As contaminações por leveduras selvagens e por bactérias no processo de produção de etanol combustível no Brasil causam prejuízos ao rendimento fermentativo e aumento de custos pelo uso de biocidas. No entanto, poucos estudos tem focado no efeito das contaminações conjuntas de leveduras selvagens e bactérias e as possíveis interações entre os micro-organismos, especialmente em função dos diferentes substratos de fermentação e das formas de controle. Este trabalho teve por objetivos verificar o efeito do substrato (caldo de cana e melaço) sobre o desenvolvimento das contaminações pela levedura da espécie Dekkera bruxellensis e pela bactéria Lactobacillus fermentum, em co-culturas com Saccharomyces cerevisiae (linhagem industrial PE-2) e possíveis formas de controle do crescimento dos contaminantes (pelo uso de metabissulfito de potássio e adição de etanol ao tratamento ácido) sem afetar a levedura do processo. Os testes foram realizados em condições de crescimento (substrato com 4 °Brix, culturas agitadas) e fermentação com reciclo celular (substrato com 16 °Brix, culturas estáticas). Houve interação entre as leveduras e a bactéria quando crescidas em caldo de cana 4 °Brix. A levedura industrial não foi afetada pela presença dos micro-organismos contaminantes, no entanto, para D. bruxellensis a presença de L. fermentum interferiu positivamente no crescimento, com aumento no número de UFC, e consequentemente inibição do crescimento da bactéria. Em melaço, houve um estímulo ao crescimento de L. fermentum quando em co-cultura com S. cerevisiae. Houve influência das contaminações sobre os parâmetros avaliados no experimento (pH, açúcar redutor total, etanol, glicerol e crescimento das células) e a contaminação conjunta de L. fermentum e D. bruxellensis potencializou o efeito das contaminações pelos micro-organismos isoladamente, tanto em caldo quanto em melaço. A adição de 13% de etanol à solução de ácido sulfúrico pH 2,0 no tratamento celular resultou em uma diminuição significativa no número de UFC de D. bruxellensis (entre 90-99%). A levedura PE-2 foi pouco afetada pelo tratamento proposto. A bactéria L. fermentum teve seu crescimento afetado em todas as combinações testadas. Como os experimentos foram feitos em co-culturas, verificouse que pode haver influência de um micro-organismo sobre a viabilidade do outro, dependendo da reação ao tratamento ácido-etanol. O metabissulfito de potássio (MBP), no intervalo entre 200-400 mg/L, foi eficaz para controlar o crescimento de D. bruxellensis dependendo do meio de cultura e linhagem. Quando adicionado (250 mg/L) à solução ácida (pH 2,0) no tratamento celular, um efeito significativo foi observado nas culturas mistas, pois ocorreu a inativação do SO2 pela S. cerevisiae e uma provável proteção das células de D. bruxellensis, não sendo essa levedura prejudicada pelo MBP. A resposta fisiológica de S. cerevisiae na presença de MBP pode explicar a diminuição significativa na produção de etanol. Quando o MBP foi adicionado ao meio de fermentação, resultou no controle da D. bruxellensis mas não em sua morte, com efeito menos intensivo sobre a eficiência fermentativa. Em cocultura com a adição de MBP, a eficiência fermentativa foi significativamente menor do que na ausência de MBP. / The contaminations by wild yeasts and bacteria are harmful to the fermentative process for fuel ethanol production in Brazil due to the decrease in ethanol yield and increase in the industrial costs by the use of biocides. However, a few studies have been focused in the effects of simultaneous contaminations of wild yeasts and bacteria and the possible interactions among the microorganisms, especially concerning different fermentation substrates and forms of growth control. This work aimed to verify the effect of the substrate (sugar cane juice and molasses) on the development of contaminations by Dekkera bruxellensis yeast and Lactobacillus fermentum bacteria, in co-cultures with Saccharomyces cerevisiae (industrial strain PE-2) and possible forms of growth control of the contaminants (using potassium metabisulphite and addition of ethanol to the acid treatment) without affecting the starter yeast. Tests were carried out in growing conditions (substrate with 4 °Brix, shaken cultures) and cell-recycled fermentation (substrate with 16 °Brix, static cultures). There was interaction among the yeasts and the bacteria when growing in sugarcane juice 4 °Brix. The industrial yeast strain was not affected by the presence of the contaminant microorganisms, however, for D. bruxellensis, the presence of L. fermentum influenced positively the growth, increasing the number of CFU and consequently inhibiting the bacterial growth. In molasses, there was an increase in the growth of L. fermentum when in co-culture with S. cerevisiae. The contaminations influenced the fermentative parameters (pH, total reducing sugars, ethanol, glycerol and cell growth) and the simultaneous contamination by L. fermentum and D. bruxellensis potentiated the effect of the contaminations isolately, both in sugarcane juice as in molasses. The combined effect of pH 2.0 + 13% ethanol in the cell treatment resulted in a significant decrease (90-99%) in the CFU number of D. bruxellensis. The industrial yeast PE-2 was a little affected by the treatment. The growth of the bacteria L. fermentum was affected in all the combinations tested. As the experiments were performed with co-cultures, an influence of a microorganism over the viability of another was observed, depending of the reaction to the treatment. The potassium metabisulphite (PMB), in the range of 200-400 mg/L, was effective to control the growth of D. bruxellensis depending on the culture medium and strain. When added (250 mg/L) to the acidic solution (pH 2.0), a significant effect was observed in mixed cultures, because the inactivation of SO2 by S. cerevisiae most likely protected D. bruxellensis from being damaged by PMB. The physiological response of S. cerevisiae to the presence of PMB may explain the significant decrease in alcohol production. When added to the fermentation medium, PMB resulted in the control but not the death of D. bruxellensis, with less intensive effect on the fermentative efficiency. In co-culture with the addition of PMB, the fermentative efficiency was significantly lower than in the absence of PMB.

O etanol se consagrou como o principal biocombustível e o Brasil detém o processo mais econômico e ambientalmente adequando. O processo industrial brasileiro é único, pois utiliza o reciclo de células de leveduras na fermentação permitindo uma ótima velocidade de fermentação, porém o mesmo ato potencializa os efeitos tóxicos presentes no processo. O substrato de fermentação é composto pela mistura de caldo e melaço de cana-de-açúcar, porém a vantagem econômica do açúcar sobre o etanol faz com que o caldo seja priorizado para a produção de açúcar e o seu subproduto seja mais utilizado na fermentação, nesse caso o melaço. O melaço apresenta diversos compostos inibitórios como sulfitos, excesso de sais, fenóis, furfurais e metais. Devido à larga escala do processo, o substrato não pode ser esterilizado antes da fermentação, logo a presença de microrganismos contaminantes se torna um problema sempre presente. As bactérias contaminantes consomem o substrato e produzem substâncias tóxicas como ácidos orgânicos, fatos que prejudicam o rendimento fermentativo do processo. Quando se considera o longo período de reciclos (aproximadamente 250 dias por safra e pelo menos 2 ciclos por dia) a maioria das linhagens de leveduras empregadas não são capazes de perdurar no processo, seja pela toxicidade do processo e ou pela competição com contaminantes. Portanto há um esforço contínuo no sentido de se buscar novas linhagens mais aptas ao processo industrial. Para tal é imperiosa a disponibilidade de uma metodologia para simular o processo industrial de modo a permitir uma avaliação de pretensas linhagens quanto ao seu desempenho no processo industrial com reciclo de células. No presente trabalho é proposto um protocolo, simulando as várias condições estressantes de uma fermentação industrial com reutilização de células, para a avaliação de linhagens de levedura com diferentes capacidades de colonizarem as dornas de fermentação. Os resultados obtidos mostraram que o protocolo empregado foi capaz de reproduzir o comportamento fisiológico e tecnológico das linhagens quando submetidas no processo industrial, se constituindo numa ferramenta útil para a seleção de leveduras. / The ethanol became entrenched as the main biofuel and Brazil owns the most economic and environmentally appropriate process. The Brazilian industrial process is unique, since it utilizes the yeast cell recycle, what allows a great fermentation velocity, but the same process enhances the toxics effects presents on the process. The fermentation subtract is composed by the mixture of sugar cane juice and molasses, however the economic advantages of the sugar over the ethanol makes that the juice get prioritized to the production of sugar and it\'s by-product, the molasses, go into the fermentation process. The molasses contain several toxic compounds, like sulfites, salts excess, phenols, furfural and metals. Due to the large scale of the process, the substrate cannot be sterilized before the fermentation and this cause the presence of contaminant microorganisms an always present problem. The contaminant bacteria consumes the substrate and produce toxics products like organic acids, facts that can hinder the yield of the fermentation process. When the long recycle period (approximately 250 days per season, with at least 2 cycles per day) is take in consideration, most of the yeast strains aren\'t capable to endure the process because of the toxicity of it and or by the competition with the contaminants. Therefore there is a continuous effort in the search of new strains best suited for the industrial process. To do so, it`s imperative the availability of a methodology that can simulate the industrial process and the alleged strains can be evaluated in terms of their performance in the industrial process with cell recycle. It`s proposed a protocol on this work, that simulates several stressful conditions of an industrial fermentation with cell recycle, to evaluate the yeast strains with different capabilities in colonize the fermentation tanks. The results indicate that the protocol utilized was capable of reproduce the physiological and technological behavior of the strains when they were submitted to the industrial process, making it a useful tool for yeast selection.

All these results advance our understanding on how stimulatory agents can be used to increase the production of useful metabolites by submerged fermentation of mushroom mycelium and indicate its potential biotechnological applications. / By use of one- and two-dimensional gels in proteomic analysis, some functional mycelial proteins that were differentially expressed by the addition of Tween 80 were identified. The up-regulation of heat shock proteins might help to maintain cellular viability under environmental stress. A down-regulation of YALI0E34793p and an up-regulation of ATP citrate lyase isoform 2 might suppress the activity of TCA cycle and subsequently stimulated the EPS production. Up-regulation of fatty acid synthase alpha subunit FasA might promote the synthesis of long-chain fatty acids and their incorporation into the mycelial cell membranes. Up-regulation of mitogen-activated protein kinase might facilitate the signal transduction in these processes. / The BPS, a highly branched glucomannan produced by the addition of Tween 80 in the fermentation broth of PTR mycelium had similar carbohydrate and protein content, monosaccharide composition and glycosidic linkages except by having a significantly lower molecular weight when compared to those of the control. Both BPS, with and without addition of Tween 80, could significantly inhibit (p < 0.05) the in vitro growth of a chronic myelogenous leukemia cells K562 in a dose dependent manner, with an estimated IC50 value of 43.7 and 47.6 microg/mL, respectively. / The effects of different kinds of stimulatory agents including fatty acids, surfactants and organic solvents were compared. The optimum results were achieved when 3.0 g/L Tween 80 was added to the fermentation broth on the 5th day of the fermentation, to give a maximum increase of 51.3 and 41.8% (p < 0.05) in the yield of mycelial biomass and BPS production, respectively. / The underlying mechanisms by which Tween 80 could increase the mycelial growth and EPS production in PTR were investigated by three novel approaches including changes in the nutrient uptake by mycelium, the morphology of mycelial pellets, and the fatty acid composition in the mycelial cell membrane. Firstly, the addition of Tween 80 significantly increased the glucose consumption rate by the mycelium, implying that the efficiency of nutrient uptake from the fermentation broth was enhanced. Secondly the addition of Tween 80 could extend the growth period of the mycelium possibly by maintaining the intact structure of the mycelial pellets and preventing its disintegration caused by shear stress in the fermentation system. Thirdly, the addition of Tween 80 could increase the incorporation of oleic acid which was a constituent of Tween 80 itself into the mycelial cell membrane of PTR, altering its fatty acid composition and increase the cell membrane permeability. The first two results explained the enhancement in the mycelial growth and EPS production while the last one was related to the extracellular transport of EPS to the fermentation broth. / This study aimed at comparing the effectiveness in the use of stimulatory agents with different chemical structures for enhancing the production of mycelial biomass and exopolysaccharide (BPS) by submerged fermentation of an edible mushroom Pleurotus tuber-regium (PTR). The chemical characteristics and antitumor activity of the BPS produced with and without the addition of the most effective stimulatory agent (Tween 80 which is a permitted food additive) were also compared. The underlying mechanisms by which Tween 80 could exert its effect on the mushroom mycelium were investigated by using chemical methods and microscopic techniques as well as proteomic analysis. / Zhang, Bobo. / Adviser: Chi Keung Peter Cheung. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 73-08, Section: B, page: . / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 132-156). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. Ann Arbor, MI : ProQuest Information and Learning Company, [200-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

No presente trabalho, primeiramente avaliou-se o desempenho fermentativo de 10 cepas de leveduras isoladas de frutas, de mel centrifugado e de resíduo do processamento de mel após a etapa de sedimentação (borra do mel), em tubo de ensaio contendo mosto constituído de Mel 15 °Brix suplementado, individualmente, com diferentes nutrientes, a saber: extrato de levedura comercial (10,0 g/L), farelo de arroz (20,0 g/L), mistura (1,0 g/L) constituída de farelos de milho, arroz e soja na proporção 5:2:5 e nutriente comercial (D&R) (0,15 g/L). Os parâmetros avaliados coexistiram da determinação do número de células em câmara de Neubauer e das concentrações de açúcares e etanol por HPLC, o que permitiu a determinação dos parâmetros rendimento, eficiência de fermentação e produtividade. Estes resultados sustentaram a seleção do mosto suplementado com extrato de levedura comercial e da melhor cepa de levedura que foram posteriormente avaliados em escala piloto. A cepa selecionada foi a levedura isolada a partir da borra de mel, a qual foi posteriormente identificada como Saccharomyces cerevisiae e nomeada Saccharomyces cerevisiae EEL 2009. A avaliação da produção de aguardente de mel em escala piloto foi realizada nas instalações do Alambique da Associação Rural de Canas, Canas-SP e o destilado obtido armazenado em tonel de carvalho de 200 L por 6 meses. Amostras foram coletadas a cada 30 dias para caracterização físico-química em conformidade com os parâmetros estabelecidos na Legislação Brasileira para aguardente de frutas. Em paralelo, as respectivas amostras foram devidamente avaliadas sensorialmente por 120 provadores não treinados, por meio de testes de aceitação, em escala hedônica, considerando os quesitos aparência, aroma, sabor, corpo e impressão global, além da atitude de compra. Estes resultados foram analisados estatisticamente por ANOVA e teste de Tukey, sendo os resultados de aceitação em relação à impressão global, analisados por meio da análise multivariada o que permitiu traçar o Mapa de Preferência Interno - MDPREF. Os resultados referentes à caracterização físico-química das respectivas amostras demonstraram que todas apresentaram os parâmetros de avaliação em conformidade com os padrões estabelecidos pela legislação. Os resultados da análise sensorial revelaram que o tempo de armazenamento de 180 dias em tonel de carvalho não foi suficiente para a ocorrência de reações desejadas, o que influenciaria nas características sensoriais da bebida, tornado-a mais agradável e suave. No entanto, apesar do pouco tempo de armazenamento, a aguardente de mel apresentou uma boa aceitação por parte dos provadores, cuja maioria manifestou sua aceitação em termos de \"gostei ligeiramente\" e \"não gostei, nem desgostei\". No tocante ao MDPREF, este revelou que a amostra referente a 180 dias de armazenamento foi preferida por um maior número de provadores. Em relação à atitude de compra, as amostras armazenadas por 60 (79,17%) e 180 dias (75,83%) apresentaram os melhores resultados. Diante do exposto, conclui-se que o mel se apresenta como uma alternativa viável para a formulação de mosto para produção de aguardente no período de entre safra de cana-de-açúcar, contribuindo para melhor aproveitamento das instalações e como fonte alternativa de renda para o produtor rural. / In this work, first it was evaluated the fermentation performance of 10 yeast strains isolated from fruits, centrifuged honey and residue of honey processing after the sedimentation (sludge honey) step. This experiment was carried out in test tube containing wort made from honey 15 °Brix supplemented individually with different nutrients, namely: commercial yeast extract (10.0 g/L), rice bran (20.0 g/L), mixture (1.0 g/L) consisting of bran corn, rice and soy in the ratio 5:2:5 and commercial nutrient (D&R) (0.15 g/L). The parameters evaluated included the cell number determination in Neubauer chamber, and sugars and ethanol concentrations by HPLC, which allowed to determine the fermentation parameters as yield, fermentation efficiency and productivity. These results supported the selection of the wort supplemented with commercial yeast extract and the best yeast strain, which were subsequently evaluated in a pilot scale. The selected strain was the yeast isolated from the sludge honey, which was later identified as Saccharomyces cerevisiae and named Saccharomyces cerevisiae EEL 2009. The production evaluation of honey spirit on a pilot scale was conducted at the Canas Rural Association Pilot Plant for cachaça production - Canas-SP and distillate was stored in oak barrel of 200 liters per 6 months. Samples were collected every 30 days for physic-chemical characterization in accordance with the guidelines established in the Brazilian Legislation for fruit spirit. Beyond that, the respective samples were properly sensory evaluated by 120 untrained consumers regarding to acceptance testing employing a hedonic scale, considering characteristics as appearance, aroma, flavor, and overall impression, and the attitude of purchase, as well. These results were statistically analyzes by ANOVA and Tukey`s test and the results of acceptance regarding to the overall impression, were analyzed by multivariate analysis which allowed tracing the Internal Preference Map - MDPREF. The results concerning the physic-chemical characterization of the respective samples showed that all presented the evaluation parameters in accordance with standards established by the legislation. The results of sensory analysis revealed that the storage time of 180 days in oak barrel was not enough for the occurrence of desired reactions, which influence the sensory characteristics of the beverage, making it nicer and smoother. However, despite short time storage, honey spirit showed good acceptance by the consumers. Most of them expressed acceptance in terms of \"liked slightly\" and \"not liked nor disliked\". Regarding the MDPREF results, these proved that the sample relating to 180 days of storage was preferred by majority of consumers. Regarding the attitude of purchase, the samples stored for 60 days (79.17%) and 180 days (75.83%) showed the best results. Therefore, we conclude that honey can be considered as a viable alternative for wort formulation for the production of spirit, mainly in the period between harvests of sugar cane, contributing to better utilization of the facilities and as alternative source of income for farmers.

As principais matérias-primas do chocolate, obtidas a partir das sementes secas do fruto do cacaueiro (Theobroma cacao), são a manteiga e o líquor de cacau. Para se obter matérias-primas de alta qualidade é necessário que o processo que antecede a industrialização, no caso a fermentação, seja padronizado para que sejam formados nas sementes os precursores de aroma, sabor e cor característica do chocolate. No interior do fruto do cacaueiro são encontradas as sementes envoltas por uma mucilagem composta por: água, pectina, sacarose, glicose, frutose, proteínas, ácidos e sais. O processo fermentativo do cacau ocorre sem qualquer tipo de inóculo ou padronização. Devido a este fato, os padrões de qualidade das sementes obtidas são as mais adversas e muitas vezes a presença de compostos interferentes e não desejáveis são formados ao longo desse caminho. Visando a otimização do processo fermentativo este trabalho teve por objetivo selecionar leveduras de ocorrência espontânea presentes na fermentação do cacau, reinoculá-las no processo natural in locu e comparar com o processo de ocorrência espontânea, avaliando assim o potencial do coquetel de leveduras a ser utilizado futuramente para padronizar o processo. Para tanto, foram isoladas 367 linhagens de leveduras de ocorrência espontânea em duas fazendas no sul da Bahia. As linhagens passaram por uma seleção onde foi implementado um programa de seleção composto por três ensaios: ensaio de crescimento em pectina; análise de Açúcar Redutor Total livre (ART); e avaliação de atividade enzimática. Foi possível selecionar três linhagens de leveduras promissoras com potencial pectinolítico as quais foram testadas in locu no município de Itabuna-BA. O processo de isolamento, seleção e reintrodução das linhagens selecionadas no processo fermentativo do cacau se mostrou uma prática altamente eficaz. Os resultados obtidos com a inoculação inicial de leveduras selecionadas, antecipou os eventos como produção de etanol, ácido acético, drenagem do mel e elevação da temperatura em 24 horas em relação ao controle. / The fundamental raw material to produce chocolate, obtained from dried seeds of cocoa fruit (Theobroma cacao), are butter and cocoa liquor. In order to obtain high quality of raw materials, it is necessary standardize the procedure before industrialization, known as fermentation, so that the aroma, taste and color precursors of chocolate must be formed in the seeds. Inside the fruits exists a white mucilaginous pulp, which covers the beans, it contains water, pectin, sucrose, glucose, fructose, proteins, acids and salts. The fermentation of cocoa seeds occurs in wooden boxes or piles on the ground without any control or standardization. Due to this fact, the quality of the seeds are the most adverse, the presence are often of interfering compounds and undesirable products could be formed along the way. To optimize the fermentation process this study aimed to select pectinolytic yeasts of spontaneous occurrence from cocoa fermentation, re-inoculate them in the natural process and compare with the spontaneously occurring process. Consequently evaluate the yeast cocktail potential as a standard inoculum. Therefore, we isolated 367 yeast strains from spontaneous cocoa fermentation in two different farms in southern Bahia - Brazil. The strains were analyze to a selection-screening program, which consists of three tests: ability to grow in pectin medium; Total free Reducing Sugar Analysis (ARTL); and evaluation of enzyme activity. It was possible to select three yeast strains with promising pectinolitic potential. Those strains were tested in locu in Itabuna-BA, Brazil. The results of that program, selection and re-introduction in the fermentation process proved to be a highly effective practice. The results obtained with the initial inoculation of selected yeasts, could anticipate the fermentation events in 24 hours, such as the production of ethanol, acetic acid, sweating drainage and temperature rise when compared with the control.

Em caso de envenenamento ofídico, o tratamento no Brasil hoje é realizado pela administração de soros geralmente produzidos por equinos, que apresentam eficácia limitada: são úteis para os efeitos sistêmicos, mas não inibem efetivamente a evolução dos danos locais, podem causar reações adversas e apresentam alto custo de produção. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), trata-se de uma doença negligenciada pelas autoridades científicas mundiais. O presente projeto, em parceria com o Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais da Fundação Oswaldo Cruz - Rondônia, propõe a produção por Escherichia coli de fragmentos de anticorpos de cadeia pesada de camelídeos, denominados VHH, contra as toxinas do veneno de Bothrops jararacussu, utilizando biorreator. Neste trabalho há interesse em produzir VHH, através da otimização do crescimento desta E. coli. A cinética do crescimento bacteriano foi realizada em shaker orbital sob diferentes condições, variando tamanho do frasco, rotação do shaker, composição do meio de cultura e concentração de substrato; e em biorreatores, alternando meios de cultura e modo de operação do reator (descontínuo e descontínuo alimentado), alterando a vazão de alimentação (linear e exponencial) O processo cinético é fortemente limitado pela formação de acetato, por condições auxotróficas da célula e pela transferência de oxigênio. Nos ensaios em frascos agitados, uma melhor condição de crescimento foi obtida utilizando frascos de 1 L, sob rotação a 270 rpm e 5,0 g/L de glicose. Nos ensaios em reator, quando operados em batelada obtiveram-se cerca 5,5 g/L de células finais, contra 9,3 g/L de células em batelada alimentada com vazão constante. Um maior crescimento foi ainda obtido em um reator de 2 L em regime de batelada alimentada exponencialmente. O biorreator varia a agitação do meio e mantém um nível pré-definido de oxigênio dissolvido, evitando a limitação de oxigênio e controlando a oferta de glicose para o crescimento celular. Neste processo, atingimos 25,6 g/L de células e 0,35 g/L de proteína total após purificação, utilizando meio M9 suplementado. / Nowadays in Brazil, the treatment for snakebite poisoning is carried out by the administration of horse sera, which have limited effectiveness: they are useful for systemic effects, but do not effectively inhibit local damage, cause adverse reactions, and present high production costs. According to the WHO, this disease is neglected by the world`s scientific authorities. This project, in partnership with the Institute for Research in Tropical Diseases of Oswaldo Cruz Foundation - Rondonia, proposes the production of heavy chain antibody fragments from camelids, called VHH, using Escherichia coli, to be used against the toxins from the Bothrops jararacussu poison, using a bioreactor. This work is interested in producing VHH through the use of E. coli. The kinetics of bacterial growth were performed in orbital shaker under different conditions, varying vial size, shaker rotation, composition of the culture medium and substrate concentration; and bioreactors, alternating culture media and operation mode of reactor (batch and fed-batch), changing feeding rate (linear and exponential). The kinetic process is statically bound to acetate formation, auxotrophic conditions of the cell and oxygen transfer. In assays in shaken flasks, an output of 270 rpm and 5.0 g/L of glucose. In reactor runs, when operated in a batch 5.5 g/L of final cells were obtained, against 9.3 g/L of final cells in fed-batch with constant flowrate. A larger value was obtained in an exponentially fed-batch reactor of 2 L. The bioreactor varies the agitation of oxygen and controls glucose addition for cell growth. In this process, 25.6 g/L cells and 0.35 g/L total protein after purification were reached, using supplemented M9 medium.

This thesis aimed at investigating a process based on anaerobic mixed culture fermentation (AMCF) of organic waste to produce carboxylates, molecular hydrogen and ethanol. The novelty of this study was to estimate the potential production of these bulk chemicals from selected renewable feedstocks and to experimentally investigate their production from the AMCF of three distinct types of feedstock without physicochemical pre-treatment: grass, a lignocellulosic substrate; cheese whey, a lactose-rich residue; and fish processing wastewater, a complex effluent containing proteins and fats. The estimation showed that AMCF of a small fraction (less than 1.6%) of the selected feedstock would be required to suffice the current production of carboxylates from oil-based feedstock, whilst up to 51% of the feedstock would be needed to satisfy the current production of ethanol and molecular hydrogen. In the experiments with AMCF of grass, low organic loading rates and long solids retention times were required to increase the substrate conversion because of the hard-biodegradability found in the substrate without any physicochemical pre-treatment. For the AMCF of cheese whey, the production of carboxylates decreased the pH to low levels and consequently inhibited the fermentation. For the AMCF of fish processing wastewater, the feedstock showed high biodegradability with production of biogas under batch condition and stable production of carboxylates under semi-continuous condition. The release of ammonium during the degradation of proteins was considered one of the main factors to avoid the pH drop when carboxylates were produced throughout the fermentation. In conclusion, the study showed that the feedstock nature and the operating condition play a key role in how to drive the AMCF to the production of these chemicals and avoid methanogenesis. Whilst hydrolysis limits the fermentation for hardly biodegradable feedstock, volatile fatty acids formation and pH inhibit the AMCF of more easily biodegradable feedstock.

Resumo: O experimento foi realizado no Departamento de Zootecnia da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo no Campus da USP, em Pirassununga-SP. Foram utilizados 4 bovinos da raça Nelore, castrados, com peso corporal médio de 550 kg e providos de cânulas ruminais, alimentados com dietas contendo diferentes níveis de sais de cálcio de ácidos graxos: 0, 1, 2, e 4%, em um delineamento em quadrado latino (4x4). Amostras de líquido ruminal foram colhidas e submetidas a mensurações de pH, variação da amônia ruminal e coletas de sangue para a determinação da uréia plasmática. O pH não foi influenciado pelos níveis de sais de cálcio de ácidos graxos (P>0,05), bem como, para o efeito tempo (P>0,05); indicando ser pouco provável ter ocorrido dissociação de sais de cálcio de ácidos graxos em relação aos níveis de inclusão. Os efeitos de tratamento e de tempo não apresentaram diferenças estatísticas significativas (P>0,05) na concentração de amônia no rúmen, demonstrando que os sais de cálcio de ácidos graxos não interferiu na fermentação ruminal. Observou-se que os valores de uréia plasmática (NUS) não foram significativos nos efeitos de tratamento e tempo (P>0,05) pelos níveis de sais de cálcio de ácidos graxos. / Abstract: The experiment was carried out at the "Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos" of the Universidade de São Paulo. Four crossbred Nerolle steers with 550 kg of live weight and fitted with rumen cannulas were fed diets with 0, 1, 2 or 4% of calcium salts of fatty acids, in 4 x 4 a latin square design. Rumen liquid sampled was for pH, rumen ammonia concentration and plasma urea measurements. The pH of the rumen liquid was not influenced by the levels of calcium salts of fatty acids (P>0,05), as well as, there was no influence of sampling time on pH, indicating that probably there was no dissociation of the calcium salts of fatty acids. The sampling time and treatment also had no effect (P>0,05) on the ammonia concentration in the rumen, demonstrating that the calcium salts of fatty acids had no effect in the ruminal fermentation. It was not observed significant effects of calcium salts of fatty acids level or time on plasmatic urea values (NUS) (P>0,05). / Orientador: Alexandrs Spers / Coorientador: José Carlos Machado Nogueira Filho / Doutor

Considerando o crescimento do setor sucroenergético na última década e a busca por combustíveis renováveis, a fim de reduzir a dependência aos combustíveis fósseis, pesquisas nas áreas de açúcar e álcool estão comumente ligadas ao desenvolvimento de tecnologias que visem obtenção de processos e produtos com qualidade, lucro, altos rendimentos, minimização de perdas e gastos. O desenvolvimento de equipamentos e procedimentos analíticos que busquem vantagens competitivas em relação às metodologias convencionais está cada dia mais evidente e no processo de produção de açúcar e álcool, faz-se cada vez mais usuais. Uma dessas técnicas analíticas é a cromatografia. Por isso, a necessidade de trabalhos que avaliem técnicas cromatográficas aumenta diariamente, visto a importância que essas têm dentro do processo produtivo, no controle de qualidade e para a tomada de decisões. Por esses motivos, o objetivo deste trabalho foi avaliar o uso da técnica de cromatografia de íons para o controle analítico e de qualidade em fermentações para a produção de etanol. Para a realização deste estudo, inicialmente foi realizada validação da metodologia para análise de açúcares e depois foram realizados ensaios de fermentação. Os ensaios consistiram em fermentações com três tipos de mostos diferentes (três tratamentos), sendo os mostos obtidos a partir de caldo ou de xarope ou misto ( caldo + xarope), com teores de ART (açúcares redutores totais, respectivamente de 146,26 (±1,53) g L-1, 148,61 (±3,62) g L-1 e 158,35 (±4,67) g L-1, resultados estes obtidos pela cromatografia iônica e 107,75 (±3,19) g L-1, 115,90 (±10,41) g L-1 e 134,53 (±8,33) g L-1 para os mostos a base de caldo, xarope e misto, quando analisados pela metodologia convencional. Cada tratamento foi feito em cinco repetições, utilizando 300 mL de mosto cada, onde foram inoculados 9g de levedura Saccharomyces cerevisiae. Os pârametros analisados foram: viabilidade celular, brotamento, brotos vivos das leveduras, teores de Brix, teores de AR e ART por cromatografia iônica e por DNS, eficiência e rendimento fermentativo. Os resultados obtidos para AR final no caldo, xarope e misto na análise cromatográfica foram de 0,197 (±0,04) g L-1, 0,283 (±0,12) g L-1 e 0,259 (±0,08) g L-1 , respectivamente. Por outro lado, nas análises por DNS foram obtidos valores de: 0,352 (±0,14) g L-1, 0,811 (±0,03) g L-1 e 0,572 (±0,03) g L-1, respectivamente. Os valores de ART no vinho encontrados no caldo, xarope e misto por cromatografia foram 0,231 (±0,05) g L-1, 0,358 (±0,09) g L-1 e 0,335 (±0,19) g L-1 enquanto por DNS os teores foram 0,389 (±0,04) g L-1, 1,521 (±0,20) g L-1 e 0,906 (±0,21) g L-1. Estes valores geraram rendimentos fermentativos médios nos mostos fermentados obtidos a partir de caldo de cana, xarope e xarope + caldo de cana, foram 89,77 %, 83,59% e 76,65 %, respectivamente. Nos mostos fermentados obtidos a partir de caldo de cana, xarope e xarope + caldo de cana, os rendimento fermentativos foram 121,88 %, 106,82 e 90,23% para as análises cromatográficas e DNS, respectivamente. Conclui-se que, a técnica de cromatografia de íons quando utilizada para o controle analítico da fermentação alcoólica permite ter como vantagens em relação às técnicas convencionais analisadas, precisão, exatidão e robustez do método, rapidez de análise e facilidade no preparo das amostras, além de versatilidade, sendo capaz de analisar outros compostos de uma mesma amostra analítica, tais como ácidos, cátions e ânions, sendo capaz de fornecer resultados confiáveis para o controle analítico e de qualidade e monitoramento em fermentações para a produção de etanol. / Considering the growth of the sugar-energy sector in the last decade and the search for renewable fuels, in order to reduce dependence on fossil fuels, research in the areas of sugar and alcohol are commonly linked to the development of technologies that aim at obtaining processes and products with quality, high profit, and loss and expense minimization. The development of equipment and analytical procedures that seek competitive advantages over conventional methodologies is increasing, and arriving at the plants and distilleries for the production of sugar and alcohol, becoming more and more usual. Such is the case of chromatography. The necessity for research evaluating chromatographic techniques increases daily, considering the importance they have within the production process and in quality control. Thus, this work aims to evaluate the use of chromatographic techniques for analytical and quality controls in fermentations for ethanol production, through sugar analysis by traditional methods and ion chromatography. For the accomplishment of this study, initially the sugar analysis methodology was validated, and then fermentation tests were carried out. Such tests consisted of three treatments, each one of them composed of broth, syrup and mixed content (broth + syrup), with the respective Total Reducing Sugars (ART) of 146,26(±1,53) g L-1, 148,61 (±3,62) g L-1 and 158,35 (±4,67) g L-1, wen obtained by ionic chromatography, and, respectively, of 107,75 (±3,19) g L-1, 115,90 (±10,41) g L-1 and 134,53 (±8,33) g L-1 through the conventional methodology. Each treatment had five repetitions, with 300ml of wort each, where 9g of Saccharomyces cerevisae yeast were inoculated. The parameters evaluated were: cell viability, budding, living buds of yeast, °Brix levels, AR and ART levels through ionic chromatography and traditional method, efficiency and fermentative yield. The AR obtained results were 0,197 (±0,04) g L-1, 0,283 (±0,12) g L-1 and 0,259 (±0,08) g L-1 respectively for broth, syrup and mixture in the ionic chromatographic analysis, and 0,352 (±0,14) g L-1, 0,811 (±0,03) g L-1 and 0,572 (±0,03) g L-1 in the traditional analysis method. The ART obtained results were 0,231 (±0,05) g L-1, 0,358 (±0,09) g L-1 and 0,335 (±0,19) g L-1 through the chromatographic method and 0,389 (±0,04) g L-1, 1,521 (±0,20) g L-1 e 0,906 (±0,21) g L-1 through the traditional method. These values generated mean fermentative yields of respectively 89,77%, 83,59% and 76,65% for broth, syrup and mixed samples, in the chromatographic analysis and 121,88%, 106,82% and 90,23%, in the conventional analysis. The fermentative efficiency was satisfactory for the chromatographical methodology, with means of 83,25%, versus 106,31% of the conventional methodology. It was concluded that the ionic chromatography technique, when used for the analytical control of alcoholic fermentation, has advantages when compared to the analyzed conventional technique, such as precision, accuracy and methodological robustness, faster analysis, shorter sample preparation time, and versatility, being capable of analyzing different substances in the same source, such as acids, cations and anions, being capable of supplying trustworthy results for analytical and quality control and the surveillance of fermentations for ethanol production.

Considerando o crescimento do setor sucroenergético na última década e a busca por combustíveis renováveis, a fim de reduzir a dependência aos combustíveis fósseis, pesquisas nas áreas de açúcar e álcool estão comumente ligadas ao desenvolvimento de tecnologias que visem obtenção de processos e produtos com qualidade, lucro, altos rendimentos, minimização de perdas e gastos. O desenvolvimento de equipamentos e procedimentos analíticos que busquem vantagens competitivas em relação às metodologias convencionais está cada dia mais evidente e no processo de produção de açúcar e álcool, faz-se cada vez mais usuais. Uma dessas técnicas analíticas é a cromatografia. Por isso, a necessidade de trabalhos que avaliem técnicas cromatográficas aumenta diariamente, visto a importância que essas têm dentro do processo produtivo, no controle de qualidade e para a tomada de decisões. Por esses motivos, o objetivo deste trabalho foi avaliar o uso da técnica de cromatografia de íons para o controle analítico e de qualidade em fermentações para a produção de etanol. Para a realização deste estudo, inicialmente foi realizada validação da metodologia para análise de açúcares e depois foram realizados ensaios de fermentação. Os ensaios consistiram em fermentações com três tipos de mostos diferentes (três tratamentos), sendo os mostos obtidos a partir de caldo ou de xarope ou misto ( caldo + xarope), com teores de ART (açúcares redutores totais, respectivamente de 146,26 (±1,53) g L-1, 148,61 (±3,62) g L-1 e 158,35 (±4,67) g L-1, resultados estes obtidos pela cromatografia iônica e 107,75 (±3,19) g L-1, 115,90 (±10,41) g L-1 e 134,53 (±8,33) g L-1 para os mostos a base de caldo, xarope e misto, quando analisados pela metodologia convencional. Cada tratamento foi feito em cinco repetições, utilizando 300 mL de mosto cada, onde foram inoculados 9g de levedura Saccharomyces cerevisiae. Os pârametros analisados foram: viabilidade celular, brotamento, brotos vivos das leveduras, teores de Brix, teores de AR e ART por cromatografia iônica e por DNS, eficiência e rendimento fermentativo. Os resultados obtidos para AR final no caldo, xarope e misto na análise cromatográfica foram de 0,197 (±0,04) g L-1, 0,283 (±0,12) g L-1 e 0,259 (±0,08) g L-1 , respectivamente. Por outro lado, nas análises por DNS foram obtidos valores de: 0,352 (±0,14) g L-1, 0,811 (±0,03) g L-1 e 0,572 (±0,03) g L-1, respectivamente. Os valores de ART no vinho encontrados no caldo, xarope e misto por cromatografia foram 0,231 (±0,05) g L-1, 0,358 (±0,09) g L-1 e 0,335 (±0,19) g L-1 enquanto por DNS os teores foram 0,389 (±0,04) g L-1, 1,521 (±0,20) g L-1 e 0,906 (±0,21) g L-1. Estes valores geraram rendimentos fermentativos médios nos mostos fermentados obtidos a partir de caldo de cana, xarope e xarope + caldo de cana, foram 89,77 %, 83,59% e 76,65 %, respectivamente. Nos mostos fermentados obtidos a partir de caldo de cana, xarope e xarope + caldo de cana, os rendimento fermentativos foram 121,88 %, 106,82 e 90,23% para as análises cromatográficas e DNS, respectivamente. Conclui-se que, a técnica de cromatografia de íons quando utilizada para o controle analítico da fermentação alcoólica permite ter como vantagens em relação às técnicas convencionais analisadas, precisão, exatidão e robustez do método, rapidez de análise e facilidade no preparo das amostras, além de versatilidade, sendo capaz de analisar outros compostos de uma mesma amostra analítica, tais como ácidos, cátions e ânions, sendo capaz de fornecer resultados confiáveis para o controle analítico e de qualidade e monitoramento em fermentações para a produção de etanol. / Considering the growth of the sugar-energy sector in the last decade and the search for renewable fuels, in order to reduce dependence on fossil fuels, research in the areas of sugar and alcohol are commonly linked to the development of technologies that aim at obtaining processes and products with quality, high profit, and loss and expense minimization. The development of equipment and analytical procedures that seek competitive advantages over conventional methodologies is increasing, and arriving at the plants and distilleries for the production of sugar and alcohol, becoming more and more usual. Such is the case of chromatography. The necessity for research evaluating chromatographic techniques increases daily, considering the importance they have within the production process and in quality control. Thus, this work aims to evaluate the use of chromatographic techniques for analytical and quality controls in fermentations for ethanol production, through sugar analysis by traditional methods and ion chromatography. For the accomplishment of this study, initially the sugar analysis methodology was validated, and then fermentation tests were carried out. Such tests consisted of three treatments, each one of them composed of broth, syrup and mixed content (broth + syrup), with the respective Total Reducing Sugars (ART) of 146,26(±1,53) g L-1, 148,61 (±3,62) g L-1 and 158,35 (±4,67) g L-1, wen obtained by ionic chromatography, and, respectively, of 107,75 (±3,19) g L-1, 115,90 (±10,41) g L-1 and 134,53 (±8,33) g L-1 through the conventional methodology. Each treatment had five repetitions, with 300ml of wort each, where 9g of Saccharomyces cerevisae yeast were inoculated. The parameters evaluated were: cell viability, budding, living buds of yeast, °Brix levels, AR and ART levels through ionic chromatography and traditional method, efficiency and fermentative yield. The AR obtained results were 0,197 (±0,04) g L-1, 0,283 (±0,12) g L-1 and 0,259 (±0,08) g L-1 respectively for broth, syrup and mixture in the ionic chromatographic analysis, and 0,352 (±0,14) g L-1, 0,811 (±0,03) g L-1 and 0,572 (±0,03) g L-1 in the traditional analysis method. The ART obtained results were 0,231 (±0,05) g L-1, 0,358 (±0,09) g L-1 and 0,335 (±0,19) g L-1 through the chromatographic method and 0,389 (±0,04) g L-1, 1,521 (±0,20) g L-1 e 0,906 (±0,21) g L-1 through the traditional method. These values generated mean fermentative yields of respectively 89,77%, 83,59% and 76,65% for broth, syrup and mixed samples, in the chromatographic analysis and 121,88%, 106,82% and 90,23%, in the conventional analysis. The fermentative efficiency was satisfactory for the chromatographical methodology, with means of 83,25%, versus 106,31% of the conventional methodology. It was concluded that the ionic chromatography technique, when used for the analytical control of alcoholic fermentation, has advantages when compared to the analyzed conventional technique, such as precision, accuracy and methodological robustness, faster analysis, shorter sample preparation time, and versatility, being capable of analyzing different substances in the same source, such as acids, cations and anions, being capable of supplying trustworthy results for analytical and quality control and the surveillance of fermentations for ethanol production.