O câncer de mama é o tipo mais frequente de neoplasia maligna entre as mulheres, com a incidência de mais de um milhão de novos casos no mundo, por ano. O gene TP53 é responsável por regular o destino da célula em resposta a estresses genotóxicos e não genotóxicos. Mutações somáticas neste gene são encontradas em, aproximadamente, 50% dos carcinomas humanos. No câncer de mama, a frequência das mutações no TP53 é em torno de 20 a 50%, sendo a alteração mais encontrada. Estas mutações podem alterar a conformação da proteína, prejudicando sua função de ativadora da transcrição de genes alvo e, pode levar a p53 a apresentar tendência à agregação. Neste trabalho, foi realizado a análise da presença de mutações nos exons 5 a 10 do gene TP53, em biópsias de câncer de mama, de mulheres residentes na cidade do Rio de Janeiro. Após a identificação das amostras com mutação em TP53, algumas foram selecionadas para se verificar o comportamento das diversas mutantes quanto à formação de agregados de p53, em cortes histológicos dos tumores de mama. Foram utilizados os anticorpos A11 e DO1, que reconhecem oligômeros pré-fibrilares e a p53 mutante ou selvagem, respectivamente. Para tanto, foi utilizado o ensaio de co-localização por imunofluorescência, utilizando microscópio confocal para a observação dos resultados. Mutações no gene TP53 foram detectadas em 19% dos casos analisados de câncer de mama sendo 88,2% do tipo &#8213;missense&#8214;. Estas mutações, em tumores do tipo carcinoma ductal infiltrante (CDI), estavam associadas a um estágio mais tardio e agressivo de câncer, representado pelo Grau III de Elston (p< 0,0001). Também foi observada relação positiva dos tumores com mutações e o acúmulo da p53 (p= 0,0184). Além disso, foi observado um padrão diferente das mutantes de p53 quanto à tendência a agregação, sendo as mutantes R273H e P278A as que apresentaram uma maior agregação. Assim, a agregação da p53 mutante observada &#8213;in vivo&#8214; e descrita nesta dissertação, parece depender do tipo de mutação observada nos casos de câncer de mama. / Breast cancer is the most frequent cancer in women, with 1 million of new cases in the world each year. The TP53 gene is responsible for the regulation of the cells fate in response to genotoxic and non-genotoxic stress. Somatic TP53 mutations are found in, approximately, 50% of human cancers. In breast cancer, TP53 mutation is the most frequent genetic alteration, being present in 20 to 50% of cases. These mutations may change the protein conformation, impairing the transcription of target genes, and may lead the mutant p53 to aggregate. In this study, we analyzed the presence of mutations in exons 5-10 of TP53 in breast cancer biopsies of women resident in the metropolitan area of Rio de Janeiro. After the determination of samples with mutation, some of them were selected to investigate the behavior of different mutants in the formation of p53 aggregates in tumors using A11 and DO-1 antibodies, which recognizes pre-fibrillar oligomers and mutant or wild-type p53, respectively. So, we utilized a immunofluorescence co-localization assay using confocal microscope. TP53 mutations were detected in 19% of the breast cancer cases, with 88.2% of missense type. These mutations, in tumors classified as infiltrating ductal carcinoma (CDI), were associated with a later and aggressive stage of cancer, represented by Elstons Grade III (p< 0.0001). A relation was also observed between these mutations and p53 accumulation (p= 0.0184). Furthermore, a different pattern of p53 mutants for the tendency to aggregate was observed and we detected that the mutants R273H and P278A showed a greater aggregation. Thus, the mutant p53 aggregation observed in vivo and described in this study, seems to depend on the type of mutation found in breast cancer cases.

O câncer de mama é o tipo mais frequente de neoplasia maligna entre as mulheres, com a incidência de mais de um milhão de novos casos no mundo, por ano. O gene TP53 é responsável por regular o destino da célula em resposta a estresses genotóxicos e não genotóxicos. Mutações somáticas neste gene são encontradas em, aproximadamente, 50% dos carcinomas humanos. No câncer de mama, a frequência das mutações no TP53 é em torno de 20 a 50%, sendo a alteração mais encontrada. Estas mutações podem alterar a conformação da proteína, prejudicando sua função de ativadora da transcrição de genes alvo e, pode levar a p53 a apresentar tendência à agregação. Neste trabalho, foi realizado a análise da presença de mutações nos exons 5 a 10 do gene TP53, em biópsias de câncer de mama, de mulheres residentes na cidade do Rio de Janeiro. Após a identificação das amostras com mutação em TP53, algumas foram selecionadas para se verificar o comportamento das diversas mutantes quanto à formação de agregados de p53, em cortes histológicos dos tumores de mama. Foram utilizados os anticorpos A11 e DO1, que reconhecem oligômeros pré-fibrilares e a p53 mutante ou selvagem, respectivamente. Para tanto, foi utilizado o ensaio de co-localização por imunofluorescência, utilizando microscópio confocal para a observação dos resultados. Mutações no gene TP53 foram detectadas em 19% dos casos analisados de câncer de mama sendo 88,2% do tipo &#8213;missense&#8214;. Estas mutações, em tumores do tipo carcinoma ductal infiltrante (CDI), estavam associadas a um estágio mais tardio e agressivo de câncer, representado pelo Grau III de Elston (p< 0,0001). Também foi observada relação positiva dos tumores com mutações e o acúmulo da p53 (p= 0,0184). Além disso, foi observado um padrão diferente das mutantes de p53 quanto à tendência a agregação, sendo as mutantes R273H e P278A as que apresentaram uma maior agregação. Assim, a agregação da p53 mutante observada &#8213;in vivo&#8214; e descrita nesta dissertação, parece depender do tipo de mutação observada nos casos de câncer de mama. / Breast cancer is the most frequent cancer in women, with 1 million of new cases in the world each year. The TP53 gene is responsible for the regulation of the cells fate in response to genotoxic and non-genotoxic stress. Somatic TP53 mutations are found in, approximately, 50% of human cancers. In breast cancer, TP53 mutation is the most frequent genetic alteration, being present in 20 to 50% of cases. These mutations may change the protein conformation, impairing the transcription of target genes, and may lead the mutant p53 to aggregate. In this study, we analyzed the presence of mutations in exons 5-10 of TP53 in breast cancer biopsies of women resident in the metropolitan area of Rio de Janeiro. After the determination of samples with mutation, some of them were selected to investigate the behavior of different mutants in the formation of p53 aggregates in tumors using A11 and DO-1 antibodies, which recognizes pre-fibrillar oligomers and mutant or wild-type p53, respectively. So, we utilized a immunofluorescence co-localization assay using confocal microscope. TP53 mutations were detected in 19% of the breast cancer cases, with 88.2% of missense type. These mutations, in tumors classified as infiltrating ductal carcinoma (CDI), were associated with a later and aggressive stage of cancer, represented by Elstons Grade III (p< 0.0001). A relation was also observed between these mutations and p53 accumulation (p= 0.0184). Furthermore, a different pattern of p53 mutants for the tendency to aggregate was observed and we detected that the mutants R273H and P278A showed a greater aggregation. Thus, the mutant p53 aggregation observed in vivo and described in this study, seems to depend on the type of mutation found in breast cancer cases.

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é caracterizada por inflamação crônica e alterações estruturais que levam a obstrução das pequenas vias aéreas e destruição do parênquima alveolar. A composição da matriz extracelular (MEC) nos pulmões tem um importante papel em prover e sustentar a arquitetura pulmonar. No entanto, não há uma descrição abrangente da composição da matriz extracelular no trato respiratório de indivíduos portadores de DPOC. No presente estudo investigou-se a composição da MEC das vias aéreas grandes (VAG), pequenas (VAP) e do parênquima pulmonar de pacientes com DPOC. Utilizando imunohistoquímica e análise de imagem analisou-se a área fracionada de fibras elásticas, colágenos I, III e IV, versicam, decorina, biglicano, lumicam, fibronectina e tenascina nas VAG, VAP e no parênquima peribrônquico e distal de 26 indivíduos com DPOC e comparou-se à área fracionada nos pulmões de 26 fumantes sem DPOC e 16 indivíduos não fumantes. A área fracionada de fibras elásticas foi significante maior no grupo de fumantes não obstruídos em comparação com os demais grupos, em todos os compartimentos analisados. Houve menor expressão de colágeno I na camada interna das VAG e nas camadas interna, muscular e externa das VAP dos indivíduos com DPOC e na camada externa das VAP dos fumantes não obstruídos quando comparados ao grupo controle. A área fracionada de versicam mostrou-se menor apenas no parênquima distal do grupo DPOC comparado ao grupo controle. O estudo da matriz de glicoproteínas mostrou maior área fracionada de fibronectina nas camadas interna, muscular e externa das VAP dos indivíduos com DPOC comparados aos demais grupos, assim como maior área fracionada de tenascina foi observado na membrana basal das VAG e na camada interna das VAP do grupo DPOC comparados aos controles. Além disso, a composição da MEC correlacionou-se com valores funcionais, como o VEF1 (% predito). A partir desses resultados, concluímos que a DPOC é caracterizada por complexas alterações nas principais proteínas estruturais nas pequenas e grandes vias aéreas. Tais alterações podem contribuir para a lesão tecidual persistente e com a obstrução ao fluxo aéreo observado na DPOC / COPD is characterized by chronic inflammation and structural alterations leading to small airway obstruction and to destruction of the lung parenchyma. The extracellular matrix (ECM) composition of the lungs has an important role in determining airway structure. However, there are no comprehensive descriptions of the ECM composition along the respiratory tract in COPD patients. We postulated that the ECM composition in large and small airways and in lung parenchyma of COPD patients differs from that observed in smoking and non-smoking controls. Using immunohistochemistry and image analysis, fractional areas of elastic fibers, type-I, -III and IV collagen, the proteoglycans versican, decorin, biglycan and lumican; fibronectin and tenascin were quantified in the large (LA) and small airways (SA), in peribronchiolar (PP) and distal parenchyma (DP) of 26 COPD patients and compared to 26 smokers without COPD and 16 non-smoking controls. The fractional area of elastic fibers was higher in non-obstructed smokers than in COPD and non-smoking controls subjects, in all lung compartments. Type-I collagen fractional area was lower in the inner layer of LA and in the inner, muscle and outer layer (OL) of SA of COPD patients and in the OL of SA of non-obstructed smokers when compared to non-smoking controls. The versican fractional area was lower in DP of COPD patients than non-smokers. Fibronectin fractional área was higher in the inner, muscle and outer layer of SA of COPD patients compared to non-smokers. Tenascin fractional area was higher in the subepithelial area of LA and inner layer of SA of COPD when compared to non-smoking controls. Furthermore, ECM composition correlated with FEV1% predicted. Architectural alterations due to an altered ECM composition in COPD are likely to contribute to the persistent tissue injury and to the airflow obstruction characteristic of this disease

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é caracterizada por inflamação crônica e alterações estruturais que levam a obstrução das pequenas vias aéreas e destruição do parênquima alveolar. A composição da matriz extracelular (MEC) nos pulmões tem um importante papel em prover e sustentar a arquitetura pulmonar. No entanto, não há uma descrição abrangente da composição da matriz extracelular no trato respiratório de indivíduos portadores de DPOC. No presente estudo investigou-se a composição da MEC das vias aéreas grandes (VAG), pequenas (VAP) e do parênquima pulmonar de pacientes com DPOC. Utilizando imunohistoquímica e análise de imagem analisou-se a área fracionada de fibras elásticas, colágenos I, III e IV, versicam, decorina, biglicano, lumicam, fibronectina e tenascina nas VAG, VAP e no parênquima peribrônquico e distal de 26 indivíduos com DPOC e comparou-se à área fracionada nos pulmões de 26 fumantes sem DPOC e 16 indivíduos não fumantes. A área fracionada de fibras elásticas foi significante maior no grupo de fumantes não obstruídos em comparação com os demais grupos, em todos os compartimentos analisados. Houve menor expressão de colágeno I na camada interna das VAG e nas camadas interna, muscular e externa das VAP dos indivíduos com DPOC e na camada externa das VAP dos fumantes não obstruídos quando comparados ao grupo controle. A área fracionada de versicam mostrou-se menor apenas no parênquima distal do grupo DPOC comparado ao grupo controle. O estudo da matriz de glicoproteínas mostrou maior área fracionada de fibronectina nas camadas interna, muscular e externa das VAP dos indivíduos com DPOC comparados aos demais grupos, assim como maior área fracionada de tenascina foi observado na membrana basal das VAG e na camada interna das VAP do grupo DPOC comparados aos controles. Além disso, a composição da MEC correlacionou-se com valores funcionais, como o VEF1 (% predito). A partir desses resultados, concluímos que a DPOC é caracterizada por complexas alterações nas principais proteínas estruturais nas pequenas e grandes vias aéreas. Tais alterações podem contribuir para a lesão tecidual persistente e com a obstrução ao fluxo aéreo observado na DPOC / COPD is characterized by chronic inflammation and structural alterations leading to small airway obstruction and to destruction of the lung parenchyma. The extracellular matrix (ECM) composition of the lungs has an important role in determining airway structure. However, there are no comprehensive descriptions of the ECM composition along the respiratory tract in COPD patients. We postulated that the ECM composition in large and small airways and in lung parenchyma of COPD patients differs from that observed in smoking and non-smoking controls. Using immunohistochemistry and image analysis, fractional areas of elastic fibers, type-I, -III and IV collagen, the proteoglycans versican, decorin, biglycan and lumican; fibronectin and tenascin were quantified in the large (LA) and small airways (SA), in peribronchiolar (PP) and distal parenchyma (DP) of 26 COPD patients and compared to 26 smokers without COPD and 16 non-smoking controls. The fractional area of elastic fibers was higher in non-obstructed smokers than in COPD and non-smoking controls subjects, in all lung compartments. Type-I collagen fractional area was lower in the inner layer of LA and in the inner, muscle and outer layer (OL) of SA of COPD patients and in the OL of SA of non-obstructed smokers when compared to non-smoking controls. The versican fractional area was lower in DP of COPD patients than non-smokers. Fibronectin fractional área was higher in the inner, muscle and outer layer of SA of COPD patients compared to non-smokers. Tenascin fractional area was higher in the subepithelial area of LA and inner layer of SA of COPD when compared to non-smoking controls. Furthermore, ECM composition correlated with FEV1% predicted. Architectural alterations due to an altered ECM composition in COPD are likely to contribute to the persistent tissue injury and to the airflow obstruction characteristic of this disease

Descrevemos modelo original de sinovite experimental em coelhos imunizados com colágeno V com escasso processo inflamatório, intenso remodelamento matricial e vasculite. Analise morfológica e bioquímica foi realizada em coelhas Nova Zelândia (N=20) imunizadas com colágeno do tipo V, comparadas com controles. Foi observado o aumento dos colágenos I, III e V, oclusão do lúmen vascular e escasso processo inflamatório. A análise bioquímica confirmou a fibrose com aumento da síntese de colágeno. Nós postulamos que as alterações sinoviais descritas neste modelo foram conseqüência das particularidades do colágeno V, que promove manifestações imunológicas e clínicas semelhantes à esclerodermia / We described an original model of experimental synovitis in rabbits immunized with collagen V with scant cellular infiltration, intense matrix remodeling and vasculitis. Morphological and biochemical analysis were realized in New Zealand female rabbits (N=20) immunization with type V collagen, compared with control rabbits. It was observed increase of collagen I, III and V, vascular lumen occlusion and scant inflammatory process. Biochemical analysis confirmed the fibrosis with increased synthesis of collagen. We postulate that synovial changes described in this model are consequence of collagen V particularities, which promotes immunologic and clinical manifestations similar to scleroderma

Descrevemos modelo original de sinovite experimental em coelhos imunizados com colágeno V com escasso processo inflamatório, intenso remodelamento matricial e vasculite. Analise morfológica e bioquímica foi realizada em coelhas Nova Zelândia (N=20) imunizadas com colágeno do tipo V, comparadas com controles. Foi observado o aumento dos colágenos I, III e V, oclusão do lúmen vascular e escasso processo inflamatório. A análise bioquímica confirmou a fibrose com aumento da síntese de colágeno. Nós postulamos que as alterações sinoviais descritas neste modelo foram conseqüência das particularidades do colágeno V, que promove manifestações imunológicas e clínicas semelhantes à esclerodermia / We described an original model of experimental synovitis in rabbits immunized with collagen V with scant cellular infiltration, intense matrix remodeling and vasculitis. Morphological and biochemical analysis were realized in New Zealand female rabbits (N=20) immunization with type V collagen, compared with control rabbits. It was observed increase of collagen I, III and V, vascular lumen occlusion and scant inflammatory process. Biochemical analysis confirmed the fibrosis with increased synthesis of collagen. We postulate that synovial changes described in this model are consequence of collagen V particularities, which promotes immunologic and clinical manifestations similar to scleroderma

Orientadores: Lília Freire Rodrigues de Souza Li, Carlos Eduardo Steiner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências / Made available in DSpace on 2018-08-21T05:55:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pedroni_MarcusViniciusCosta_M.pdf: 5336681 bytes, checksum: 022385349dc7fcf62951d9f8c466360f (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Osteogênese Imperfeita (OI) é um distúrbio genético caracterizado por baixa massa e fragilidade óssea, e outras manifestações do tecido conjuntivo, decorrente de defeitos qualitativos ou quantitativos do colágeno tipo I. Está associada a mutações nos genes COL1A1 e COL1A2 que codificam respectivamente as cadeias pro'alfa'1-(I) e pro'alfa'-2(I) formadoras da molécula do colágeno tipo I, e mais raramente mutações nos genes reguladores. A OI manifesta-se através de diferentes fenótipos (I-IV), segundo a classificação de Sillence et al. O objetivo deste trabalho foi a análise molecular dos genes COL1A1 e COL1A2 em famílias brasileiras portadoras de OI, em suas diferentes formas clínicas. Fizemos biópsia da pele de 12 famílias com OI para cultura primária dos fibroblastos. Desta cultura extraímos RNA total, que foi usado como molde para transcrição reversa e reação em cadeia de polimerase (PCR) dos genes e sequenciamento automático direto de cDNA. A expressão gênica foi determinada por Real Time PCR e o padrão e grau de expressão das proteínas do colágeno foram analisados por Imunocitoquímica e Western blot. Identificamos nove mutações missense em heterozigose em nove famílias, e duas mutações com alteração na matriz de leitura em famílias com fenótipos dos tipos I, III ou IV de OI. No gene COL1A1 encontramos quatro mutações já descritas: c.613G>A (p.P205A); c.769G> A (p.G257R); c.859G>A (p.G287S); c.1678G>A (p.G560R). No gene COL1A2 encontramos uma mutação já descrita: c.2314G> A (p.G772S) e quatro novas mutações: c.214G>A (p.G72S); c.775G>A (p.G259S); c.793G> C (p.G265R) e c.3467G>A (p.R1156K). Encontramos hiperexpressão dos transcritos de COL1A1 e COL1A2, porém expressão normal das cadeias 'alfa'1 e 'alfa'2 da proteína do colágeno em todos os pacientes. As cadeias mutada apresentaram padrão desorganizado nas células. Pacientes com OI apresentaram hiperexpressão dos genes de colágeno tipo I sugerindo que estes genes são regulados e que as meia vidas destas proteínas estão reduzidas / Abstract: Osteogenesis Imperfecta (OI) is a genetic disorder characterized by low bone mass and bone fragility, and other manifestations of connective tissue, due to qualitative or quantitative defects of type I collagen. It is associated with mutations in COL1A1 and COL1A2 genes, that encode respectively the pro'alpha'-1(I) and pro'alpha'-2(I) chains, forming the molecule of type I collagen, and more rarely mutations in regulatory genes. The OI is manifested by various phenotypes (I-IV), according to the classification of Sillence et al. The objective of this study was the molecular analysis of COL1A1 and COL1A2 genes in Brazilian families with OI, in its different clinical forms. We performed skin biopsy from 12 families with OI for primary culture of fibroblasts. From this culture, we made total RNA extract, which was used as template for reverse transcription and polymerase chain reaction (PCR), and automated sequencing directly from cDNA. Gene expression was determined by Real Time qPCR and the level of expression of collagen proteins were analyzed by immunocytochemistry and Western Blot. We identified heterozygous mutations in 11 families that have phenotypes of types I, III or IV of OI. In the COL1A1 gene found four previously described mutations: c.613G> A (p.P205A), c.769G> A (p.G257R), c.859G> A (p.G287S), c.1678G> A (p. G560R). In the COL1A2 gene we found one previously described mutation: c.2314G> A (p.G772S) and four new mutations: c.214G> A (p.G72S), c.775G> A (p.G259S), c.793G> C (p.G265R) and c.3467G> A (p.R1156K). We found upregulation of the transcripts of COL1A1 and COL1A2 genes, but a normal expression of 'alpha'1 and 'alpha'2 protein chains in all patients. The mutant chain showed disorganized on the immunocytochemestry. Patients with OI showed upregulation of type I collagen genes, suggesting regulation and decreasing half lives of the proteins / Mestrado / Saude da Criança e do Adolescente / Mestre em Ciências