[EN] This thesis deals with the development of a living biointerface between synthetic substrates and living cells to engineer cell-material interactions for tissue engineering purposes. This living biointerface is made of Lactococcus lactis, a non-pathogenic lactic bacteria widely used as starter in the dairy industry and, recently, in the expression of heterologous proteins in applications such as oral vaccine delivery or membrane-bound expression of proteins. L. lactis has been engineered to display the III 7-10 fragment of the fibronectin fused to GFP as reporter protein. Fibronectin is a ubiquitous protein present in the extracellular matrix, a complex mesh of structural and adhesive proteins which serve as mechanical support and development niche for cells of a wide variety of tissues. This fragment contains two important sequences, RGD and PHSRN. RGD is an adhesive sequence that interacts with a wide range of integrins, membrane-bound receptors that play a role in cellular processes such as adhesion, migration, proliferation and differentiation. On the other hand, PHSRN binds synergistically with RGD to some integrins such as alpha-5-beta-1 and others, increasing the specificity of this interaction. Genetically engineered L. lactis has been thoroughly characterized to test its capabilities as a living interface. This strain was found to express the FNIII 7-10-GFP fragment covalently linked to the cell wall and biological activity and expression levels of this fragment was assessed with techniques such as Western blot, ELISA and immunofluorescence. Moreover, this strain still holds the ability to develop biofilms, communities of sessile, attached bacteria to abiotic surfaces which helps greatly in the generation of a stable monolayer of bacteria between synthetic substrates and mammalian cells. Mammalian cell behaviour in response to the expressed fibronectin fragment on L. lactis membrane was also assessed. Several cell lines were tested, such as Fn-/Fn- and NIH3T3 fibroblasts, C2C12 myoblasts and human bone-marrow derived mesenchymal cells. This living biointerface was found to trigger cell adhesion and FAK phosphorylation, a marker for intracellular integrin-mediated signalling in all of the tested cell lines. It also triggered myoblast-to-myotube differentiation on C2C12 cells. In hMSCs, the cell-wall exposed fibronectin fragment was found to enhance the phosphorylation of ERK1/2, a kinase involved in the MAPK pathway, which is deeply involved in a multitude of cellular processes related to differentiation, proliferation and migration. Nevertheless, this thesis is a proof of concept that this novel system can be further exploited to express almost any desired protein or small molecule to help in the development of new tissues from progenitor cells. These molecules can be either secreted in the medium or displayed in the membrane, and can also be constitutively expressed or in-demand, due to the great flexibility of L. lactis and the wide variety of expression systems available. This interface based on living bacteria establishes a new paradigm in surface functionalization for biomedical engineering applications. / [ES] Esta tesis aborda el desarrollo de una biointerfase viviente entre materiales sintéticos y células vivas con el objetivo de dirigir la interacción célula-material en aplicaciones de ingeniería tisular. Esta biointerfase está compuesta de Lactococcus lactis, una bacteria láctica no patógena, ampliamente usada en la industria láctea como inóculo, y, recientemente, en la expresión heteróloga de proteínas para su uso como vacunas de administración oral o su expresión en membrana. L. lactis ha sido genéticamente modificado para expresar el fragmento III 7-10 de la fibronectina, unida a GFP como reporter. La fibronectina es una proteína presente de forma ubicua en la matriz extracelular, una compleja red de proteínas adhesivas y estructurales cuyo propósito es servir como soporte estructural y como nicho de desarrollo para diversos tejidos. Este fragmento contiene dos secuencias importantes, RGD y PHSRN. RGD es una secuencia adhesiva de unión que interacciona con una amplia variedad de integrinas, receptores de membrana que juegan muchos e importantes papeles en diferentes procesos celulares, como adhesión, proliferación, migración o diferenciación. Por otra parte, PHSRN se une a las integrinas de forma sinérgica con RGD facilitando aún más estos procesos y aumentando la especificidad de esta interacción. Esta cepa de L. lactis modificada ha sido ampliamente caracterizada para estudiar su idoneidad como interfaz funcional viviente. Se ha demostrado que L. lactis es capaz de expresar el fragmento FNIII7-10-GFP covalentemente anclado a la pared celular bacteriana, habiéndose caracterizado también su actividad biológica con técnicas como Western blot, ELISA e inmunofluorescencia. Esta cepa mantiene la capacidad de desarrollo de biofilms presente en la gran mayoría de microorganismos. Los biofilms son comunidades de bacterias sésiles adheridas a un sustrato que pueden ser usadas como interfase física entre células de mamífero y sustratos abióticos. También se ha estudiado la respuesta celular a la fibronectina expuesta en la membrana de L. lactis. Se estudiaron varias líneas celulares, como fibroblastos Fn-/Fn- y NIH3T3, mioblastos C2C12 y células mesenquimales humanas derivadas de médula ósea. Esta interfase viviente fue capaz de provocar respuesta celular en forma de adhesión en todas las líneas estudiadas, además de inducir diferenciación de mioblastos a miotubos en C2C12 y de provocar la fosforilación de FAK, un marcador de señalización celular mediada por integrinas. En células mesenquimales humanas se demostró la capacidad del fragmento de fibronectina expuesto para fosforilar ERK1/2, una kinasa perteneciente a la ruta de señalización MAPK, ruta que forma parte de muchos procesos celulares importantes como diferenciación, proliferación y migración. Pese a todo, esta tesis es sólo una prueba de concepto de un sistema que puede ser utilizado para expresar casi cualquier proteína o molécula pequeña deseada, que puede ser muy útil en el desarrollo de nuevos tejidos a partir de sus células progenitoras. Estas moléculas pueden ser secretadas en el medio o ancladas en la pared celular, de forma constitutiva o bajo demanda, debido a la flexibilidad y amplia variedad de sistemas de expresión disponibles para L. lactis. Esta biointerfase basada en bacterias vivas establece un nuevo paradigma en el campo de la funcionalización de superficies para aplicaciones de ingeniería biomédica. / [CAT] Aquesta tesi aborda el desenvolupament d'una interfase viva entre materials sintètics i cèl·lules vives amb l'objectiu de dirigir la interacció cèl·lula-material, per al seu ús en aplicacions d'enginyeria tissular. Aquesta interfase està composta de Lactococcus lactis, un bacteri làctic, no patogènic i àmpliament utilitzat en l'industria làctica com a inòcul, i, recentment, en l'expressió heteròloga de proteïnes per al seu ús com vacunes d'administració oral o per a la seva expressió en membrana. L. lactis ha sigut genèticament modificada per a expressar el fragment III7-10 de la fibronectina, unida a GFP com a reporter. La fibronectina és una proteïna present de forma ubiqua en la matriu extracel·lular, una complexa xarxa de proteïnes adhesives i estructurals que s'utilitzen com a suport estructural i com a nínxol de desenvolupament per a diversos teixits. Aquest fragment conté dos seqüències importants, RGD i PHSRN. RGD és una seqüència adhesiva d'unió a integrines, receptors de membrana que juguen molts i molt importants papers en diferents processos cel·lulars, com poden ser adhesió, proliferació, migració o diferenciació. Per altra banda, PHSRN s'uneix a les integrines de forma sinèrgica amb RGD facilitant encara més aquests processos i augmentant l'especificitat d'aquesta interacció. Aquesta modificació genètica de L. lactis ha estat àmpliament caracteritzada per provar les seves característiques com a interfase funcional vivent. S'ha demostrat que L. lactis és capaç d'expressar el fragment FNIII 7-10-GFP covalentment ancorat a la paret cel·lular bacteriana, havent-se caracteritzat també la seva activitat biològica amb tècniques com Western blot, ELISA i immunofluorescència. A més, aquest cep manté la capacitat de desenvolupament de biofilms, comunitats de bacteris sèssils adherits a un substrat que poden ser utilitzades com a interfase física entre cèl·lules de mamífer i substrats abiòtics. També s'ha estudiat la resposta cel·lular a la fibronectina expressada en la paret cel·lular de L. lactis. El estudi es va fer utilitzant diverses línies cel·lulars, com fibroblasts Fn-/Fn- i NIH3T3, mioblasts C2C12 i cèl·lules mesenquimals humanes derivades de medul·la òssia. Aquesta interfase vivent va ser capaç de provocar resposta cel·lular en forma d'adhesió a totes les línies estudiades, a més d'induir diferenciació de mioblasts a miotubs en C2C12 i de provocar la fosforilació de FAK, un marcador de senyalització cel·lular mediat per integrines, en les línies assajades. En cèl·lules mesenquimals humanes es va demostrar la capacitat del fragment de fibronectina exposat per fosforilar ERK1/2, una kinasa pertanyent a la ruta de senyalització MAPK, ruta que forma part de molts processos cel·lulars importants com diferenciació, proliferació i migració. Malgrat tot, aquesta tesi mostra només una prova de concepte d'un sistema que pot ser utilitzat per expressar gairebé qualsevol proteïna o molècula petita desitjada, que pot ser molt útil en el desenvolupament de nous teixits a partir de les seves cèl·lules progenitores. Aquestes molècules poden ser secretades en el medi o ancorades a la paret cel·lular, de manera constitutiva o sota demanda, a causa de la flexibilitat i àmplia varietat de sistemes d'expressió disponibles per L. lactis Aquesta biointerfase basada en bacteris vius estableix un nou paradigma en el camp de la funcionalització de superfícies per a aplicacions d'enginyería biomèdica. / Rodrigo Navarro, A. (2015). Functional living biointerfaces to direct cell-material interaction [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/51461 / TESIS

The structural and mechanical properties of a surface often play an integral part in the determination of the cell adhesion strength and design parameters for creating a biodegradable electrospun scaffold. Nanofibers composed of the globular proteins bovine serum albumin (BSA) and fibronectin were produced by electrospinning with the electrospun protein scaffold serving as an extracellular matrix to which adhesion interaction will exist with cells via cell surface integrin. This interaction is vital in regulation cell differentiation, growth and migration and cell adhesion. We will demonstrate the ability to manipulate ligand-receptor interaction, the properties of the electrospun fibers, control and the formation of focal adhesions sites in cells cultured on the fibers with the ultimate goal of developing a biomimetric scaffold to investigate how cell adhesion molecules modulate cell behavior in a 3-dimentional culture.

Quartz Crystal Microbalance (QCM) is a sensitive and effective technique to analyze mass changes at the interface between a solid material and a liquid environment. In this Master thesis, QCM was employed for evaluating the interactions between selected degradable polymers and nanodiamond particles (nDP), fibronectin and the growth factor BMP-2.   Many parameters must be adapted to allow QCM measurements involving degradable polymers. These parameters were then tailored to allow QCM measurements with PLA, poly(LLA-co-CL), poly(TMC-D-LA) and PS.   Moreover, QCM provides quantitative measurements of protein adsorption on degradable polymers. The behavior of PLA and poly(LLA-co-CL) was further evaluated and compared with respect to protein adsorption. This behavior was demonstrated to be different for the two polymers considered and to be dependent on protein concentration in solution.   Eventually, exploiting QCM it was also possible to assess the relationship between nDP and the adsorption of fibronectin and BMP-2 onto PLA and poly(LLA-co-CL).

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(人間健康科学) / 甲第21459号 / 人健博第66号 / 新制||人健||5(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科人間健康科学系専攻 / (主査)教授 青山 朋樹, 教授 岡 昌吾, 教授 髙橋 良輔 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Human Health Sciences / Kyoto University / DFAM

Bacteria typically adhere to various cell surfaces present in the human body to colonise or invade human tissues. Staphylococcus aureus (S. aureus) can express the fibronectin-binding proteins A and B (FnBP-A, FnBP-B) that can facilitate the binding of multiple copies of fibronectin (Fn). In addition, Fn bound to the bacterium trigger activation of α5β1 integrins found on the cells and facilitate invasion of human cells. Although the invasion mechanisms regarding signalling pathways and overall host cell interactions have been defined, the quantitative relationship between the mediators of invasion and the temporal kinetics has not yet been elucidated. In this thesis, newly developed microscopy-based methods have been used to quantify the interactions between H1299 cells and S. aureus at various Fn concentrations. After an approximate Fn concentration of 15 μg/ml, the S. aureus bacteria strains become saturated both for the wildtype and the negative control strains. Additionally, using the step-by-step protocol developed during this study, adhesion of the wildtype strain of S. aureus with 15 μg/ml Fn is occurring on the H1299 cells. Although adjustments to the protocol are needed, this adhesion mechanism will lead to an internalisation of the S. aureus strains to the H1299 cells.

In the process of pre-mRNA splicing introns are removed from pre-mRNA and exons are joined together. Current studies show, that about 95 % of genes, which contain more than two exons, can undergo alternative splicing. In this process some exons are included in or excluded from the final mRNA. Majority of pre-mRNA splicing take place co- transcriptionaly at this time RNA polymerase II is still attached to pre-mRNA. Alternative splicing is complex process that takes place in a close proximity of DNA and histones that might modulate alternative splicing decisions. Futher studies have validated fibronectin gene (FN1) and his alternative exons EDA and EDB (extra domain A and B) as suitably model for studying alternative splicing. Study using FN1 minigene reporter system, which is composed from EDA exon and two surrounding introns and exons, has proved that insertion of transcription enhancer SV40 infront of promotor, the level of EDA inclusion is decreased. So far, has not been prooved if this mechanism can function in real genome context and if distal transcription elements can influence alternative splicing. In this study, we have predicted transcription enhancer for FN1 gene by using The Ensemble Regulatory Build and FANTOM 5. The predicted transcription enhancer, is located 23,5 kbp upstream of TSS...

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is required for the development, growth and survival of blood vessels. Endothelial cell behavior is altered by cell substrate stiffness, suggesting that VEGF activity might also be influenced by cell-substrate mechanics. We studied VEGF binding, internalization, and signaling as a function of substrate stiffness using endothelial cells cultured on fibronectin (fn) linked polyacrylamide gels. Individual cell analysis of VEGF-induced calcium fluxes in endothelial cells on various stiffness extracellular matrices (ECM) revealed heterogeneity in our cell population that would have been lost using population based averaging. Cluster analysis of individual cells identified two key groups of reacting cells- a minor fraction of highly reactive cells and the bulk of the cells with minimal activation. At subsaturating VEGF doses, highly active cells were phenotypically smaller and thinner than the bulk population. Overall, cells on our softest substrates (4 kPa) were most sensitive to VEGF. To better understand the mechanisms underlying the changes in VEGF signaling due to stiffness, we explored how matrix binding of VEGF and tethering of cells to the matrix modulates VEGF processing. VEGF-ECM binding was enhanced with heparin pre-treatment, which exposed a cryptic VEGF binding site in the fn ECM. Cell produced ECM on the softest substrates were least responsive to heparin, but the cells internalized more VEGF and showed enhanced VEGF signaling compared to cells on all other substrates. Inhibiting VEGF-matrix binding with sucrose octasulfate decreased cell-internalization of VEGF in all conditions. β1 integrin, which connects cells to fn, modulated VEGF uptake in a stiffness dependent fashion. β1 protein levels were consistent with stiffness, yet cells on hard surfaces showed greater decreases in VEGF internalization than cells on softer matrices after β1 inhibition. Stiff matrices facilitate the unfolding of fn, which may reduce the binding capacity of β1 integrin. Thus a greater proportion of activated β1 integrin may be sensitive to inhibition in the stiff condition as compared to the soft. Ultimately, through analysis of individual and population-based VEGF-cell responses to stiffness, this study provides insight into how signaling dynamics, cell heterogeneity, and microenvironment influence tissue regeneration and response to injury and disease.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第25168号 / 医博第5054号 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 上野 英樹, 教授 波多野 悦朗, 教授 伊藤 能永 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

This thesis ventures with the extracellular matrix protein (ECM) fibronectin (FN) as an interface protein in the interaction between cells and materials to design microenvironment for future use in tissue engineering. It is studied the FN adsorption and conformations, cell behaviour to different FN conformation, cell adhesion, reorganisation and remodelling of FN at the material interface, the role of growth factors (GF) and their interactions with components of the extracellular matrix (ECM), the immunology cell response, and the stem cell fate influenced by the extrinsic signals coming from the engineered microenvironments using ECM's proteins. To investigate the FN response, in terms of adsorbed amount and conformation to different chemical properties of the material, model surfaces were used. Self assembled monolayers (SAM) with different percentages of two different chemical groups were used: CH3 and OH. FN adsorption, initial cell adhesion and signalling (focal adhesions, integrin expression and phosphorylation of FAK) is related with the reorganisation and secretion of FN and matrix degradation. It is shown that matrix degradation at the cell material interface depends on surface chemistry in metalloproteinase-dependent way. A direct relationship between FN activity at the cell-material interface and metalloproteinase 9 (MMP9) expression was found, being the product of a sequence of events that include integrin expression, focal adhesion formation, matrix reorganisation and focal adhesion kinase (FAK) phosphorylation. Two different materials with subtle variations in their chemical composition were employed as a drastically different FN conformation: from a globular conformation on PMA (poly (methyl acrylate)) to the formation of a well-interconnected FN network (similar to the FN physiological fibrillar network) triggered by PEA (poly (ethyl acrylate)). The formation of focal adhesions (vinculin), FAK expression and phosphorylation, specific integrin binding, protein and gene expression for ¿5 and ¿v was studied, seeking to correlate cell adhesion with matrix degradation. It is demonstrated that the material-driven FN fibrillogenesis on PEA triggers proteolytic activity: MMP activity is higher as a compensatory mechanism to the inability of cells to reorganise this FN network. Looking into the role of protein-material interactions and stem cell fate, and with the knowledge on PEA, we engineer different synergistic microenvironments to direct cell and stem cell fate. FN has a growth factor (GF) binding domain on its molecule (FNIII12-14) and has been demonstrated to produce a synergistic response when occurs at the same time the recognition of the cell binding domain (FNIII9-10). It is demonstrated that this domain is available on the FN coated PEA, and exploiting these interactions between PEA, FN and GF, it is developed a microenvironment to control cell behaviour and tissue repair. It is studied the BMP2 binding and presentation, the effect of BMP2 presentation on MSC proliferation and differentiation. These systems allow not only enhanced activity of GF compared to soluble administration, but also reduce GF doses, improving safety and cost effectiveness. Finally, the immunological reaction of the microenvironment developed is studied using dendritic cells, beside the conformational structure of ECM protein importance in DC integrin-based activation it is studied, helping to establish the field of adhesion-based modulation of DC as a general mechanism that has previously not been defined. The microenvironment didn't induce any maturation in DC, while different FN conformation shows differences in DC morphology and citokine level production (IL-10 and IL-12). / En esta tesis se estudia la interacción de una proteina de la matriz extracelular, fibronectina (FN) como interfase en la interacción entre células y materiales, para diseñar microambientes con el propósito de ser usados en el futuro en ingeniería tisular. Se estudia la adsorción y conformación de FN y la relación con el diferente comportamiento celular: la adhesión celular, la reorganización y remodelado de la FN en la interfase célula-material, el papel que juegan los factores de crecimiento y sus interacciones con los componentes de la matriz extracelular, la respuesta immunológica y el destino celular de células madre influenciadas por las señales extrínsecas provenientes de microambientes elaborados a partir de proteínas de la matriz extracelular. Con el objetivo de investigar la respuesta a la FN en términos de conformación y cantidad absorbida a diferentes propiedades químicas del material, se usaron materiales modelo: monocapas autoensambladas (self-assembled monolayers, SAM). Las químicas estudiadas fueron CH3 and OH. La adsorption de FN, adhesion y señalización (adhesiones focales, expresión de interinas y fosforilación de quinasas de adhesiones focales (FAK)) se estudiaron en relación a la reorganización y secreción de FN y degradación de la matriz extracelular. Se demuestra que la degradación de la matriz extracelular en la interfase célula-material depende de la química de la superficie, a través de las metaloproteinasas. Se ha descubierto una relación directa entre la actividad de la FN que se encuentra en el material y la expresión de metaloproteinasa 9 (MMP9), a través de la expresión de integrinas, formación de adhesiones focales, reorganización de la matriz extracelular y fosforilación de FAK En el siguiente capítulo se emplean materiales poliméricos con una sutil diferencia en la composición química, provocando una diferencia drástica en la conformación de la FN: se pasa de una conformación globular en PMA (polimetil acrilato) a una conformación en forma de red interconectada en PEA (polietil acrilato). Con el propósito de relacionar la adhesión celular con la degradación de la matriz extracelular, se estudia la formación de adhesiones focales (vinculina), la expresión y fosforilación de FAK, la unión específica de integrinas y la expresión de las integrinas ¿5 and ¿v. Se demuestra que la formación de una red de FN sobre PEA induce la actividad proteolítica: la actividad de las MMPs es mayor, actuando como mecanismo compensatorio a la incapacidad de reorganización de la red de FN. Haciendo uso de la conformación de la FN sobre PEA, se estudiaron las interacciones entre la proteína-material y el destino celular de células madres. La FN posee un dominio de unión de factores de crecimiento (FNIII12-14) y se ha demostrado que se produce una respuesta sinérgica cuando el reconocimiento ocurre junto con el dominio de unión celular (FNIII9-10). En esta tesis se demuestra que el dominio de unión de factores de crecimiento está disponible en la conformación que adquiere sobre PEA y se diseñan microambientes para controlar el comportamiento celular y regeneración de tejido. Se estudia la unión y presentación de BMP2 y su efecto en la diferenciación de células madre mesenquimales. Los microambientes desarrollados, ademas de mejorar la actividad de los factores de crecimiento comparado con la administración soluble, también reduce la cantidad de factores de crecimiento que se tendría que administrar, mejorando la seguridad y efectividad. Finalmente se estudió la reacción inmunológica a los microambientes desarrollados usando células dendríticas, estudiando además la influencia de la estructura de la conformación de las proteínas en la activación de las células dendríticas a través de las integrinas. Los microambientes no indujeron ninguna maduración de células dendríticas, mientras que la conformación de la FN muestra control / En aquesta tesi s'estudia la interacció entre una proteïna de la matriu extracel.lular, fibronectina (FN) com interfase en la interaccio entre cèl·lules i materials, per a dissenyar microambients amb el propòsit d'utilitzar-se al futur en enginyeria tissular. S'estudia l'adsorció i conformació de la FN i la relació amb el diferent comportament cel·lular: l'adhesió cel·lular, la reorganització i remodelat de la FN a la interfase cèl·lula-material, el paper que juguen els factors de creixement i les seus interaccions amb els components de la matriu extracel·lular, la resposta immunològica i el destí cel·lular de cèl·lules mare influenciades pels senyals extrínseques provinents de microambients elaborats a partir de proteïnes de la matriu extracel·lular. Amb l'objectiu d'investigar la respostar a la FN en termes de conformació i quantitat absorbida a diferents propietats químiques del material, s'utilitzaren materials model: monocapes autoacoblades (self-assembled monolayers, SAM). Les químiques estudiades van ser CH3 and OH. L'absorció de FN, adhesió i senyalització (adhesions focals, expressió d'integrines i fosforilació de quinases d'adhesions focals (FAK)) es van estudiar en relació a al reorganització i secreció de la FN i degradació de la matriu extracel·lular. Es demostra que la degradació de la matriu extracelular en la interfase cèl·lula-material depèn de la química de la superficie, a través de les metal·loproteïnases. S'ha descobert una relació directa entra l'activitat de la FN que es troba en el material i l'expressió de metaloproteinasa 9, a través de l'expressió d'integrines, formació d'adhesions focals, reorganització de la matriu extracel·lular i fosforilació de FAK. Al següent capítol es fan servir materials polimèrics amb una subtil diferència en la composició química, provocant una diferència dràstica en la conformació de la FN: es passa d'una conformació globular en PMA (polimetil acrilat) a una conformació en forma de xarxa interconnectada en PEA (polietil acrilat). Amb el propòsit de relacionar l'adhesió cel·lular amb la degradació de la matriu extracel·lular, s'estudia la formació d'adhesions focals (vinculina), l'expressió i fosforilació de FAK, la unió específica d'integrines i l'expressió de les integrines ¿5 and ¿v. Es demostra que la formació d'una xarxa de FN sobre PEA indueix l'activitat proteolítica: l'activitat de les MMPs és més gran, actuant com a mecanisme compensatori a la incapacitat de reorganització de la xarxa de FN. Fent ús de la conformació de la FN sobre PEA, es van estudiar les interaccions entre la proteïna-material i el destí cel·lular de cèl·lules mares. La FN posseeix un domini d'unió de factors de creixement (FNIII12-14) i s'ha demostrat que es produeix una resposta sinèrgica quan el reconeixement ocurreix juntament amb el domini d'unió cel·lular (FNIII9- 10). En aquesta tesi es demostra que el domini d'unió de factors de creixement està disponible a la conformació que adquireix sobre PEA i es dissenyen microambients per controlar el comportament cel·lular i regeneració de teixit. S'estudia la unió i presentació de BMP2 i el seu efecte en la diferenciació de cèl·lules mare mesenquimals. Els microambientes desenvolupats, a més de millorar l'activitat dels factors de creixement comparat amb l'administració soluble, també redueix la quantitat de factors de creixement que s'hauria d'administrar, millorant la seguretat i efectivitat. Finalment es va estudiar la reacció immunològica als microambients desenvolupats usant cèl·lules dendrítiques, estudiant a més la influència de l'estructura de la conformació de les proteïnes en l'activació de les cèl·lules dendrítiques a través de les integrines. Els microambients no van induir cap maduració de cèl·lules dendrítiques, mentre que la conformació de la FN mostra controlar la morfologia de les cèl·lules dendrítiques i / Llopis Hernández, V. (2017). Material-driven fibronectin fibrillogenesis to engineer cell function [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90412 / TESIS

The extracellular matrix (ECM) provides mechanical and biochemical support to tissues and cells. It is crucial for cell attachment, differentiation, and migration, as well as for ailment-associated processes such as angiogenesis, metastases and cancer development. An approach to study these phenomena is through emulation of the ECM by synthetic gels constructed of natural polymers, such as collagen and fibronectin, or simple but tunable materials such as poly(ethylene glycol) (PEG) crosslinked with short peptide sequences susceptible to digestion by metalloproteases and cell-binding domains. Our lab uses PEG gels to study cell behavior in three dimensions (3D). Although this system fosters cell attachment and crosslinking peptides mentioned, the regenerative process of the ECM has not been mimicked yet in 3D synthetic gels. In an attempt to build in this functionality to PEG-based gels, I performed phage display to identify short oligopeptides that bind either collagen or fibronectin to assess them as potential nucleation points for crosslinking elements in order to emulate the in vivo reconstitution process. A phage display is a library of random oligopeptides expressed on a M13 bacteriophage that allows identification of a phenotype and a genotype with a single screening step. This inexpensive strategy could yield a short oligopeptide with high specificity. I identified the conditions under which phage display is compatible with our targets, and I isolated and identified five peptide candidates for fibronectin binding and two for collagen. Future work includes assessing whether these candidates could facilitate the formation of cell-created crosslinking in 3D synthetic hydrogels.