Mucor circinelloides es un hongo filamentoso utilizado como modelo para el estudio del mecanismo de silenciamiento génico mediado por RNA. Una vez caracterizado dicho mecanismo y los principales genes implicados, se pretende determinar el papel de la ruta de silenciamiento en la regulación de genes endógenos, así como identificar otros posibles elementos genéticos que participen en dicha ruta. Para ello, se plantean los siguientes objetivos concretos: 1. Identificación del gen implicado en la eliminación de la cadena pasajera de los siRNAs y estudio de la existencia de interacciones entre las proteínas de la maquinaria de silenciamiento. 2. Estudio de la participación de Ago-1 en la biogénesis de los distintos tipos de ex-siRNAs de M. circinelloides. 3. Identificación de los genes regulados por el mecanismo de silenciamiento mediante el análisis de los perfiles transcriptómicos de la estirpe silvestre y de mutantes en genes de silenciamiento. 4. Caracterización fenotípica detallada de los mutantes afectados en la ruta de silenciamiento, para identificar los procesos celulares regulados mediante dicho mecanismo. Para desarrollar estos objetivos se ha utilizado la siguiente metodología: 1. La identificación de otros genes implicados en el mecanismo de silenciamiento se llevó a cabo mediante la disrupción de los genes candidatos por recombinación homóloga y su posterior análisis fenotípico. Para ello, se utilizaron técnicas de amplificación de DNA mediante PCR, clonación, transformación de protoplastos e hibridaciones tipo Southern y Northern. Las interacciones entre proteínas de la maquinaria de silenciamiento se analizaron mediante el sistema de doble híbrido de levaduras. 2. La participación de Ago-1 en la biogénesis de los ex-siRNAs se analizó mediante la secuenciación de librerías de sRNAs. Ago-1 fue purificada mediante FLPC para el aislamiento y secuenciación de los sRNAs unidos a ella. Los datos obtenidos fueron validados experimentalmente mediante hibridaciones tipo Northern. 3. El análisis transcriptómico de las distintas estirpes se realizó mediante hibridaciones con micromatrices y secuenciación de RNA (RNA-seq). 4. El análisis fenotípico de los mutantes en genes de silenciamiento incluyó la cuantificación de la producción de esporas vegetativas y zigosporas, el estudio de la respuesta frente a diferentes situaciones de estrés, la cuantificación del proceso de autolisis y el análisis de la virulencia en Galleria mellonella. Los resultados obtenidos permitieron alcanzar las siguientes conclusiones: 1. El gen qip es esencial para el eficaz funcionamiento del mecanismo de silenciamiento génico inducido por transgenes, sugiriendo un papel en la activación del complejo RISC. No se detectaron interacciones entre proteínas de la maquinaria de silenciamiento de M. circinelloides, lo que podría deberse a la necesidad de modificaciones post-traduccionales específicas de las proteínas de silenciamiento o a la formación de complejos multiproteicos. 2. El gen ago-1 está implicado en el mecanismo de silenciamiento endógeno de M. circinelloides, siendo necesario para la biogénesis y/o estabilidad de las cuatro clases de ex-siRNAs. Las clases I y II de ex-siRNAs se unen específicamente a Ago-1 para llevar a cabo la identificación y degradación de sus mensajeros diana. Las clases III y IV son generadas por una ruta de silenciamiento no canónica, en la que se requiere la participación de Ago-1, pero no la unión específica de estos ex-siRNAs a dicha proteína. 3. Los análisis transcriptómicos ponen de manifiesto que el mecanismo de silenciamiento posee un papel modulador de la expresión de un gran número de genes endógenos a lo largo del crecimiento vegetativo. Las funciones de las proteínas cifradas por estos genes están relacionadas con la biogénesis y modificación de la pared celular, el control de la división celular y el crecimiento, metabolismo de carbohidratos, envejecimiento celular o respuesta a estrés. 4. La ruta canónica de silenciamiento está implicada en la regulación del proceso de esporulación vegetativa y en la activación del programa de autolisis inducido por estrés nutricional. La regulación del desarrollo sexual debe ser llevada a cabo por una ruta no canónica independiente de Dicer. Los experimentos de patogénesis no revelan una clara participación del mecanismo de silenciamiento en el proceso de virulencia, aunque no se descarta una respuesta diferencial en otros organismos modelo, como el ratón. / Regulation of endogenous gene expression by the RNA silencing mechanism in Mucor circinelloides. Mucor circinelloides is a filamentous fungus used as a model for studying the RNA silencing mechanism. Once the mechanism and main genes involved were characterized, the next goal is to determine the role of the RNA silencing pathway in the regulation of endogenous genes, and to identify other possible genetic elements that participate in the pathway. To do this, the following specific objectives were proposed: 1. Identification of the gene involved in the removal of the passenger strand of siRNAs duplex, and analysis of the interactions between silencing proteins. 2. Study of the participation of Ago-1 in the biogenesis of different classes of ex-siRNAs in M. circinelloides. 3. Identification the genes regulated by the RNA silencing mechanism by analyzing the transcriptome of the wild type and silencing mutants. 4. Phenotypic characterization of mutants affected in the silencing pathway to identify the cellular processes regulated by this mechanism. To develop these objectives the following methodology has been used: 1. Identification of other genes involved in the silencing pathway was addressed by disrupting candidate genes by homologous recombination and subsequent phenotypic analysis. To this end, PCR amplification of DNA fragments, cloning, transformation of protoplasts and Southern and Northern blot hybridizations were carry out. The study of interaction between RNA silencing proteins was performed using the yeast two-hybrid system. 2. cDNA libraries of sRNAs were generated and sequenced to analyze the participation of Ago-1 in the biogenesis of ex-siRNAs. Ago-1 was purified by FPLC for the isolation and sequencing of Ago-1 bound sRNAs. The sequencing data were validated by Northern-blot experiments. 3. Transcriptomic analysis of the different strains was carried out by hybridization methods using microarrays and RNA sequencing (RNA-seq). 4. Phenotypic analysis of silencing mutants included quantification of vegetative spore and zygospores, study of the response to different stresses, quantification of the autolysis process and virulence analysis of the different silencing mutants in Galleria mellonella. The results allowed reaching the following conclusions: 1. The qip gene is essential for transgene-induced gene silencing, suggesting a role in the activation of the RISC complex. No interactions were detected between proteins involved in the RNA silencing pathway of M. circinelloides. This could be due to the need for specific post-translational modifications of silencing proteins or the formation of multiprotein complexes. 2. Ago-1 is involved in endogenous RNA silencing in M. circinelloides, and it is necessary for the biogenesis and / or stability of all ex–siRNAs classes. Classes I and II of ex-siRNAs specifically bind to Ago-1 for the identification and degradation of their mRNA targets. Classes III and IV are generated by a non-canonical silencing mechanism that requires the participation of Ago-1, but there is not specific binding of these ex-siRNAs to Ago-1 protein. 3. Transcriptomic analysis showed that the silencing mechanism has a modulatory role in the expression of a large number of endogenous genes during vegetative growth. The functions of the proteins coded by these genes are linked to the biogenesis and modification of the cell wall, the control of cell division and growth, carbohydrate metabolism, cell aging or stress response. 4. The canonical RNA silencing pathway is involved in regulation of vegetative sporulation and autolysis induced by nutritional stress. Sexual development should be regulated by a non-canonical Dicer-independent RNA pathway. Pathogenesis experiments did not reveal a role of RNA silencing in the virulence process, but a differential response can’t be ruled out when using other model organisms, such as mouse.

Los objetivos de esta tesis doctoral fueron la caracterización fenotípica y estudio del modo de herencia de los principales caracteres relacionados con la fenología y calidad del fruto en la especie albaricoquero, así como la caracterización genotípica mediante marcadores de ADN (SSRs y SNPs), construcción de mapas de ligamiento genético, identificación de QTLs asociados a caracteres de interés y localización de posibles genes candidatos. El material vegetal utilizado consistió en tres poblaciones segregantes de albaricoquero: ‘Z701-1’× ‘Palsteyn’ (‘Z×P’), ‘Bergeron’ × ‘Currot’ (‘B×C’) y ‘Goldrich’ × ‘Currot’ (‘G×C’) con 160, 187 y 200 descendientes respectivamente. La caracterización fenotípica nos ha permitido la evaluación de fecha de floración, fecha de maduración, ciclo de desarrollo del fruto, peso del fruto, peso del hueso, calibre, color del fruto, firmeza, contenido en sólidos solubles y acidez. Los resultados muestran una gran variabilidad y segregación en cada población, así como evidentes diferencias interanuales. Los histogramas de frecuencias revelan en general una distribución normal de los descendientes en la mayoría de los caracteres evaluados, lo que confirma el carácter poligénico y herencia cuantitativa para todos ellos. Sin embargo, fecha de floración y maduración llegan a mostrar distribuciones bi-modales o tri-modales debido a las diferencias climáticas inter-anuales. Se observa la presencia de valores transgresivos en los descendientes debido a la influencia del fondo genético de los parentales, así como de herencia intermedia. La mayoría de los caracteres evaluados muestran además una buena correlación entre años. En la población ‘Z701-1’ × ‘Palsteyn’ se construyeron los mapas de ligamiento genético a partir de 160 descendientes, utilizando un total de 42 SSRs. Los mapas de ‘Z701-1’ y ‘Palsteyn’ cubren una extensión de 336,2 cM y 363,1 cM respectivamente. En el análisis de QTLs se identificaron QTLs significativos para los principales caracteres fenológicos y de la calidad del fruto en albaricoque. Los resultados mostraron la gran influencia del grupo de ligamiento (LG) 4 para fecha de maduración y ciclo de desarrollo del fruto. La presente tesis abordó un estudio de mejora en la eficiencia de la metodología para el desarrollo y análisis de SNPs, combinando la secuenciación masiva de ARN (RNA-Seq) y la técnica SNPlex mediante la plataforma SEQUENOM. Se diseñaron 136 SNPs procedentes del RNA-Seq de los genotipos ‘Rojo Pasión’ y ‘Z506-7’ siendo aplicados un total de 101 SNP para el genotipado de diferentes variedades de albaricoquero. A partir de los resultados del análisis de variaciones de nucleótidos, podemos decir que este enfoque proporciona alta flexibilidad, reproducibilidad y precisión en los ensayos, suponiendo una herramienta sólida para detectar diversidad de nucleótidos en regiones codificantes y no codificantes del genoma de Prunus. El genotipado con SNPs permitió asimismo establecer las relaciones fenéticas y distancias genéticas entre diferentes cultivares de albaricoquero con diversos orígenes. Finalmente se elaboraron los mapas de ligamiento genético de las poblaciones ‘B×C’ y ‘G×C’, utilizando un total de 130 y 166 descendientes respectivamente. Los mapas fueron construidos combinando marcadores tipo SSR y SNP, siendo mapeados 87 marcadores en la población ‘B×C’ y 89 en ‘G×C’, y cubriendo una extensión del genoma de 394,9 y 414,3 cM en los mapas de ‘Bergeron’ y ‘Currot’ respectivamente, mientras que en ‘Goldrich’ y ‘Currot’ fue de 353,5 y 422,3 cM respectivamente. El análisis de QTLs identificó diferentes QTLs ligados a los principales caracteres fenológicos y de la calidad del fruto en albaricoque. Los QTLs de mayor relevancia por su significación se dan en el LG 4, considerando este grupo de vital importancia para el control de fecha de maduración, ciclo de desarrollo del fruto y contenido en sólidos solubles. En el caso del color de piel y pulpa fueron identificados importantes QTLs al final del LG 3 de ‘Goldrich’. / The objective of this thesis has been to carry out a phenotypic characterization of apricot by studying the inheritance of the major traits related to phenology and fruit quality. In addition, a genotypic characterization using DNA markers (SSRs and SNPs) has been performed to develop genetic linkage maps for QTL detection and identification of potential candidate genes and markers. The plant material used comes from three segregating populations of apricot: ‘Z701-1’× ‘Palsteyn’ (‘Z×P’), ‘Bergeron’ × ‘Currot’ (‘B×C’) and ‘Goldrich’ × ‘Currot’ (‘G×C’) with 160, 187 and 200 seedlings respectively. The phenotipyc characterization has allowed us to evaluate blooming date, ripening time, fruit development period, fruit weight, stone weight, fruit diameter, fruit colour, firmness, soluble solids and acidity. Results show a great variability and segregation in each population as well as the obvious differences between years. The histograms frequencies usually reveal in the three populations a normal distribution in the majority of the traits which confirms the polygenic character and quantitative inheritance for all of them. Nevertheless, blooming and ripening date showed bi-modal or tri-modal distribution due to inter-annual climatic conditions. We should also note the presence of many transgressive trait values, probably due to the influence of the genetic background of the parents as well as intermediate inheritance of seedlings. We can affirm that there was good correlation between years for all traits evaluated. In the population ‘Z701-1’ × ‘Palsteyn’ was constructed a genetic linkage maps assaying 160 seedlings with 42 SSR markers. ‘Z701-1’ and ‘Palsteyn’ maps covered a genome extension of 336.2 and 363.1 cM respectively. We subsequently carried out QTL analysis to identify significant QTLs for the most important phenological and fruit quality traits in apricot. Results show without any doubt the great influence of LG 4 on fruit quality traits, especially in the case of ripening time and fruit development period. The study has also been focused on improving the development and analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) via an efficient and flexible method combining high throughput sequencing (RNA-Seq) and SNPlex technology using the SEQUENOM platform. 136 SNP markers were designed from the RNA-Seq genotypes 'Rojo Pasion' and 'Z506-7' being analyzed a total of 101 SNPs for genotyping of different apricot varieties. From the results of variations in nucleotide sequences (SNPs) we can say that this is an approach that provides high flexibility, reproducibility and accuracy and that it can be considered a robust tool for detecting nucleotide diversity in coding and non-coding regions of the Prunus genome. Moreover, logical phenetic relationships and genetic distance were shown among apricot cultivars tested according to the origin of each one. Finally, genetic linkage maps of populations ‘B×C’ and ‘G×C’ were realized using a total of 130 and 166 seedlings, respectively. Maps were constructed combining SSR and SNP markers, making it possible to map a total of 87 markers in the ‘B×C’ population and 89 markers in ‘G×C’. ‘Bergeron’ and ‘Currot’ covered a genome extension of 394.9 and 414.3 cM, while ‘Goldrich’ and ‘Currot’ covered 353.5 and 422.3 cM, respectively. In the phenotype and genotype integrated analysis, different QTLs were detected for the most important phenological and fruit quality traits. The most significant QTLs are localized in LG 4, showing that this group is of vital importance to ripening time, fruit development period and soluble solids content in both apricot populations. Regarding skin and flesh colour, the most important QTLs were detected at the end of LG 3 of ‘Goldrich’.

La salinidad está considerada como uno de los principales factores limitantes de la producción agrícola. Ante las predicciones del aumento de la población a nivel mundial con el consiguiente incremento de la demanda de alimentos, y los efectos negativos del cambio climático sobre la productividad de los cultivos de interés agronómico, como tomate (Solanum lycopersicum), un objetivo prioritario en la investigación en biología vegetal en la actualidad es avanzar en el conocimiento de los mecanismos y genes implicados en la tolerancia a la salinidad. Una de las estrategias más interesantes para abordar el anterior objetivo es el análisis de mutantes. Esta tesis se enmarca dentro del programa de mutagénesis insercional llevado a cabo por los grupos de investigación del IBMCP (Valencia), UAL (Almería) y CEBAS (Murcia), donde se han generado colecciones de mutantes de tomate cultivado y silvestre. Uno de los objetivos de este trabajo ha sido la identificación y caracterización de mutantes de la especie silvestre Solanum pennellii. La identificación de mutantes en una especie filogenéticamente relacionada con tomate, y que presenta características morfológicas muy diferentes al tomate cultivado y altos niveles de tolerancia al estrés abiótico, puede ser la mejor elección para identificar genes y procesos determinantes de la tolerancia a la salinidad. Respecto a los mutantes de S. pennellii, los cambios morfológicos y fisiológicos observados en el mutante sl-1 (succulent leaves-1) en ausencia de estrés están asociados a una menor perdida de agua por transpiración, y a un mantenimiento de la homeostasis de Na+ y K+ frente al estrés salino. Por el contrario, el mutante hipersensible a sal shp-1 (salt hypersensitive pennellii-1) experimentaba una mayor pérdida de agua por transpiración y una elevada acumulación de Na+ en las hojas durante el periodo de exposición a la sal. La caracterización de ambos mutantes ha puesto de manifiesto que la regulación de la pérdida de agua es un mecanismo clave en la tolerancia a la salinidad. En este trabajo también se ha abordado la caracterización de mutantes de tomate generados a partir del cultivar Moneymaker. A nivel fenotípico y fisiológico, el mutante hipersensible a la salinidad she-1 (salt hypersensitive esculentum-1) mostraba una respuesta similar a la observada en el mutante shp-1 de S. Pennellii, con alta acumulación de Na+ en sus hojas. Sin embargo, la sensibilidad a la sal del mutante she-1 parece estar relacionado con la alteración en los niveles de expresión de los genes SlHKT1s implicados en el transporte de Na+ a la parte aérea. Además, mediante injertos recíprocos se observó que la raíz es el órgano responsable de la sensibilidad a la sal del mutante she-1. Finalmente, se ha abordado la caracterización de un mutante que tiene anulada la expresión del gen CBL10 (CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN 10) de tomate. El mutante cbl10 es hipersensible al estrés salino a pesar de que la acumulación de Na+ en las plantas del mutante es menor que en las plantas no transformadas de Moneymaker y mantiene mayores niveles de K+ con la salinidad, lo que sugiere que la capacidad de acumular Na+ en vacuolas está alterada en el mutante y por tanto se alcanzan antes niveles citotóxicos del ion en el citoplasma. Además, el mutante tiene alterada la distribución de Na+ entre hojas jóvenes y adultas, produciéndose un mayor transporte de Na+ a los tejidos en desarrollo, que puede causar el colapso apical detectado en el mutante tras su exposición a la salinidad. Otra alteración fisiológica provocada por la anulación del gen SlCBL10 es una reducción de la pérdida de agua vía transpiración en condiciones de estrés. Además, la menor transpiración está asociada a una alteración en la homeostasis de Ca2+ y a cambios en el perfil de expresión del transportador de Ca2+ vacuolar SlCAX1, tanto en condiciones salinas como en ausencia de las mismas. Mediante injertos se ha demostrado que el principal órgano responsable de la sensibilidad del mutante cbl10 al estrés salino es la parte aérea, ya que solo muestran sensibilidad a sal las plantas injertadas con el mutante cbl10 como esqueje, pero no cuando éste es utilizado como portainjerto. Este resultado sugiere que SlCBL10 podría tener una función diferente en parte aérea y raíz, siendo su función en la parte aérea la implicada en la tolerancia a la salinidad en tomate. Además, la alteración de la homeostasis de Ca2+ en la parte aérea nos lleva a proponer como papel del gen SlCBL10 su participación en la regulación de la homeostasis de Ca2+, siendo esta función crucial para la tolerancia del tomate al estrés salino. / ABSTRACT Salinity is considered as one of the major limiting effects on agriculture production. Keeping in mind the predictions about the rise of world population resulting in an increase in food demand, and the negative effects of climate change on the productivity of plants of agronomic interest, such tomato (Solanum lycopersicum), one current critical aim in plant biology research is to advance in the knowledge of genes and mechanisms involved in salt tolerance in plants. One of the most interesting strategies to approach this goal is the analysis of mutants. This PhD thesis is framed within the insertional mutagenesis programme carried out by the Spanish research groups from IBMCP (Valencia), UAL (Almeria) and CEBAS (Murcia), where mutant collections have been generated in domesticated tomato and in wild-related species. One of the objectives of this research work has been the identification and characterization of mutants of the tomato wild species Solanum pennellii. The identification of mutants in a species phylogenetically related with tomato that exhibits so different morphological characteristics and high levels of tolerance to abiotic stress could be the best choice to identify genes and processes determining tolerance to salinity. Regarding S. pennellii mutants, the morphological and physiological alterations observed in the sl-1 (succulent leaves-1) mutant in absence of stress are associated to a lower transpirational water loss and a better maintenance of Na+ and K+ homeostasis when confronted to salt stress. On the contrary, the salt hypersensitive shp-1 (salt hypersensitive pennellii-1) mutant suffered a higher transpirational water loss and an elevated accumulation of Na+ in leaves during the period of exposition to salt stress. The characterization of both mutants has revealed that regulation of water loss is a key mechanism in salt stress tolerance. In this research work it has also been approached the characterization of tomato mutants generated in Moneymaker commercial cultivar. At phenotypical as well as physiological level the salt hypersensitive she-1 (salt hypersensitive esculentum-1) mutant showed a similar response to the one observed in shp-1 S. pennellii mutant: a remarkable increase in Na+ accumulation in leaves. However, the susceptibility to salt of she-1 mutant seems to be related to the alteration in the levels of expression of SlHKT1 genes involved in the Na+ transport from root to shoot. Moreover, it was observed by reciprocal grafting that the root was the responsible organ for the salt sensitivity of she-1 mutant. Finally, it has been approached the characterization of a mutant that exhibits a knock-out expression of CBL10 (CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN 10) tomato gene. The cbl10 mutant is hypersensitive to salt stress in spite of the fact that Na+ accumulation in mutant plants is lower than in untransformed WT ones and it upholds higher levels of K+ in salt stress condition. These observations suggest that ability to accumulate Na+ in vacuoles is compromised in the mutant and therefore cytotoxic levels of the ion in the cytoplasm are reached earlier in cbl10 than in WT. What is more, the distribution of Na+ between young and adult leaves is altered in the mutant, since a higher transport of the ion to developing tissues occurred in cbl10. This behavior could be the cause of the apical meristem collapse detected in the mutant plant after exposition to salt stress. Another physiological alteration induced by knocking out SlCBL10 gene is the reduction of water loss via transpiration in stressful conditions. Moreover, the lower transpiration is associated with a perturbation in Ca2+ homeostasis and with changes in the gene expression profile of the vacuolar Ca2+ carrier SlCAX1, in salt stress as well as in non-stressful conditions. Grafting experiments demonstrated that the main responsible organ for the salt stress sensitivity in cbl10 mutant is the shoot, as only grafted plants using cbl10 as scion exhibited such sensitivity, which is not observed when cbl10 is used as rootstock. This result suggests that SlCBL10 could have a different function in shoot and in root, being the function in shoot the one involved in salt tolerance in tomato. Also the alteration of the Ca2+ homeostasis in the shoot of cbl10 mutant lead us to propose a role for SlCBL10 in the regulation of Ca2+ homeostasis, being this potential function a crucial one for tolerance of tomato to salt stress.

La proporción de sexos está distribuida de forma equilibrada en la mayor parte de las especies, y generalmente está determinada por el sexo heterogamético. En mamíferos, los ovocitos producidos por las hembras mantienen siempre la misma carga cromosómica sexual (cromosoma “X”), y son los machos, con una dotación cromosómica distinta en sus gametos (cromosomas “X” e “Y”) los que determinan el sexo. Durante la espermatogénesis se produce igual cantidad de gametos portadores del cromosoma “X” e “Y”, por lo que la probabilidad de tener una cría macho o una cría hembra por cada evento de fecundación en especies monotocas o politocas sería del 50%. Sin embargo, los datos obtenidos por los registros en muchas especies nos muestran que no siempre la proporción de los sexos es equilibrada al 50%. En la literatura se han descrito muchos factores que podrían tener influencia directa o indirecta en el desequilibrio de la proporción de sexos. A pesar de ello, hasta la fecha se desconocen con precisión los mecanismos por los cuales se produce este fenómeno. Objetivo: La presente tesis propone analizar distintos factores y posibles mecanismos que pueden estar relacionados con la proporción de sexos. Metodología: En nuestro estudio, utilizamos un modelo ratón transgénico que posee una secuencia marcadora integrada en el cromosoma “X”, y hemos analizado en primer lugar la posible distorsión primaria y secundaria del sexo debida a la presencia del transgén. Así como la calidad embrionaria medida en número de células del blastocisto. Analizamos el efecto de la dieta durante los periodos de pre-implantación y post-implantación, tomando en consideración la lateralidad (origen ovárico o uterino). Se estudiaron las relaciones que existen entre la ovariectomía y la compensación hormonal ovárica, la proporción del sexo y la posición adoptada en el útero por cada uno de los sexos. Se analizó si existía una relación entre la velocidad de desarrollo pre-implantacional (segunda división mitótica embrionaria y posterior desarrollo a blastocisto) y la calidad y el sexo de los embriones producidos in vivo. Resultados y Discusión: En el capítulo I. Se observó que esta modificación genética, no alteraba las proporciones primaria ni secundaria de sexos, ni el número celular de embriones pre-implantacionales, y debido a ello, consideramos el factor transgénico como no determinante en la proporción de los sexos. En el capítulo II se encontraron diferencias de proporción del sexo cuando se registraron los datos del lado de procedencia (derecho o izquierdo), principalmente en estadios cercanos al momento de la fecundación, y en ratonas de menor constitución física. Estas diferencias se correlacionan con la perdida embrionaria y dejan de ser significativas cuando se observaban estas proporciones de manera global. En el capítulo III, no se encontraron diferencias en las proporciones de machos y hembras entre las hemi-ovariectomías derecha e izquierda. Sin embargo los resultados muestran una preferencia de las hembras a implantar en secciones uterinas cercanas al cérvix, siendo estas hembras de un peso inferior al resto de hembras implantadas en otras secciones del útero. Por último, en el capítulo IV, nuestros resultados no indican una diferencia de la proporción del sexo en los embriones recuperados en el paso de 2 a 3 células, ni tampoco en la velocidad de desarrollo a blastocisto. Solamente se observó una mayor proporción de hembras en los embriones que más lentamente se dividían a 3 células y posteriormente tardaban más en llegar al estadio de blastocisto. También se observó una relación entre la calidad embrionaria definida por la expresión de marcadores de pluripotencia y la velocidad de división pre-implantacional. / Sex ratio is equally distributed in most species, and it is generally determined by the heterogametic sex. In mammals, oocytes produced by females always keep the same chromosomal sex (chromosome “X”); however, the males, with a different chromosome in their gametes (chromosomes “X” and “Y”)determine the sex. During spermatogenesis, equal number of gametes carrying the chromosome “X” and “Y” is produced. According to Mendelian’s genetic, the chance of breeding a male or a female pup per fertilization event in polytocous and monotocous species would be 50%. However, the data obtained in many species show that not always the sex ratio is balanced at 50%. In the literature, many factors that could have a direct or indirect influence on the imbalance of the sex ratio have been described. However, the precise mechanism by which this phenomenon occurs is still unknown. Objetive: This thesis aims to analyze various factors and possible mechanisms that may be related to the sex ratio. Methods: In our study, we used a transgenic mouse model that presents a marker sequence integrated in the “X” chromosome, and we first analyzed the possible primary and secondary sex distortion due to the presence of the transgene, as well as embryo quality measured by the number of cells of the blastocyst. We analyzed the effect of diet during pre-implantation and post-implantation periods, considering laterality (ovarian or uterine origin). The relationship between ovariectomy and ovarian hormonal balance, sex proportion and position in the uterus for each of the sexes were studied. We analyzed whether there was a relationship between the rate of preimplantation development (second mitotic division and subsequent embryo development to blastocyst) and the quality and sex of embryos produced in vivo. Results and discussion: In chapter I, It was noted that this genetic modification did not alter the sex ratio primary or secondary, or cell number of pre-implantation embryos, and because of this, we considered the transgenic factor as non-determinant in the sex ratio. In Chapter II, differences in sex ratio were found when the data of the source side (right or left) were recorded, mainly in stages near to the time of fertilization, and in mice with minor physical condition. These differences were correlated with embryonic loss and were not significantly different when these ratios were observed globally. In Chapter III, no differences in the proportions of males and females between the right and left hemi-ovariectomy were found. However, the results showed that females had a tendency to implant in sections close to uterine cervix, presenting a lower weight than those females implanted elsewhere in the uterus. Finally, in Chapter IV, our results do not show a difference in the sex ratio in embryos recovered in the 2 to 3-cells stage, nor on the rate of development to blastocyst. It was only observed a higher proportion of females in embryos that arrived to the 3-cell stage the slowest and subsequently took longer to reach the blastocyst stage. A relationship between the embryo quality defined by the expression of markers of pluripotency and by the preimplantation speed division was also observed.

El problema de la salinidad y estrés hídrico continúa incrementando su importancia debido a la escasez cada vez mayor de agua para riego junto a la mala calidad de la disponible. La mejora genética de las plantas cultivadas para tolerar este tipo de estrés abiótico puede paliar en parte las consecuencias negativas de este problema. Sin embargo, la tolerancia a los estreses hídrico y salino es un carácter particularmente complejo ya que está compuesto por la interacción de muchos caracteres. Dentro de la sección Lycopersicon del género Solanum está incluido el tomate cultivado (Solanum lycopersicum) y 12 especies afines más, conocidas como tomates silvestres, con accesiones que presentan una alta tolerancia a estos estreses. La cercanía filogenética a la especie cultivada, de gran importancia económica en todo el mundo, hace de estas especies el principal recurso genético para la mejora de tomate cultivado. Este trabajo se enmarca en un proyecto coordinado entre tres grupos de investigación pertenecientes a la Universidad de Almería, la Universidad Politécnica de Valencia y el CEBAS de Murcia, en el que estamos utilizando dos herramientas genómicas (mutagénesis insercional y trapping) en tomate y diversas especies silvestres relacionadas para identificar secuencias codificantes o elementos de regulación de genes implicados en procesos del desarrollo vegetativo (arquitectura de la planta) y reproductivo (flor y fruto), así como en salinidad y estrés hídrico. Objetivos El objetivo fundamental de este trabajo es avanzar en el conocimiento de las bases fisiológicas y genéticas de la tolerancia a la salinidad y estrés hídrico en una especie de interés agronómico, el tomate. Metodología Se han utilizado dos herramientas biotecnológicas, el análisis funcional de dos genes candidatos y la mutagénesis insercional mediante el empleo de una trampa de intensificadores en una especie silvestre relacionada con altos niveles de tolerancia a ambos estreses. En el primer caso, se ha estudiado la respuesta de plantas transgénicas de tomate que sobreexpresan un gen implicado en el estrés iónico inducido por salinidad, el gen HAL5, y plantas que expresan un gen implicado en la última etapa de la síntesis de myo-inositol, el gen IMP1. Por otra parte se ha empleado un vector que porta una trampa de intensificadores, para identificar mutantes insercionales alterados en diferentes caracteres y, especialmente, en la tolerancia a los estreses hídrico y salino. Resultados La sobreexpresión del gen HAL5 incrementa la tolerancia a la salinidad de tomate cuando se mide el peso de frutos por planta, el parámetro más importante desde un punto de vista agronómico. Además, se ha podido comprobar que la sobreexpresión del gen IMP1, incrementa la tolerancia del tomate a la salinidad y al estrés hídrico a largo plazo. Por otro lado, se ha generado la primera colección de líneas T-DNA de la especie silvestre Solanum pennellii. Se han detectado algunas líneas con expresión específica del gen delator en órganos de la planta relacionados con el nivel de tolerancia a ambos estreses abióticos. Por último, se han identificado mutantes insercionales con alteraciones en caracteres del desarrollo vegetativo, desarrollo reproductivo y tolerancia al estrés hídrico y salino. Conclusiones Este trabajo ha permitido conocer la función de dos genes implicados en la tolerancia a estreses abióticos y sus efectos al sobreexpresarse en plantas de tomate. También se ha generado una amplia colección de líneas T-DNA en diversas accesiones de Solanum pennellii, primer paso para poder llevar a cabo un programa de mutagénesis insercional. Además, los diferentes mutantes de S. pennellii seleccionados en este trabajo constituyen un excelente material para la identificación y análisis funcional de genes implicados tanto en estreses abióticos como en procesos de desarrollo vegetativo y reproductivo. / The problem of salinity and water stress in worldwide agriculture is being intensified due to the increasing scarcity of water resources and low quality of the available water for agricultural purposes. Plant breeding of crop plants to promote tolerance to these stresses could alleviate, at least partially, the negative consequences in production and yield caused by these abiotic stresses. Nevertheless, tolerance to water and salt stresses is a particularly complex trait since it is made up by the interaction of numerous individual traits. Within the Lycopersicon section from Solanum genus it is included the cultivated tomato (Solanum lycopersicum) and 12 wild-related species, these lasts with accessions that present a high tolerance to these stresses. The phylogenetic closeness of the wild-related and the cultivated species, the latter of well-known worldwide economic importance, makes the former species the main genetic resource for breeding programmes in cultivated tomato. This research work has been fulfilled within the framework of a coordinated project managed among three groups; one from the University of Almeria, the second from the Polytechnic University of Valencia and the last from CEBAS-CSIC of Murcia. Two genomic tools, insertional mutagenesis and trapping, are being applied on tomato and diverse wild-related species to identify coding sequences or regulatory elements of genes involved in vegetative (plant architecture) and reproductive (flower and fruit) development, as well as in the plant responses to salinity and water stress. Objectives: The essential objective of this research work is to advance in the knowledge of the physiological and genetic basis of the tolerance to salinity and water stress in a species of such agronomic importance as it is tomato. Methodology: For this purpose two biotechnological tools have been used; the functional analysis of two candidate genes and the insertional mutagenesis with enhancer trap applied in a wild-related species exhibiting high levels of tolerance to both stresses. In the first case, it has been studied the response of transgenic tomato plants overexpressing a gene involved in the ionic stress induced by salinity, HAL5, and of another set of transgenic plants overexpressing a gene which product is involved in the last step of myo-inositol biosynthesis, IMP1. On the other side, a genetic construction carrying a enhancer trap, has been used for plant transformation with the aim of identifying insertional mutants altered in different phenotypic traits, but especially in those related to tolerance to salt and water stresses Results: The overexpression of HAL5 augments the tolerance to salinity in the transgenic tomato assessed by fruit weight per plant, the main parameter from an agronomic point of view. Besides, it has been possible to verify that the overexpression of IMP1 increases the tolerance to long-term salinity and drought in the resulting transgenic plants. On the other hand, the first collection of T-DNA lines of the wild-related tomato species Solanum pennellii has been generated. Some mutant lines with specific expression of the reporter gene in plant organs related to the level of tolerance to both abiotic stresses have been detected. Lastly, some insertional mutants with alterations in traits related to vegetative and reproductive development as well as in tolerance to salt and water stresses have been identified. Conclusions: This research work has allowed us to know the function of two genes involved in the tolerance to abiotic stresses and their effects when overexpressed in tomato plants. Also it has been generated a large collection of T-DNA lines in diverse accessions from Solanum pennellii, the first step to accomplish a programme of insertional mutagenesis. Furthermore, the different S. pennellii mutants selected in this research work constitute an outstanding plant material for the identification and functional analysis of genes implicated in abiotic stresses as well as in vegetative and reproductive developmental processes.