Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-23Bitstream added on 2014-06-13T20:54:11Z : No. of bitstreams: 1 jacob_tr_me_jabo.pdf: 729486 bytes, checksum: 4304febd044d7016287bf88e804083f7 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A citricultura é uma atividade agro-industrial de suma importância para o Estado de São Paulo e para o Brasil. Com uma área plantada em torno de aproximadamente 1 milhão de hectares o país mantém a posição de maior produtor mundial de citros. Desse total, 77% encontram-se localizados na região Sudeste. O sistema citrícola representa 4,47% das exportações de produtos do agronegócio nacional, sendo que o suco de laranja concentrado representa 72% do valor dessas exportações. Entretanto, todo este potencial econômico vem sendo prejudicado por várias doenças dentre elas uma denominada Cancro Cítrico, a qual é causada por um fitopatógeno bacteriano denominado Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). Com o objetivo de analisar os feitos da interação entre essa bactéria e seu hospedeiro natural, utilizou-se a técnica de Análise da Transcrição Reversa em Tempo Real (qRT-PCR) para quantificar a expressão dos genes que compõem o SSTT, SSTQ, algumas ORFs hipotéticas e as quatro cópias do gene pthA. Para tanto, realizou-se um estudo prévio com 10 genes candidatos visando identificar os mais adequados para serem usados como genes de referência no processo de normalização de dados em experimentos dessa natureza. O experimento contou com quatro replicatas biológicas e duas replicatas técnicas. Com base nos resultados, verificou-se que os genes rpoB e rpoC parecem ser os mais indicados para a normalização de dados em experimentos de expressão gênica por qRT-PCR que envolvam analises intergrupos. A maioria dos genes que compõem o SSTT se mostraram induzidos quando a bactéria esteve em contato com seu hospedeiro, com destaque para os genes hrpXct e hrpB4, o que sugere que este sistema tenha um importante papel na patogenicidade dessa bactéria. Por outro lado, os resultados e o estudo da expressão gênica evidenciaram que... / The citrus is an agro-industrial activity of great importance for the State of São Paulo and Brazil. With a planted area around 1 million hectares the country maintains its position of world's leading producer of citrus. Of these, 77% are located in the Southeast. The citrus system represents 4.47% of national agribusiness exportation, being the orange juice concentrate responsible for 72% of the value of these exports. However, all this economic potential is being hampered by diseases among them one called citrus canker, which is caused by a phytopathogenic bacterium known as Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). With the aim of analyzing the achievements of the interaction between this bacterium and its natural host, we used the technique of Real- Time Reverse Transcription Analysis (qRT-PCR) to quantify the expression of genes that comprise the SSTT, SSTQ, some hypothetical ORFs and the four copies of the gene pthA. Thus, a preliminary study with 10 candidate genes were conducted to identify the most suitable ones for use as reference in the process of data standardization in such experiments. The experiment had four biological replicates and two technical replicates. Based on the results, it was found that the rpoB and rpoC genes seem to be the most suitable for the standardization of data in experiments of gene expression by qRT-PCR analysis involving intergroup. Most of the genes that comprise the SSTT was induced when the bacterium was in contact with its host, with emphasis on the genes... (Complete abstract, click electronic access below)

Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global durante a fase de esporulação do fungo aquático Blastocladiella emersonii utilizando a tecnologia dos microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3.773 genes distintos. Ao todo 615 genes foram classificados como induzidos enquanto 645 foram classificados como reprimidos ao longo da esporulação. As categorias funcionais mais representadas entre os genes induzidos foram: microtúbulo e citoesqueleto, transmissão de sinal, atividade de ligação ao íon Ca2+, proteólise (apenas no início da esporulação) e biogênese e organização do cromossomo (apenas no final da esporulação). Dentre os genes reprimidos, as categorias funcionais mais representadas foram: biossíntese de proteína, transporte de carboidratos e metabolismo energético. A comparação dos dados de expressão gênica da esporulação com aqueles obtidos recentemente em nosso laboratório para a germinação mostrou um grande número de genes regulados inversamente ao longo das duas fases de diferenciação do ciclo de vida de B. emersonii. Muitos genes induzidos na esporulação são reprimidos na germinação e vice versa. Analisamos também o efeito de glicose e triptofano sobre a expressão gênica durante a formação dos zoósporos, tendo em vista que tais nutrientes são capazes de inibir a esporulação de B. emersonii. Nossos resultados mostraram que na presença de glicose (1%) genes envolvidos na composição e atividade do citoesqueleto foram superexpressos, enquanto na presença do aminoácido triptofano houve um aumento na expressão de genes envolvidos no processo de enovelamento de proteínas e proteólise, e na resposta ao estresse oxidativo. Além disso, genes envolvidos no processo de esporulação propriamente dito foram reprimidos durante o tratamento com triptofano. Investigamos também a via de sinalização por GMP cíclico (cGMP), cujos níveis aumentam consideravelmente durante a esporulação de B. emersonii. Iniciamos o estudo com uma busca no banco de ESTs de B. emersonii (http://blasto.iq.usp.br) por seqüências que codificassem enzimas envolvidas na síntese e degradação de cGMP. Foram encontradas três ESTs que codificam domínios catalíticos que parecem pertencer a três diferentes guanilato ciclases e uma EST codificando uma fosfodiesterase com alta similaridade com fosfodiesterases que possuem alta afinidade por cGMP. Experimentos de microarranjos de cDNA validados por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram que os quatro transcritos são expressos durante esporulação, com picos de indução durante a fase tardia da esporulação, momento em que ocorre a biogênese dos zoósporos. Além disso, dados obtidos a partir de experimentos in vivo e in vitro utilizando inibidores das enzimas guanilato ciclase e óxido nítrico sintase, sugeriram a participação do íon Ca2+ e do radical livre óxido nítrico (•NO) na atividade de guanilato ciclase, em uma via do tipo Ca2+-•NO-cGMP. / In the present work, we analyzed global gene expression changes during the sporulation phase of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii using cDNA microarray technology with chips containing 3773 distinct genes. A total of 615 genes were upregulated and 645 were down-regulated along the sporulation of the fungus. The overrepresented functional categories among the induced genes were: microtubule and cytoskeleton, signal transduction, Ca2+ binding activity, proteolysis (only at the beginning of sporulation), and chromosome biogenesis and organization (only at the end of sporulation). Among the down-regulated genes, the over-represented functional categories were: protein biosynthesis, carbohydrate transport, and energetic metabolism. Sporulation gene expression data were compared with those obtained recently in our laboratory for the germination phase, showing that a great number of genes are inversely regulated along the two differentiation stages of B. emersonii life cycle. We also analyzed the effects of glucose and tryptophan on gene expression during biogenesis of the zoospores, as such nutrients are able to inhibit B. emersonii sporulation. Our results showed that in the presence of glucose (1%) genes related to activity and composition of cytoskeleton were over-expressed, while in the presence of tryptophan genes involved in protein folding, proteolysis and oxidative stress were induced. In addition, genes involved in the sporulation process per se were downregulated by tryptophan treatment. We also investigated the cyclic GMP signaling pathway, as the levels of this cyclic nucleotide increase considerably during B. emersonii sporulation. Firstly, we searched for sequences encoding enzymes involved in cGMP synthesis and degradation using the B. emersonii EST databank (http://blasto.iq.usp.br). Three sequences were found encoding distinct guanylate cyclase catalytic domains, and one showed high similarity with phosphodiesterases that exhibit high affinity for cGMP. Microarray experiments, validated by real time quantitative RT-PCR, showed that the four transcripts are induced during sporulation, reaching maximum levels at the late stages of sporulation, when zoospore biogenesis occurs. In addition, data obtained from in vivo and in vitro experiments using inhibitors for the enzymes guanylate cyclase and nitric oxide synthase indicated the involvement of the ion Ca2+ and the free radical nitric oxide (•NO) in guanylate cyclase activity, suggesting the existence of a Ca2+-• NO-cGMP signaling pathway.

Neste trabalho realizamos a análise das variações na expressão gênica global durante a fase de esporulação do fungo aquático Blastocladiella emersonii utilizando a tecnologia dos microarranjos de cDNA em lâminas contendo 3.773 genes distintos. Ao todo 615 genes foram classificados como induzidos enquanto 645 foram classificados como reprimidos ao longo da esporulação. As categorias funcionais mais representadas entre os genes induzidos foram: microtúbulo e citoesqueleto, transmissão de sinal, atividade de ligação ao íon Ca2+, proteólise (apenas no início da esporulação) e biogênese e organização do cromossomo (apenas no final da esporulação). Dentre os genes reprimidos, as categorias funcionais mais representadas foram: biossíntese de proteína, transporte de carboidratos e metabolismo energético. A comparação dos dados de expressão gênica da esporulação com aqueles obtidos recentemente em nosso laboratório para a germinação mostrou um grande número de genes regulados inversamente ao longo das duas fases de diferenciação do ciclo de vida de B. emersonii. Muitos genes induzidos na esporulação são reprimidos na germinação e vice versa. Analisamos também o efeito de glicose e triptofano sobre a expressão gênica durante a formação dos zoósporos, tendo em vista que tais nutrientes são capazes de inibir a esporulação de B. emersonii. Nossos resultados mostraram que na presença de glicose (1%) genes envolvidos na composição e atividade do citoesqueleto foram superexpressos, enquanto na presença do aminoácido triptofano houve um aumento na expressão de genes envolvidos no processo de enovelamento de proteínas e proteólise, e na resposta ao estresse oxidativo. Além disso, genes envolvidos no processo de esporulação propriamente dito foram reprimidos durante o tratamento com triptofano. Investigamos também a via de sinalização por GMP cíclico (cGMP), cujos níveis aumentam consideravelmente durante a esporulação de B. emersonii. Iniciamos o estudo com uma busca no banco de ESTs de B. emersonii (http://blasto.iq.usp.br) por seqüências que codificassem enzimas envolvidas na síntese e degradação de cGMP. Foram encontradas três ESTs que codificam domínios catalíticos que parecem pertencer a três diferentes guanilato ciclases e uma EST codificando uma fosfodiesterase com alta similaridade com fosfodiesterases que possuem alta afinidade por cGMP. Experimentos de microarranjos de cDNA validados por RT-PCR quantitativo em tempo real mostraram que os quatro transcritos são expressos durante esporulação, com picos de indução durante a fase tardia da esporulação, momento em que ocorre a biogênese dos zoósporos. Além disso, dados obtidos a partir de experimentos in vivo e in vitro utilizando inibidores das enzimas guanilato ciclase e óxido nítrico sintase, sugeriram a participação do íon Ca2+ e do radical livre óxido nítrico (•NO) na atividade de guanilato ciclase, em uma via do tipo Ca2+-•NO-cGMP. / In the present work, we analyzed global gene expression changes during the sporulation phase of the aquatic fungus Blastocladiella emersonii using cDNA microarray technology with chips containing 3773 distinct genes. A total of 615 genes were upregulated and 645 were down-regulated along the sporulation of the fungus. The overrepresented functional categories among the induced genes were: microtubule and cytoskeleton, signal transduction, Ca2+ binding activity, proteolysis (only at the beginning of sporulation), and chromosome biogenesis and organization (only at the end of sporulation). Among the down-regulated genes, the over-represented functional categories were: protein biosynthesis, carbohydrate transport, and energetic metabolism. Sporulation gene expression data were compared with those obtained recently in our laboratory for the germination phase, showing that a great number of genes are inversely regulated along the two differentiation stages of B. emersonii life cycle. We also analyzed the effects of glucose and tryptophan on gene expression during biogenesis of the zoospores, as such nutrients are able to inhibit B. emersonii sporulation. Our results showed that in the presence of glucose (1%) genes related to activity and composition of cytoskeleton were over-expressed, while in the presence of tryptophan genes involved in protein folding, proteolysis and oxidative stress were induced. In addition, genes involved in the sporulation process per se were downregulated by tryptophan treatment. We also investigated the cyclic GMP signaling pathway, as the levels of this cyclic nucleotide increase considerably during B. emersonii sporulation. Firstly, we searched for sequences encoding enzymes involved in cGMP synthesis and degradation using the B. emersonii EST databank (http://blasto.iq.usp.br). Three sequences were found encoding distinct guanylate cyclase catalytic domains, and one showed high similarity with phosphodiesterases that exhibit high affinity for cGMP. Microarray experiments, validated by real time quantitative RT-PCR, showed that the four transcripts are induced during sporulation, reaching maximum levels at the late stages of sporulation, when zoospore biogenesis occurs. In addition, data obtained from in vivo and in vitro experiments using inhibitors for the enzymes guanylate cyclase and nitric oxide synthase indicated the involvement of the ion Ca2+ and the free radical nitric oxide (•NO) in guanylate cyclase activity, suggesting the existence of a Ca2+-• NO-cGMP signaling pathway.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-24Bitstream added on 2014-06-13T20:43:03Z : No. of bitstreams: 1 colombo_j_dr_sjrp.pdf: 949474 bytes, checksum: 856a4b47ea1a9aa6adebae3e2e97b6a0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os tumores de cabeça e pescoço ocupam, mundialmente, a quinta posição na lista das neoplasias mais freqüentes. O tipo histológico predominante é o carcinoma de células escamosas, que acomete a cavidade oral, a orofaringe, a hipofaringe e a laringe. O tumor de laringe é um dos tipos mais comuns, correspondendo a 25% dos casos, com alto índice de mortalidade e prognóstico reservado. O principal fator etiológico para o seu desenvolvimento é o consumo combinado de álcool e fumo. O desenvolvimento do câncer de cabeça e pescoço é um processo multipasso acompanhado por mudanças genéticas e epigenéticas. Recentemente, estudos envolvendo a tecnologia microarray têm identificado genes específicos, cuja expressão está alterada em câncer de cabeça e pescoço quando comparado ao tecido normal. No entanto, a maioria dos estudos são realizados usando tumores de diferentes sítios. Neste estudo, foi analisado somente amostras de carcinoma de laringe para minimizar as diferenças genéticas. Dessa forma, os objetivos do presente projeto foram identificar e validar possíveis biomarcadores moleculares envolvidos na carcinogênese de laringe. Para tanto, foi construído um cDNA microarray com 340 genes previamente identificados pelo Head and Neck Annotation Consortium. A expressão desses genes foi analisada em 8 amostras de tecido tumoral e em 4 amostras de tecido histologicamente normal de laringe pela técnica de microarray. Foram identificados 35 genes diferencialmente expressos (SNR ½1.0½, p-value 0.001), os quais estão envolvidos em diversos processos celulares como adesão celular, apoptose, ciclo celular, inibição de proteases, metabolismo, proteólise, reparo de DNA, regulação da transcrição e transdução de sinal. A robustez da assinatura dos 35 genes diferencialmente expressos foi confirmada em um conjunto adicional de 5 amostras tumorais e 6 amostras... / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the fifth most common cancer world-wide. More than 90% of this cancer type has a squamous origin and common sites include oral cavity, oropharynx, hypopharynx and larynx Laryngeal squamous cell carcinoma is very common in head and neck cancer, corresponding to 25% of cases, with high mortality rates and poor prognosis. Tobacco use and/or alcohol consumption are the two principal risk factors involved in development of HNSCC. The development of head and neck cancer is a multistep process accompanied by genetic and epigenetic changes. In recent years, studies involving microarrays have identified specific genes whose expression has changed in head and neck cancer compared with normal tissue. However, most microarray studies are performed using tumors from different sites in head and neck. In our study, we analyzed only larynx carcinoma samples to minimize the genetic differences. Thus, the purpose of this work was to identify and to validater molecular biomarkers involved in larynx carcinogenesis. Therefore, we constructed a cDNA microarray containing 340 genes previously identified by Head and Neck Annotation Consortium. Expression analysis was applied to 8 larynx tumor samples and 4 larynx normal samples. We identified 35 differentially expressed genes between tumor and non-tumor adjacent tissue of larynx (SNR ½1.0½, p-value 0.001). Genes detected were involved in processes as apoptosis, cell adhesion, cell cycle, DNA repair, metabolism, protease inhibition, proteolysis, signal transduction and transcription regulation. The robustness of the 35-gene signature was confirmed using data from an additional set of 5 larynx tumor samples and 6 adjacent non-tumor larynx tissues. For real time RT-PCR validation we selected fourteen genes, of which 10 (ADCY6, AES, AL2SCR3, CRR9, CSTB, DUSP1, MAP3K5, PLAT, UBL1 and ZNF706) were validated... (Complete abstract click electronic access below)