which represented more than half of the describeddiversity, is in turn relatively stable over time.The data acquired contribute to the debate about thepatterns of microbial diversity. They suggest the need to better integrate the concept of functionaldiversity in these reflections.

Le ribosome est un complexe cellulaire impliqué dans la catalyse et la coordination des différentes étapes de la traduction de l’information génétique, des ARN messagers aux protéines. Avec une masse moléculaire avoisinant 3.3 méga daltons, le ribosome eucaryote est 40% plus volumineux que son homologue bactérien. Le premier volet de la thèse présente la structure cristallographique du ribosome eucaryote 80S de levure à haute résolution. Cette structure constitue une base solide pour l’étude de la synthèse des protéines chez les eucaryotes ainsi que pour le développement de nouveaux composés thérapeutiques. Le deuxième volet est consacré aux structures cristallographiques de deux familles d’inhibiteurs spécifiques des eucaryotes, les glutarimides et les trichothecenes, en complexe avec le ribosome. Ces inhibiteurs constituent de nouveaux outils pour sonder les fonctions du ribosome et contribueront aux développements de composés par des approches de structure‐based drug design. / The ribosome is large cellular machinery that catalyzes and coordinates every step required to translate the genetic information encoded in messenger RNAs into proteins. With a molecular weight of 3.3 mega daltons, the eukaryotic ribosome is 40% larger compared to its bacterial counterpart. The fist axis of thesis presents the crystal structure of the complete eukaryotic 80S ribosome from yeast at high resolution. This structure constitutes a unique framework for future investigations of protein synthesis in eukaryotes and development of new therapeutic agents. The second axis of the thesis presents the crystal structures of two distinct families of eukaryote‐specific inhibitors, the glutarimides and the trichothecenes, bound the eukaryotic ribosome. These inhibitors constitute new tools to probe the ribosome functions and a starting point for future structure‐based drug design.

Ce mémoire rapporte deux approches de la synthèse des protéines à l'échelle de la molécule unique. Nous utilisons la microscopie de fluorescence en onde évanescente pour sonder l'activité traductionnelle de deux types de ribosomes. Les premiers, issus d'E. Coli (organisme procaryote), sont mutés afin de les marquer d'un nanocristal semiconducteur (QD). La fin de la traduction, qui correspond au décrochage du ribosome de l'ARNm lorsque celui-ci atteint le codon stop, est alors mise en évidence par la disparition du QD de la surface de l'échantillon. Le deuxième type de ribosome étudié est quant à lui extrait de cellules de lapins (organisme eucaryote) et est dit "sauvage", c'est à dire qu'il n'a pas subi de modification, tandis qu'un oligonucléotide marqué d'un fluorophore est hybridé à l'ARNm. L'activité hélicase du ribosome lui permettant de séparer deux brins complémentaires, l'oligonucléotide et donc le fluorophore disparaissent en même temps que le ribosome parcourt l'ARNm, permettant ainsi de sonder l'activité du ribosome. Nous donnons pour ces deux types de ribosomes une vitesse moyenne de la traduction dans des milieux contenant les facteurs de la traduction issus d'extraits cellulaires.La deuxième approche de la synthèse des protéines porte sur les propriétés de l'ARNm, support de l'information génétique codant pour la séquence des protéines. Nous avons développé un montage de pince optique permettant de manipuler et caractériser les propriétés mécaniques d'oligonucléotides, ainsi qu'une méthode originale de calibration de ce piège optique. La cohérence de nos mesures sur l'étirement d'un double brin d'ADN avec la littérature nous permettra de poursuivre notre étude sur la mesure des forces nécessaires pour ouvrir une structure secondaire de l'ARNm. / We hereby report two approaches of the protein synthesis at the single molecule level. We use total internal reflection fluorescence microscopy to study the translation kinetic of two different types of ribosomes. The first ones, extracted from E. Coli (prokaryotic organism), are mutated in order to label them with a quantum dot (QD). The end of translation, which corresponds to the dissociation of the ribosome from the mRNA when the stop codon has been reached, is highlighted by the disparition of the QD from the surface. The second type of ribosome is extracted from rabbit cells (eukaryotic organism) and has not been modified (wild type), while a labeled oligonucleotide is hybridized on the mRNA. The helicase activity of the ribosome allowing the dissociation of two complementary strands, the oligonucleotide and so the label disappear at the same time while the ribosome moves along the mRNA and thus inform us about its activity. For these two types of ribosomes we measure their average translation speed in cell extracts.The second approach focuses on the properties of the mRNA, carrying the genetic code for the protein sequence. We developped an optical tweezer setup in order to manipulate and characterize the mechanical properties of nucleotides, as well as an original method to calibrate this optical trap. The consistency of our measurements with the litterature on the properties of a double stranded DNA will allow us to study secondary structures of mRNA.

Malgré des avancées considérables dans le domaine de l'annotation automatique de gènes, l'annotateur de référence reste l'expert humain. Nous avons donc développé Exogean, une méthode automatique qui suit le même processus que l'expert humain. Pour cela, Exogean utilise des multi-graphes orientés acycliques colorés (DACMs) où les sommets sont des objets biologiques, et les multiples couleurs d'arêtes entre les sommets sont des relations entre ces objets. Les DACMs sont parcourus suivant des chemins qui répliquent les règles suivies par l'expert humain lorsqu'il analyse les données.<br /><br />Le fait que les règles heuristiques utilisées par l'expert soient de différentes natures, soient susceptibles d'évoluer au cours du temps et s'appliquent à des ressources de types différents, a fait ressortir le besoin d'un cadre formel à la fois flexible, intuitif et générique pour l'annotation de gènes. Nous avons donc également développé DACMLang, un langage dédié à l'annotation de gènes fondé sur les DACMs.

La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compréhension est un enjeu du domaine biomédical. Les études en molécule unique permettent d'observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènements asynchrones difficilement observables en mesure d'ensemble, tels la traduction de protéines.Cette thèse présente les premiers résultats en molécule unique sur la traduction par un ribosome eucaryote (mammifère). Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueurs fluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s'hybrider sur les séquences d'ARN traduites. L'observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en onde évanescente (TIRF), les ARN étant fixés sur une lamelle de microscope. En lisant l'ARN, le ribosome détache les marqueurs, et leurs instants de départs donnent des informations sur le passage du ribosome à différentes positions sur l'ARN. Cette méthode permet d'obtenir des données cinétiques sur un grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être interpolées par des lois de probabilité. Nous obtenons par cette méthode des mesures de la cinétique in vitro de l'élongation eucaryote et nous observons un délai dû à une initiation non-canonique. En effet, nous complexons le ribosome sur l'ARN grâce à une structure de type IRES. Dans nos conditions d'expérience, l'incorporation d'un acide aminé prend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieurs dizaines de secondes. Ces résultats ouvrent des perspectives d'étude cinétique dans des cas plus complexes tels le franchissement de structures secondaires de l'ARN.