Two distinct compartmentalized isozymes of aldolase and triosephosphate isomerase were examined in the photoautotrophically and heterotrophically grown green alga Euglena gracilis. A comparison of the chemical and physical properties of the isozymes was carried out. Isozymes of phosphoglucose isomerase were isolated in homogeneous form from liver and muscle tissue of the fresh water catfish. The two organ-specific isozymes were essentially identical with respect to their molecular weights but exhibited different electrophoretic and kinetic properties, and amino acid compositions.

<p> In order to compare the mode of action of mutagens which cause mass conversion of green Euglena to colorless forms lacking chloroplasts, mutants were selected either for resistance to U.V. light or for resistance to N-methyl-N-nitroso-p-toluenesulfonamide (MNTS). The U.V. resistant mutants selected showed strong resistance to U.V. but the slow growth of these mutants indicated that they probably carried multiple lesions. Some of the problems inherent in selection techniques were explored and discussed. A mutant selected for resistance to MNTS was found to have the ability to convert MNTS to an innocuous compound N-methyl-p-toluenesulfonamide. Experiments using the MNTS resistant strain provide information concerning the mode of action of MNTS and the related mutagen nitrosoguanidine.</p> / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

Zur Risikoabschätzung anthropogener Uraneinträge in die Umwelt ist ein umfassendes Verständnis der ablaufenden Migrations- und Immobilisationsprozesse notwendig, da eine unkontrollierte Freisetzung von Uran z.B. beim Uranerzabbau zur Bedrohung für die Gesundheit von Mensch und Tier werden kann. Hierfür sind umfassende Studien zu den Wechselwirkungen von Uran mit verschiedenen Bestandteilen der Umwelt nötig. Dabei spielt neben geologischen Materialien besonders die Biosphäre, im Speziellen die Wechselwirkungen mit Mikroorganismen und Biofilmen, eine große Rolle. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung und Beschreibung natürlicher Biofilme aus realen Uran-kontaminierten Gebieten und deren Auswirkung auf die Uranmigration. Zur Untersuchung von Speziation und Lokalisation des Urans in den ausgewählten Biosystemen wurde in dieser Arbeit vorrangig ein gekoppeltes System aus konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie (CLSM) und laserinduzierter Fluoreszenzspektroskopie (LIFS) angewendet. Dieses System ermöglicht die räumlich aufgelöste Detektion von Fluoreszenzspektren der eingelagerten Uranakkumulationen in heterogenen biologischen Proben. Natürliche Biofilme von zwei urankontaminierten Standorten, dem ehemaligen Uranbergwerk in Königstein (Sachsen) und dem Gebiet der ehemaligen Aufstandsfläche der Gessenhalde (Thüringen), wurden in dieser Arbeit näher untersucht. An beiden Standorten wurden Biofilme bis zu mehreren Zentimetern Dicke unter den extremen Umgebungs-bedingungen in den Minenabwässern vorgefunden. Dabei repräsentieren die ausgewählten Proben typische Biofilmgemeinschaften aus sauren Minenabwässern und sind exemplarisch für potentiell auftretende Szenarien sowohl für untertage als auch über Tage gelegene Bergbauregionen. Die Wässer beider Standorte waren besonders durch sehr niedrige pH-Werte (Königstein: 2,6 – 3,1; Gessenwiese: 3,6 – 3,9), hohe Sulfat-konzentrationen (Königstein: (707 – 2520) mg/l; Gessenwiese: (3520 – 5887) mg/l), eine vorliegende Kontamination mit Uran (Königstein: (9,3 – 69,5) mg/l; Gessenwiese: (75,1 - 1450) µg/l) und eine Belastung mit zahlreichen weiteren Schwermetallen charakterisiert. An beiden Standorten konnte in den Minenwässern die hochmobile, gelöste Uranspezies Uranylsulfat (UO2SO4) als dominierend nachgewiesen werden. Untersuchungen zur Biofilmstruktur sowie möglichen Uraneinlagerungen und Ausfällungen mittels des CLSM/LIFS-Systems zeigten, besonders bei den Biofilmen aus Königstein, deren Mikroorganismen kaum Eigenfluoreszenz aufwiesen, Probleme mit der Visualisierung der Biofilmstruktur. Aufgrund der Instabilität vieler kommerzieller Fluoreszenzfarbstoffe bei niedrigen pH-Werten war eine gezielte Anfärbung der Mikroorganismen in den sauren Biofilmen nicht möglich, ohne den pH-Wert der Biofilmproben anzuheben, was die Probenchemie maßgeblich verändert. In Kooperation mit der Firma DYOMICS (Jena, Deutschland) wurden neue, kommerziell nicht erhältliche, säurestabile Farbstoffe erstmals hinsichtlich ihrer Eignung zur Anfärbung von Mikroorganismen in sauren Biofilmen ohne Veränderung des pH-Wertes sowie der sonstigen Probenchemie getestet. Die neuen Farbstoffe DY-601XL, V07-04118, V07-04146 und DY-613 zeigten eine Eignung für solche Färbungen, da sie eine intensive Anfärbung der Mikroorganismen bei niedrigen pH-Werten unter pH 3 – 4 herbeiführen und außerhalb des Emissionsbereiches von Uran fluoreszieren. Die Strukturen der phototrophen Biofilme der Gessenwiese, welche viele autofluoreszierende Mikroorganismen enthielten, konnten mittels CLSM/LIFS sehr gut dargestellt werden. Aufgrund der kontinuierlichen, ungepulsten Anregung zeigten sich starke Überlagerungen der Eigenfluoreszenzsignale der Probenbiologie mit den zu untersuchenden Uransignalen. Eine Auftrennung dieser Signale zur spezifischen Urananalytik war bei den Urankonzentrationen, wie sie in Biofilmen aus natürlichen, durch saure Minenabwässer belasteten Gebieten vorkamen, aufgrund verschiedener technischer Limitationen des gekoppelten CLSM/LIFS-Systems nicht möglich. Um den umweltrelevanten Charakter dieser Studien beizubehalten, wurden die natürlichen Biofilmproben jedoch nicht künstlich mit erhöhten Urankonzentrationen versetzt, stattdessen wurde besonderer Wert auf die Beschreibung der realen Wechselwirkungen mit originalen, unveränderten Biofilmen gelegt. Aufgrund der Komplexität der natürlichen Biofilmproben sollten die Wechselwirkungen von Uran mit Monokulturen eines ausgewählten eukaryotischen Einzellers, welcher typisch in sauren Uran- und schwermetallbelasteten Wässern wie z.B. in den Biofilmen von der Gessenwiese anzutreffenden ist, detaillierter untersucht werden. Erstmalig wurden hierzu in dieser Arbeit die Wechselwirkungen von Uran mit Euglena mutabilis Zellen untersucht. Dabei wurde die Fähigkeit der Euglena-Zellen zur Bioakkumulation des Urans im pH-Wertbereich 3 – 6 in den Hintergrundmedien Natriumperchlorat (9 g/l) oder Natriumsulfat (3,48 g/l) an lebenden Zellen untersucht. Uran wurde hierbei in einer für saure Minenabwässer relevanten Konzentration von 0,01 mM in der Ausgangslösung vorgelegt. Unabhängig vom Medium konnte bei sauren pH-Werten um pH 3 – 4 über 90 % des vorgelegten Urans aus den Probelösungen abgetrennt werden. Vor dem Hintergrund einer möglichen Anwendung dieser Zellen zur Reinigung kontaminierter saurer Minenabwässer ist die hohe Immobilisierungsrate für Uran speziell im sauren pH-Bereich besonders attraktiv. Lebende, metabolisch aktive Zellen zeigten sich innerhalb dieser Studie in der Lage, größere Mengen Uran zu binden als tote Zellbiomasse. So wurden in Bioakkumulations-versuchen mit erhöhten Urankonzentrationen von 0,5 mM maximale Uranakkumulationen an den Euglena-Zellen von (33,16 ± 0,2) mg/g für lebende Zellen und (12,97 ± 0,7) mg/g für tote Zellen gemessen. An toten Zellen findet dabei ein reiner Biosorptionsprozess des Urans an die vorhandenen Bindungsstellen der Zellen statt, welcher innerhalb weniger Minuten (< 20 min) abgeschlossen ist. Bei lebenden, metabolisch aktiven Zellen wurde deutlich mehr Zeit benötigt bis die gleiche Uranmenge wie bei toten Zellen aufgenommen wurde. Dies ist ein Indiz für einen anfänglichen Abwehrmechanismus und einen insgesamt aktiven Umgang der lebenden Zellen mit dem Uran. Bei Bioakkumulationsversuchen an Euglena mutabilis Zellen unter Verwendung von realen, sauren, urankontaminierten Wässern wurden signifikant schlechtere Immobilisations-raten für Uran detektiert ((0 – 3,6) mg U/gEuglenaBtm). Ursache hierfür ist der Wettbewerb des Urans mit den vielfältigen anderen Inhaltstoffen in den natürlichen Wässern um die verfügbaren Sorptionsstellen an den Zellen. Dies verdeutlicht die Schwierigkeit, Erkenntnisse aus Laborexperimenten direkt auf natürliche Prozesse anzuwenden und verdeutlicht die Notwendigkeit in zukünftigen Untersuchungen, auf eine entsprechende Umweltrelevanz der Versuchsbedingungen zu achten. Die Speziation des an den Euglena-Zellen akkumulierten Urans, wurde mittels laserinduzierter Fluoreszenzspektroskopie (LIFS) untersucht. Es zeigte sich, dass unabhängig vom Hintergrundmedium, Lebenszustand und pH-Wert eine vergleichbare neue Uranspezies an den Zellen gebildet wird. Die detektierten Emissionsmaxima des Uranfluoreszenzsignals, gemessen an den Euglena-Zellen lagen bei 478,4 nm, 495,6 nm, 517,1 nm, 540,4 nm, 565,3 nm, 590,1 nm. Durch den Vergleich der Daten aus den LIFS-Messungen mit Referenzwerten, konnte die gebildete Uranspezies auf eine Anbindung durch (organo)phosphatische und/oder carboxylische funktionelle Gruppen eingegrenzt werden. Mit Hilfe der zeitaufgelösten FT-IR-Spektroskopie wurde erstmals der Biosorptionsprozess direkt an der Grenzfläche zwischen Euglena-Zellen und Uranlösung untersucht. Dabei konnte die carboxylische Anbindung des Urans an toten Zellen nachgewiesen werden. Ein Ausschluss der (organo)phosphatischen Komplexierung konnte jedoch mit dieser Methode nicht geführt werden. Untersuchungen zur Lokalisation des Urans an bzw. in den Zellen, mittels der gekoppelten CLSM/LIFS-Technik zeigten erstmals ein Indiz für die intrazelluläre Akkumulation von Uran in den lebenden Zellen. Ergänzende TEM/EDX-Messungen bestätigten die intrazelluläre Aufnahme und belegen eine Akkumulation in runden bis ovalen Zellorganellen, bei denen es sich vermutlich um Vakuolen oder Vakuolen-ähnliche Vesikel handelt. An den toten Zellen konnte mit diesen Methoden kein Uran detektiert werden. Dies lässt auf eine passive, homogen verteilte Biosorption des Urans an die verfügbaren Bindungsplätze an der Zelloberfläche der toten Biomasse schließen. Die Ergebnisse dieser Arbeit leisten einen Beitrag zum Prozessverständnis der Wechselwirkungen von Uran mit Biofilmen und speziell mit Euglena mutabilis Zellen. Auf Grundlage der erhaltenen Erkenntnisse können Risiken in natürlichen kontaminierten Gebieten besser eingeschätzt werden und Vorhersagen zum Migrationsverhalten des Urans entsprechend der vorliegenden Bedingungen optimiert werden.

Zur Risikoabschätzung anthropogener Uraneinträge in die Umwelt ist ein umfassendes Verständnis der ablaufenden Migrations- und Immobilisationsprozesse notwendig, da eine unkontrollierte Freisetzung von Uran z.B. beim Uranerzabbau zur Bedrohung für die Gesundheit von Mensch und Tier werden kann. Hierfür sind umfassende Studien zu den Wechselwirkungen von Uran mit verschiedenen Bestandteilen der Umwelt nötig. Dabei spielt neben geologischen Materialien besonders die Biosphäre, im Speziellen die Wechselwirkungen mit Mikroorganismen und Biofilmen, eine große Rolle. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung und Beschreibung natürlicher Biofilme aus realen Uran-kontaminierten Gebieten und deren Auswirkung auf die Uranmigration. Zur Untersuchung von Speziation und Lokalisation des Urans in den ausgewählten Biosystemen wurde in dieser Arbeit vorrangig ein gekoppeltes System aus konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie (CLSM) und laserinduzierter Fluoreszenzspektroskopie (LIFS) angewendet. Dieses System ermöglicht die räumlich aufgelöste Detektion von Fluoreszenzspektren der eingelagerten Uranakkumulationen in heterogenen biologischen Proben. Natürliche Biofilme von zwei urankontaminierten Standorten, dem ehemaligen Uranbergwerk in Königstein (Sachsen) und dem Gebiet der ehemaligen Aufstandsfläche der Gessenhalde (Thüringen), wurden in dieser Arbeit näher untersucht. An beiden Standorten wurden Biofilme bis zu mehreren Zentimetern Dicke unter den extremen Umgebungs-bedingungen in den Minenabwässern vorgefunden. Dabei repräsentieren die ausgewählten Proben typische Biofilmgemeinschaften aus sauren Minenabwässern und sind exemplarisch für potentiell auftretende Szenarien sowohl für untertage als auch über Tage gelegene Bergbauregionen. Die Wässer beider Standorte waren besonders durch sehr niedrige pH-Werte (Königstein: 2,6 – 3,1; Gessenwiese: 3,6 – 3,9), hohe Sulfat-konzentrationen (Königstein: (707 – 2520) mg/l; Gessenwiese: (3520 – 5887) mg/l), eine vorliegende Kontamination mit Uran (Königstein: (9,3 – 69,5) mg/l; Gessenwiese: (75,1 - 1450) µg/l) und eine Belastung mit zahlreichen weiteren Schwermetallen charakterisiert. An beiden Standorten konnte in den Minenwässern die hochmobile, gelöste Uranspezies Uranylsulfat (UO2SO4) als dominierend nachgewiesen werden. Untersuchungen zur Biofilmstruktur sowie möglichen Uraneinlagerungen und Ausfällungen mittels des CLSM/LIFS-Systems zeigten, besonders bei den Biofilmen aus Königstein, deren Mikroorganismen kaum Eigenfluoreszenz aufwiesen, Probleme mit der Visualisierung der Biofilmstruktur. Aufgrund der Instabilität vieler kommerzieller Fluoreszenzfarbstoffe bei niedrigen pH-Werten war eine gezielte Anfärbung der Mikroorganismen in den sauren Biofilmen nicht möglich, ohne den pH-Wert der Biofilmproben anzuheben, was die Probenchemie maßgeblich verändert. In Kooperation mit der Firma DYOMICS (Jena, Deutschland) wurden neue, kommerziell nicht erhältliche, säurestabile Farbstoffe erstmals hinsichtlich ihrer Eignung zur Anfärbung von Mikroorganismen in sauren Biofilmen ohne Veränderung des pH-Wertes sowie der sonstigen Probenchemie getestet. Die neuen Farbstoffe DY-601XL, V07-04118, V07-04146 und DY-613 zeigten eine Eignung für solche Färbungen, da sie eine intensive Anfärbung der Mikroorganismen bei niedrigen pH-Werten unter pH 3 – 4 herbeiführen und außerhalb des Emissionsbereiches von Uran fluoreszieren. Die Strukturen der phototrophen Biofilme der Gessenwiese, welche viele autofluoreszierende Mikroorganismen enthielten, konnten mittels CLSM/LIFS sehr gut dargestellt werden. Aufgrund der kontinuierlichen, ungepulsten Anregung zeigten sich starke Überlagerungen der Eigenfluoreszenzsignale der Probenbiologie mit den zu untersuchenden Uransignalen. Eine Auftrennung dieser Signale zur spezifischen Urananalytik war bei den Urankonzentrationen, wie sie in Biofilmen aus natürlichen, durch saure Minenabwässer belasteten Gebieten vorkamen, aufgrund verschiedener technischer Limitationen des gekoppelten CLSM/LIFS-Systems nicht möglich. Um den umweltrelevanten Charakter dieser Studien beizubehalten, wurden die natürlichen Biofilmproben jedoch nicht künstlich mit erhöhten Urankonzentrationen versetzt, stattdessen wurde besonderer Wert auf die Beschreibung der realen Wechselwirkungen mit originalen, unveränderten Biofilmen gelegt. Aufgrund der Komplexität der natürlichen Biofilmproben sollten die Wechselwirkungen von Uran mit Monokulturen eines ausgewählten eukaryotischen Einzellers, welcher typisch in sauren Uran- und schwermetallbelasteten Wässern wie z.B. in den Biofilmen von der Gessenwiese anzutreffenden ist, detaillierter untersucht werden. Erstmalig wurden hierzu in dieser Arbeit die Wechselwirkungen von Uran mit Euglena mutabilis Zellen untersucht. Dabei wurde die Fähigkeit der Euglena-Zellen zur Bioakkumulation des Urans im pH-Wertbereich 3 – 6 in den Hintergrundmedien Natriumperchlorat (9 g/l) oder Natriumsulfat (3,48 g/l) an lebenden Zellen untersucht. Uran wurde hierbei in einer für saure Minenabwässer relevanten Konzentration von 0,01 mM in der Ausgangslösung vorgelegt. Unabhängig vom Medium konnte bei sauren pH-Werten um pH 3 – 4 über 90 % des vorgelegten Urans aus den Probelösungen abgetrennt werden. Vor dem Hintergrund einer möglichen Anwendung dieser Zellen zur Reinigung kontaminierter saurer Minenabwässer ist die hohe Immobilisierungsrate für Uran speziell im sauren pH-Bereich besonders attraktiv. Lebende, metabolisch aktive Zellen zeigten sich innerhalb dieser Studie in der Lage, größere Mengen Uran zu binden als tote Zellbiomasse. So wurden in Bioakkumulations-versuchen mit erhöhten Urankonzentrationen von 0,5 mM maximale Uranakkumulationen an den Euglena-Zellen von (33,16 ± 0,2) mg/g für lebende Zellen und (12,97 ± 0,7) mg/g für tote Zellen gemessen. An toten Zellen findet dabei ein reiner Biosorptionsprozess des Urans an die vorhandenen Bindungsstellen der Zellen statt, welcher innerhalb weniger Minuten (< 20 min) abgeschlossen ist. Bei lebenden, metabolisch aktiven Zellen wurde deutlich mehr Zeit benötigt bis die gleiche Uranmenge wie bei toten Zellen aufgenommen wurde. Dies ist ein Indiz für einen anfänglichen Abwehrmechanismus und einen insgesamt aktiven Umgang der lebenden Zellen mit dem Uran. Bei Bioakkumulationsversuchen an Euglena mutabilis Zellen unter Verwendung von realen, sauren, urankontaminierten Wässern wurden signifikant schlechtere Immobilisations-raten für Uran detektiert ((0 – 3,6) mg U/gEuglenaBtm). Ursache hierfür ist der Wettbewerb des Urans mit den vielfältigen anderen Inhaltstoffen in den natürlichen Wässern um die verfügbaren Sorptionsstellen an den Zellen. Dies verdeutlicht die Schwierigkeit, Erkenntnisse aus Laborexperimenten direkt auf natürliche Prozesse anzuwenden und verdeutlicht die Notwendigkeit in zukünftigen Untersuchungen, auf eine entsprechende Umweltrelevanz der Versuchsbedingungen zu achten. Die Speziation des an den Euglena-Zellen akkumulierten Urans, wurde mittels laserinduzierter Fluoreszenzspektroskopie (LIFS) untersucht. Es zeigte sich, dass unabhängig vom Hintergrundmedium, Lebenszustand und pH-Wert eine vergleichbare neue Uranspezies an den Zellen gebildet wird. Die detektierten Emissionsmaxima des Uranfluoreszenzsignals, gemessen an den Euglena-Zellen lagen bei 478,4 nm, 495,6 nm, 517,1 nm, 540,4 nm, 565,3 nm, 590,1 nm. Durch den Vergleich der Daten aus den LIFS-Messungen mit Referenzwerten, konnte die gebildete Uranspezies auf eine Anbindung durch (organo)phosphatische und/oder carboxylische funktionelle Gruppen eingegrenzt werden. Mit Hilfe der zeitaufgelösten FT-IR-Spektroskopie wurde erstmals der Biosorptionsprozess direkt an der Grenzfläche zwischen Euglena-Zellen und Uranlösung untersucht. Dabei konnte die carboxylische Anbindung des Urans an toten Zellen nachgewiesen werden. Ein Ausschluss der (organo)phosphatischen Komplexierung konnte jedoch mit dieser Methode nicht geführt werden. Untersuchungen zur Lokalisation des Urans an bzw. in den Zellen, mittels der gekoppelten CLSM/LIFS-Technik zeigten erstmals ein Indiz für die intrazelluläre Akkumulation von Uran in den lebenden Zellen. Ergänzende TEM/EDX-Messungen bestätigten die intrazelluläre Aufnahme und belegen eine Akkumulation in runden bis ovalen Zellorganellen, bei denen es sich vermutlich um Vakuolen oder Vakuolen-ähnliche Vesikel handelt. An den toten Zellen konnte mit diesen Methoden kein Uran detektiert werden. Dies lässt auf eine passive, homogen verteilte Biosorption des Urans an die verfügbaren Bindungsplätze an der Zelloberfläche der toten Biomasse schließen. Die Ergebnisse dieser Arbeit leisten einen Beitrag zum Prozessverständnis der Wechselwirkungen von Uran mit Biofilmen und speziell mit Euglena mutabilis Zellen. Auf Grundlage der erhaltenen Erkenntnisse können Risiken in natürlichen kontaminierten Gebieten besser eingeschätzt werden und Vorhersagen zum Migrationsverhalten des Urans entsprechend der vorliegenden Bedingungen optimiert werden.

4 Abstract The main goal of my thesis was to create our own proposals for laboratory work in biology of unicellular organisms (Protista). I designed the laboratory tasks, so that they can be mastered by the pupils of sixth year of primary school. Creating the proposals for laboratory exercises was preceded by the work in the laboratory at Charles University in Prague, Faculty of Education, the Department of Biology and Environmental Studies. In the laboratory, I verified the methods of cultivation of selected representatives of ciliates (Paramecium caudatum), amoebae (Amoeba proteus) and euglenids (Euglena gracilis) and selected methods of dyeing their different organels. Key words: protists, Paramecium caudatum, Amoeba proteus, Euglena gracilis, cultivation, dying

Neste estudo foram isolados e caracterizados flagelados de 20 amostras de solo e água do Brasil classificados no gênero Euglena por parâmetros taxonômicos tradicionais, e distribuídos em 5 grupos de acordo com características morfológicas. Análises filogenéticas do gene SSUrDNA das 20 amostras resultou em 25 seqüências posicionadas nos grupos A2 e A3 do gênero Euglena definidos em estudos anteriores, separando as seqüências obtidas em 7 clados distintos, revelando uma maior diversidade que a obtida por parâmetros taxonômicos tradicionais. A fim de resolver os relacionamentos intra-específicos do grupo A3, realizamos uma análise filogenética restrita deste grupo, que apresentou árvores congruentes e subclados bem suportados. Representantes de cada espécie foram analisados por microscopia eletrônica de varredura, revelando dois padrões principais de estrias e poros da película. Os isolados caracterizados neste estudo são os primeiros do Brasil estabelecidos em cultura, validados por análises filogenéticas e morfologicamente caracterizados. / In this study we isolated and characterized flagellates from 20 soil and water samples of Brazil, classified in the genus Euglena based on traditional taxonomic parameters and distributed in 5 groups according to morphological characteristics. Phylogenetic analyses of the SSUrDNA of the 20 samples resulted in 25 sequences that where positioned in previously defined groups A2 and A3 of the genus Euglena, separating the obtained sequences in 7 distinct clades, revealing a larger diversity than defined by traditional taxonomic parameters. To better resolve the intra-specific relationships of group A3, we conducted a phylogenetic analyses restricted to this group, generating congruent trees and well supported sub-clades. A representative of each species was selected and analyzed by scanning electron microscopy, revealing two major patterns of strip and pellicle pores. The isolates characterized in this study are the first in Brazil to be established in culture, validated by phylogenetic analyses and morphologically characterized.

L’arsenic est naturellement présent dans la croûte terrestre et de manière abondante dans certains environnements. Si cet élément est toxique pour la plupart des formes de vies, des micro-organismes développent différents mécanismes pour y faire face. Ce travail porte sur l’étude de ces processus impliquant à la fois des réponses individuelles et des interactions entre organismes appartenant à des domaines différents du vivant. Des approches de génomique descriptive et fonctionnelle mettent ainsi en évidence différents mécanismes adaptatifs et fonctions cellulaires impliqués dans la réponse à l’arsenic d’une bactérie et d’un protiste photosynthétique, Rhizobium sp. NT-26 et Euglena mutabilis, tous deux particulièrement résistants à cet élément. Par ailleurs, tandis que Rhizobium sp. NT-26 semble avoir perdu sa capacité à interagir avec les plantes, E. mutabilis fait au contraire partie intégrante d’une communauté microbienne incluant différentes bactéries et bénéficie de leur activité. / Arsenic naturally occurs in earth crust and is particularly abundant in some environments. While this element is toxic for most forms of life, micro-organisms have evolved different mechanisms to cope with it. This work deals with these different processes involving individual responses as well as interactions between organisms belonging to different domains of life. Descriptive and functional genomics approaches highlight several adaptative mechanisms and cellular functions involved in the arsenic response of a bacterium and a photosynthetic protist, Rhizobium sp. NT-26 and Euglena mutabilis, respectively, both being particularly resistant to arsenic. Also, while Rhizobium sp. NT-26 seems to have lost its ability to interact with plants, E. mutabilis is on the contrary an integral part of a microbial community including different bacteria and benefits from their activity.

Neste estudo foram isolados e caracterizados flagelados de 20 amostras de solo e água do Brasil classificados no gênero Euglena por parâmetros taxonômicos tradicionais, e distribuídos em 5 grupos de acordo com características morfológicas. Análises filogenéticas do gene SSUrDNA das 20 amostras resultou em 25 seqüências posicionadas nos grupos A2 e A3 do gênero Euglena definidos em estudos anteriores, separando as seqüências obtidas em 7 clados distintos, revelando uma maior diversidade que a obtida por parâmetros taxonômicos tradicionais. A fim de resolver os relacionamentos intra-específicos do grupo A3, realizamos uma análise filogenética restrita deste grupo, que apresentou árvores congruentes e subclados bem suportados. Representantes de cada espécie foram analisados por microscopia eletrônica de varredura, revelando dois padrões principais de estrias e poros da película. Os isolados caracterizados neste estudo são os primeiros do Brasil estabelecidos em cultura, validados por análises filogenéticas e morfologicamente caracterizados. / In this study we isolated and characterized flagellates from 20 soil and water samples of Brazil, classified in the genus Euglena based on traditional taxonomic parameters and distributed in 5 groups according to morphological characteristics. Phylogenetic analyses of the SSUrDNA of the 20 samples resulted in 25 sequences that where positioned in previously defined groups A2 and A3 of the genus Euglena, separating the obtained sequences in 7 distinct clades, revealing a larger diversity than defined by traditional taxonomic parameters. To better resolve the intra-specific relationships of group A3, we conducted a phylogenetic analyses restricted to this group, generating congruent trees and well supported sub-clades. A representative of each species was selected and analyzed by scanning electron microscopy, revealing two major patterns of strip and pellicle pores. The isolates characterized in this study are the first in Brazil to be established in culture, validated by phylogenetic analyses and morphologically characterized.

Investigations concerning the cellular response of tumor tissue to treatment with dimethyl sulfoxide and hematoxylin have not been reported. To establish the response of neoplastic tissue and cells to this combination of agents, this study was undertaken to determine the effects of dimethyl sulfoxide and hematoxylin on a transplantable lymphosarcoma in mice.

Thesis (MSc (Plant Biotechnology))--University of Stellenbosch, 2007. / The photosynthetic protist Euglena gracilis synthesizes a storage carbohydrate named paramylon, a glucan consisting only of β-(1-3)-glycosidic linkages. The enzyme that produces paramylon is a glycosyltransferase commonly known as paramylon synthase (EC 2.4.1.34; UDP-glucose: 1,3-β-D-glucan 3-β-D-glucosyl transferase). This enzyme uses UDP-glucose as its main substrate. In 2001, Bäumer et al. isolated and partially purified paramylon synthase, but never presented any sequence information. Hence, the main aim of this project was to isolate and characterize the gene(s) coding for the paramylon synthase. Different approaches were taken in order to isolate and characterize the gene(s). In the first part of the study molecular techniques were used to try and identify the gene. The two methods used were library screening and PCR amplification. Different libraries were screened using either functional staining or an affinity probe. The second method concentrated on the use of degenerate oligonucleotides, based on the amino acid sequences of conserved regions from known β-(1-3)-glucan synthase genes from various organisms, to PCR amplify the gene sequence from Euglena. These approaches were not successful in the isolation of the gene(s). In the second part of the study protein purification techniques were used in an attempt to obtain de novo protein sequence from the purified paramylon synthase enzyme. Several protein purification techniques were tried with the most successful being preparative ultra centrifugation followed either by sucrose density centrifugation or product entrapment (a type of affinity purification). These resulted in partial purification of the paramylon synthase protein. The partially purified proteins were separated using polyacrylamide gel electrophoresis, and the polypeptides able to bind the precursor, UDP-glucose, were identified using a radiolabeled isotope of UDP-glucose. These polypeptides were subjected to LC-MS-MS in order to obtain sequence information from them. One tryptic fragment showed high homology to β-(1,3)-glucan synthase genes from different yeasts.