Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) i a l'Institut Català d'Oncologia (ICO) / BACKGROUND: MMR deficiency is a hallmark of tumors from Lynch syndrome LS) patients, who harbor germline mutations in MMR genes. No germline alterations are detected in a significant proportion of suspected LS now known as Lynch-like syndrome (LLS) cases. HYPOTHESIS: In LS-suspected patients there may be other responsible causes for the MMR-deficiency in tumors, such as unidentified germline mutations or epimutations in MMR genes, or mutations in other CRC-associated genes (germline or somatic). AIMS: To elucidate the molecular basis of MMR deficiency in LS-suspected cases without identified germline MMR mutation. SPECIFIC AIMS: To refine and complete the analysis of MMR gene including the promoter regions. To study the contribution of MUTYH mutations to LLS. To study the relative contribution of germline and somatic mutations in other CRC-associated genes. PATIENTS AND METHODS: We have analyzed a series of 260 LS-suspected patients, thirty-four harboring MLH1-methylated tumors and 226 classified as LLS (BRAF negative, MLH1 methylation negative and MMR wildtype). Promoter sequencing of MMR genes was performed by Sanger. Methylation analyses were analyzed by multiple techniques including MS-MLPA, MS-Melting Curve Analysis (MCA), bisulfite sequencing or pyrosequencing. Pathogenicity assessment of MSH2 VUS was performed by multifactorial models and cDNA analysis. MUTYH Spanish variants were analyzed by Sanger or MCA and other CRC-associated genes by a customized subexome panel. MAIN RESULTS AND CONCLUSIONS: In LLS somatic methylation in MSH2 and MSH6-deficient tumors is absent and does not of help in ruling out LS. MLH1 constitutional epimutations account for about 2% of suspected LS cases. Pathogenicity assessment of MSH2 variants allows the reclassification of the majority of them (90%). Germline biallelic MUTYH mutations are responsible for up to 3% of LLS. FAN1 probable pathogenic variants may account for 10% of LLS. The combined germline and somatic assessment of the mutational status of CRC-associated genes by means of a subexome panel is useful to elucidate the molecular basis of a relevant number of LLS. / ANTECEDENTES: La deficiencia de reparación de bases desapareadas es una característica de los tumores de pacientes con síndrome de Lynch (SL) con mutaciones germinales en genes reparadores (MMR). En una proporción significativa de pacientes con sospecha de SL no se detecta mutación germinal en MMR, ellos se conocen como pacientes con síndrome “Lynch-like” (LLS). HIPÓTESIS: En pacientes con sospecha de SL podría haber otra causa responsable de la deficiencia reparadora, como (epi)mutaciones germinales en genes MMR o en otros asociados a cáncer colorectal (CCR). OBJETIVO: Elucidar la base molecular de la deficiencia MMR en pacientes con sospecha de SL sin mutación germinal identificada en genes MMR. OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Refinar el análisis de genes MMR incluyendo regiones promotoras. Estudiar la contribución de mutaciones en MUTYH a LLS. Estudiar la contribución relativa de mutaciones germinales y somáticas en otros genes asociados a CCR. PACIENTES Y MÉTODOS: Hemos analizado una serie de 260 pacientes con sospecha de SL, 34 tenían tumores MLH1 metilados y 226 eran LLS (BRAF wildtype, sin metilación en MLH1 y MMR wildtype). La secuenciación del promotor en genes MMR se hizo por Sanger. Los análisis de metilación por múltiples técnicas incluyendo análisis de curvas de disociación (MCA) específica de metilación, MLPA específico de metilación, secuenciación con bisulfito o pirosecuenciación. Las VSDs en MSH2 se estudiaron por análisis multifactoriales y de cDNA. Las variantes patogénicas Españolas de MUTYH se analizaron por Sanger o MCA y otros genes asociados a CCR se estudiaron por secuenciación masiva con un panel del subexoma. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: En LLS el estudio de metilación somática en tumores MSH2- y/o MSH6- no ayuda a descartar pacientes con SL. Epimutaciones constitucionales en MLH1 representan alrededor del 2% del SL. La evaluación de la patogenicidad de las VUS en MSH2 permitió su re-clasificación en la mayoría (90%). Mutaciones bialélicas germinales en MUTYH son responsables de ~3% de LLS. Mutaciones en FAN1 podrían ser responsables de un 10% del LLS. La combinación del análisis germinal y somático de mutaciones asociadas a CCR por medio de paneles de subexomas es útil para elucidar la base molecular del LLS.

Epithelial layers constitute the skeleton of early embryos and most tissues and organs and their remodelling during development is essential for reshaping the embryo and for tissue architecture. Epithelial expansion in particular, has fundamental roles during early embryogenesis in both vertebrates and invertebrates. Some well-established invertebrate models have contributed greatly to our knowledge of this process. However, we are still far from having a global understanding of the cellular, molecular and mechanical changes involved in this process, the diversity, and relationship between them. With this in mind, we decided to explore a less well known model for epithelial expansion, epiboly in the vertebrate zebrafish. Epiboly is the expansion of the blastoderm around a big yolk cell to finally engulf it. Three different layers are involved in this process, an epithelial layer, a mesenquimal layer and a big yolk cell. Although teleost epiboly has been studied for many years a clear understanding of the process was still missing. We analysed the cellular, molecular and mechanical elements involved in this process and found that epithelial expansion is in this process a passive event driven by the pulling of the adjacent layer, the yolk syncytium. The increase in area of this epithelia is achieved by cell shape changes (flattening) and the RhoGTPase Rac1 activity seems to be necessary for these passive changes in shape. The contraction in the yolk syncytium is accompanied by the formation of membrane folds and endocytic vesicles in this area and the different mechanical properties of the elements at both sides of these contractile domains are, together with endocytosis, essential to understand the expansion. In relation to this, we found that Rab5ab activity in the yolk is essential for the expansion and for doming of the internal part of the yolk. In addition, we showed that the main constituent of the embryo at this stage, the yolk granules, behave as an hydrodynamic fluid at low Reynolds number that passively flow during epiboly by the activity at the surface. We learned that the spherical geometry of the embryo together with volume conservation and the transmission of forces between the different elements involved in the process are essential to understand the changes observed in the blastoderm during this process and its global coordination. We generated a non-intrusivemethodology to extract the mechanical changes involved in a given morphogenetic event from microscopy data based on the relation between the active elements (elastic, visco-elastic) and the passive ones (fluids). We applied this method to the process of epiboly and validated the results obtained by atomic force microscopy (AFM) indentation and laser microsurgery experiments. Finally, we generated an enhancer trap screen using the Gal4/UAS binary system with the aim of being able to spatially restrict gene expression during epiboly. However, and although we found several interesting lines that drove specific gene expression, we could not find any with sufficient early expression to be useful for our epiboly studies. Overall, we learnt that an isotropic actomyosin contraction generates an anisotropic stress pattern and movement by the properties of the surrounding elements. To get a precise understanding of epiboly we had to consider the transmission of forces between the different layer and volume conservation. For that, it was important to take into account both the contribution from the active elements (cortex) and from the passive ones (fluid). The role that unselective membrane removal has in morphogenesis has been barely explored. We anticipate that membrane tension and removal and its relationship to actomyosin contraction and shape changes will become an emerging and exciting field and that zebrafish epiboly will become a great model to study these relationships / La expansión de epitelios es esencial durante la embriogénesis de muchos organismos tanto invertebrados como vertebrados y también juega un papel importante en el organismo adulto como, por ejemplo, durante el proceso de cicatrización de heridas. Para ampliar nuestros conocimiento sobre los mecanismo celulares, moleculares y mecánicos responsables de este cambio morfogenético estudiamos la epibolia del vertebrado pez cebra. La epibolia de pez cebra consiste en la expansión del blastodermo alrededor del vitelo para finalmente embolverlo. Elaboramos un análisis descriptivo, funcional y mecánico del procesos que nos llevó a concluir que la expansión de este epitelio (EVL) es pasiva y generada por la contracción y la endocitosis del córtex de la capa adyacente, el sincitio del vitelo. La actividad de la RhoGTPasa Rac en el epitelio parece importante para este cambio de forma celular pasivo, mientras que la endocitosis mediada por la RhoGTPasa Rab5ab en el sincitio adyacente es esencial para la expansión del epitelio. Encontramos que la contracción isotrópica del córtex del sincitio genera un movimiento unidireccional por las diferentes propiedades mecánicas de las dos estructuras adyacentes. Por otro lado, descubrimos que los gránulos del vitelo, el mayor componente del huevo en este estadio, se comportan como un fluido viscoso incompresible que se mueven pasivamente durante el proceso de expansión por la actividad generada en la superficie. Además, el movimiento de estos gránulos durante el proceso puede explicar el cambio de forma del blastodermo durante el proceso. Finalmente, generamos un método para extraer los cambios mecánicos durante la epibolia a partir de imágenes de microscopia, basado en la relación entre la actividad elástica del córtex y el movimiento del fluido. Los resultados obtenidos con este método fueron validados por microscopía de fuerza atómica y microcirugía del córtex. En resumen, hemos obtenido un conocimiento global de la epibolia y aprendido que para explicar este proceso es necesario considerar las diferentes propiedades mecánicas de los diferentes elementos involucrados y la transmisión de fuerzas entre estos teniendo en cuenta la conservación del volumen y la forma esférica del embrión. Creemos que estos conceptos resultarán aplicables a otros procesos morfogenéticos.

Durant el desenvolupament d’aquesta tesi doctoral hem identificat i caracteritzat la variant d’histona H1 present a la línia germinal i l’embrió primerenc de Drosophila melanogaster. Els metazous contenen múltiples variants d’histona H1. Particularment, la majoria d’espècies estudiades contenen diverses variants d’histona H1 que reemplacen les H1 somàtiques a la línia germinal i als primers estadis del desenvolupament embrionari. Drosophila era l’excepció ja que, fins ara tan sols es coneixia una única histona H1, que s’expressa des de la cel·lularització de l’embrió i que perdura durant tot el cicle biològic de la mosca. En aquest treball hem identificat la histona H1 embrionària i de la línia germinal de D.melanogaster, dBigH1. dBigH1 és molt abundant durant els primers estadis embrionaris, abans de la cel·lularització de l’embrió, quan la histona H1 somàtica (dH1) és absent i el genoma zigòtic es troba silenciat. Durant la cel·lularització, quan el genoma del zigot s’activa progressivament, dH1 reemplaça dBigH1 a les cèl·lules somàtiques. Tot i això, dBigH1 es reté a les primordial germ cells (PGCs) com a mínim fins l’estadi 12. Aquestes cèl·lules donaran lloc a la línia germinal del futur organisme. En aquest treball vam generar una mutació de falta de funció de dBigH1 a la qual vam anomenar dbigH1100. Els embrions mutants dbigH1100 presenten una activació prematura del genoma zigòtic, tan a les cèl·lules somàtiques com a les PGCs. Els embrions mutants dbigH1100 moren abans de la cel·lularització i presenten un augment dels nivells de RNA Polimerasa II elongant i un augment de trànscrits zigòtics. A més a més, la letalitat va acompanyada de dany al DNA i defectes mitòtics. Aquests resultats suggereixen que dBigH1 té una funció essencial en la regulació de l’activació del genoma zigòtic durant la cel·lularització. De la mateixa forma que altres metazous, dBigH1 també es troba present a la línia germinal femenina. Tot i això, a diferència d’altres espècies estudiades, on existeixen variants d’H1 específiques de mascle, dBigH1 també es troba present a la línia germinal masculina. Tan a les gònades masculines com a les femenines, dBigH1 està expressada a les cèl·lules mare germinals (GSC), que es troben adherides a un nínxol que ajuda al seu manteniment com a cèl·lules mare. A les gònades masculines dBigH1 no està present a la regió proliferativa, on hi ha els grups d’espermatogònies, i torna a expressar-se als espermatòcits. A les gònades femenines, dBigH1 té un patró de localització similar ja que es troba absent a les oogònies proliferants, però torna a expressar-se a les cambres ovàriques. En una condició de falta de funció de dBigH1 es produeixen defectes en la gametogènesi masculina i es detecta una acumulació d’espermatogònies. En aquestes gònades es produeix un augment dels nivells de Bam, un factor de diferenciació clau en aquest procés. En una situació control, els nivells de Bam augmenten durant la fase proliferativa, però aquest gen es torna a mantenir silenciat per tal que les espermatogònies deixin de proliferar i es diferenciïn a espermatòcits. Aquests resultats suggereixen que dBigH1 té una contribució en la regulació de l’expressió de bam durant la diferenciació de les espermatogònies. A més a més, també hem mostrat que la distribució de dBigH1 al llarg de la cromatina dels espermatòcits correlaciona negativament amb l’expressió gènica. Així doncs, els gens que es troben silenciats tenen un contingut alt en dBigH1, mentre que els gens més expressats tenen un contingut menor en la proteïna. De fet, en una situació de falta de funció de dBigH1 als espermatòcits, es produeix un augment de l’expressió d’aquells gens que, en una situació control, es troben silenciats. Aquests resultats suggereixen que dBigH1 també té una contribució en la regulació de l’expressió gènica durant la gametogènesi masculina. / During the development of this thesis we have descrived the germline and embryonic histone H1 variant of Drosophila melanogaster. Metazoans usually contain multiple histone H1 variants. In particular, specific variants replace somatic histone H1s in the germline and early embryogenesis. In this regard, Drosophila was an exception because a single dH1 was known. During this work, we identified the embryonic histone H1 of Drosophila, dBigH1. dBigH1 is abundant during early embryogenesis before cellularization occurs, when the somatic H1 is absent and the zygotic genome is inactive. Upon cellularization, when the zygotic genome si progressively activated, dH1 replaces dBigH1 in the soma, but not in the primordial germ cells (PGCs). dBigH1 loss-of-function mutant embryos show premature zygotic genome activation, both in the soma and the PGCs. Mutant embryos die at cellularization, showing increased levels of active RNApol II and zygotic transcripts, along with DNA damage and mitotic defects. These results show an essential function of dBigH1 in zygotic genome activation regulation. Like in other metazoans, dBigH1 is present in the female germline. However, it is also present in the male germline, while other metazoans contain diferent male-specific H1s. In the gonads, dBigH1 is expressed in the germ stem cells attached to the stem cell niche, both in males and females. In male gonads it is also present in the spermatocytes and, in the female gonads, it is also present in the egg chambers. dBigH1 knock-down testis have problems in the regulation of spermatogenesis, which results in spermatogonia accumulation and a decrease in male fertility. This is due to an upregulation of bam, a key regulator of this process. These results show a dBigH1 contribution in the regulation of bam expression during gametogenesis. Moreover, we also show that dBigH1 distribution across spermatocytes chromatin negativelly correlates with gene expression. dBigH1 is accumulated in genes which must remain silenced, whereas genes highly expressed in these cells contain less dBigH1 content. In this regard, a dBigH1 knock-down condition show an upregulation of these silenced genes. These results show that dBigH1 also contributes to transcriptional regulation in the germline.

Mutacions en els gens de les presenilines 1 i 2 són causants d'un 50% dels casos d'un determinat tipus de malaltia d'Alzheimer, conegut com a Alzheimer presenil, d'herència autosòmica dominant. En aquesta tesi doctoral, s'ha utilitzat l'homòleg de les presenilines a Drosophila melanogaster per realitzar una aproximació a la funció d'aquesta proteïna.Es coneix que la presenilina es sintetitza en el reticle endoplasmàtic com a precursor, amb 8 dominis transmembrana. Aquesta proteïna, experimenta un tall proteolític, anomenat presenilinasa, que genera dos fragments: un fragment aminoterminal o NTF i un fragment carboxiterminal o CTF, que són la forma de presenilina majoritària, estable i funcional. En aquest treball, s'ha pogut determinar que els fragments NTF i CTF formen homodímers amb ells mateixos i un heterodímer NTF:CTF. D'aquest resultat, es pot concloure que la presenilina és un tetràmer, amb dos fragments NTF i dos fragments CTF. S'ha provat d'acotar les regions dins de cada fragment implicades en aquestes interaccions i s'ha observat que una regió hidrofílica encarada cap a la llum del reticle endoplasmàtic que connecta les regions transmembrana I i II (HL1), és capaç d'homodimeritzar i, per tant, participa en l'homodímer NTF:NTF. A més, en aquesta regió altament conservada en l'escala evolutiva, es concentren un elevat nombre de mutacions causants d'Alzheimer. Es van introduir en l'HL1, mitjançant mutagènesi dirigida algues de les mutacions, i es va observar que totes elles alteren de forma significativa, tant per increment com per decrement, la interacció entre dos HL1. Per tal d'aprofundir en l'estructura d'aquest tetràmer, es van realitzar una sèrie de delecions de diferents regions de la presenilina, mitjançant les quals es va poder observar que totes les regions transmembrana participen en la formació de l'homodímer NTF:NTF i de l'homodímer CTF:CTF. La substitució de l'HL1 dins del fragment NTF per una altra regió hidrofílica de longitud molt inferior produeix, en l'homodímer NTF:NTF, un increment de la interacció. D'aquestes dades s'hipotetitza que aquesta regió hidrofílica tindria el rol de regular la interacció entre els dos fragments NTF o de determinar la col·locació de les regions transmembrana i, en definitiva, del tetràmer. Les darreres dades de la literatura indiquen que la presenilina forma part d'un complex proteic que contindria l'activitat gamma-secretasa, responsable de produir, entre d'altres, el pèptid beta-amiloide el qual forma dipòsits insolubles característics de la malaltia d'Alzheimer a partir de la seva proteïna precursora, i d'alliberar el domini intracel·lular del receptor Notch. S'ha hipotetitzat que la presenilina és la pròpia gamma-secretasa que s'autoactivaria pel tall presenilinasa, i que dos residus aspàrtics situats a les regions transmembrana VI i VII formarien un grup di-aspartil catalític. Es van realitzar experiments en cèl·lules en cultiu de Drosophila melanogaster, en les quals es va sobreexpressar de forma transitòria diferents variants mutades de la presenilina. D'una banda, es va observar que la presenilina és sensible a la introducció de seqüències extres, que codifiquen per epítops que en permeten la immunodetecció, en els dos extrems, amino i carboxiterminal. De l'altra banda, es va poder corroborar que la substitució d'un dels residus aspàrtic catalític inhibeix el tall proteolític de la presenilina. La substitució de l'HL1 també produeix una inhibició de l'endoproteòlisi. Les dades de la literatura postulen que la presenilina s'autoactiva per endoproteòlisi. Les dades generades en aquest treball indiquen que la presenilina és un tetràmer, i obren la possibilitat que el tall productor dels fragments NTF i CTF es pugui produir de forma intramolecular i/o intermolecular, entre dues presenilines. Es va explorar aquesta possibilitat mitjançant la coexpressió transitòria de dues variants de presenilina en cèl·lules SL2, i es va obtenir un resultat molt preliminar indicatiu que el tall es produiria intermolecularment.

Els resultats presentats en aquesta tesi s'emmarquen en el camp de l'estudi de les bases genètiques de l'osteoporosi. L'osteoporosi és un clar exemple de malaltia complexa, on els factors genètics tenen una elevada participació en la seva etiologia. El grup d'osteoporosi de la Universitat de Barcelona treballa en col·laboració amb la unitat URFOA de l'Hospital del Mar en la creació d'una col·lecció de mostres d'ADN de dones postmenopàusiques de l'àrea geogràfica de Barcelona, la cohort BARCOS. En aquesta es recullen, paral·lelament a les mostres biològiques, dades antropomètriques de les participants, valors de densitat mineral òssia i la ocurrència de fractures osteoporòtiques, així com d'altres informacions sobre l'estil de vida o hàbits alimentaris. Tot aquest material ens permet realitzar estudis d'associació genètica per trobar variants polimòrfiques que puguin explicar la variabilitat en els valors de DMO. La DMO s'utilitza com a fenotip quantitatiu per estudiar l'osteoporosi. El coneixement d'aquestes variables associades ha de tenir un valor predictiu de la susceptibilitat de cada individu a patir osteoporosi o fractura osteoporòtica. El principal objectiu d'aquesta tesi ha estat la realització d'un estudi d'associació en el qual es varen testar un grup d'SNPs seleccionats per tal de capturar la màxima variabilitat comuna en el gen LRP5 amb la DMO lumbar i femoral i amb la presència de fractures osteoporòtiques. Es varen obtenir resultats positius per diversos polimorfismes: rs312009 associat amb DMO lumbar, rs2508836 associat amb DMO lumbar i femoral, i rs729635 i rs643892 associats amb fractura (Agueda i col., 2008).D'entre les associacions trobades, és va decidir prosseguir a l'estudi funcional d'una d'elles: el polimorfisme rs312009. Aquest es troba localitzat en la regió 5' del gen LRP5 i els programes de predicció indicaven que en la seva posició s'hi podria unir el factor de transcripció osteoblàstic Runx2. Els assaigs de retenció en gel van permetre confirmar aquesta unió. La següent hipòtesi va ser que la presència d'un o altre al·lel de rs312009 (C o T) podria estar afectant la capacitat transcripcional del promotor d'LRP5, i que aquest mecanisme molecular podia ser en part responsable de l'associació trobada. Tanmateix, es va voler aprofundir en l'anàlisi de la implicació del factor de transcripció Runx2 en la transcripció d'LRP5. Aquestes noves preguntes es varen respondre experimentalment per mitjà d'assaigs de gen reporter en dues línies d'osteosarcoma. La construcció amb la regió promotora que contenia l'al·lel T va presentar una capacitat transcripcional significativament superior a la de l'al·lel C. També es va descriure un efecte estimulador de Runx2 sobre el promotor d'LRP5, observat en els estudis de cotransfecció. Seguint en la mateixa línia de recerca de variants genètiques implicades en la determinació dels fenotips osteoporòtics, la cohort BARCOS ha participat en les meta-anàlisis realitzades pel consorci internacional GENOMOS. En el treball concret presentat en aquesta tesi, dues variants de canvi d'aminoàcid del gen LRP5 i una del gen LRP6 (Val667Met, Ala1330Val i Ile1062Val, respectivament) varen ésser interrogades en relació a la seva associació amb DMO i fractura en 37.534 individus de 18 grups europeus i nord-americans (van Meurs i col., 2008). En aquest treball varem trobar associacions consistents amb DMO i fractura per als polimorfismes d'LRP5, però amb efectes molt modestos. Finalment, tres polimorfismes prèviament associats amb DMO en altres cohorts, i amb evidències experimentals de la seva funcionalitat biològica [(Ala222Val (rs1801133) del gen MTHFR, -13910C>T (rs4988235) del gen LCT i Ile1062Val (rs2302685) del gen LRP6], es varen testar en la cohort BARCOS. El principal objectiu d'aquest treball era la replicació dels resultats previs en una cohort independent, una aproximació actualment indispensable per confirmar els resultats trobats en els estudis d'associació (Agueda i col., 2010). / Osteoporosis, a complex disease determined by genetic and environmental factors, is characterized by a reduced bone mineral density (BMD) and an increased risk of fracture. In this thesis we studied the genetic component of osteoporosis through association and functional studies. Firstly, LRP5 was selected for association studies for being a well known candidate gene for osteoporosis. Gene-wide association studies were performed with the BARCOS cohort, a group of postmenopausal women from Barcelona. Several polymorphisms were associated with osteoporotic phenotypes. In addition, two missense variants of this gene were also studied at metaanalysis level within the international Genomos consortium. Significant results were also obatined.In second place, one of the LRP5 polymorphism associated with lumbar spine BMD was selected for further functional studies. This polymorphism is located at LRP5 5' region and seems to affect its transcriptional capacity through differential binding of the transcription factor Runx2. Finally, three functional polymorphism from MTHFR, LCT and LRP6 genes and previously associated with osteoporotic phenotypes were tested for replication in our Spanish cohort BARCOS. The MTHFR Ala222Val polymorphism was associated with vertebral fracture.

El disseny i la producció de zimògens de ribonucleases que puguin ser específicament activats per la proteasa d’un patogen, constitueix un enginyós mecanisme per controlar la seva activitat enzimàtica i, conseqüentment, la seva citotoxicitat. En aquest treball es descriu la construcció de 12 variants de zimògens d’Onconasa® (ONC) i de ribonucleasa pancreàtica humana (HP-RNasa), activables per la proteasa del Virus de la Immunodeficiència Humana (HIV-1 PR). Els zimògens d’ONC i HP-RNasa s’activen in vitro amb la proteasa, mantenint una elevada estabilitat sobretot els zimògens d’ONC. L’augment d’activitat ribonucleolítica de la forma activada respecte el precursor, que resulta baix per les variants d’ONC, és d’unes 150 vegades per les d’HP-RNasa. Els zimògens d’ONC presenten una molt bona internalització en limfòcits-T humans, a més de no presentar, en cap dels casos, citotoxicitat en cèl·lules Jurkat en cultiu abans de l’activació. Finalment, s’ha estudiat l’estructura i dinàmica de la forma intacta d’un dels zimògens d’ONC per Ressonància Magnètica Nuclear (NMR), permetent el desenvolupament i optimització futura de nous zimògens més efectius com a agents antivirals. / Design and production of ribonuclease zymogens that could be specifically activated by proteases of pathogens, would provide an ingenious mechanism to control their activity and, consequently, their cytotoxicity. Here we report the construction of 12 variants of Onconase® (ONC) and Human Pancreatic Ribonuclease (HP-RNase) zymogens that are recognized and activated specifically by the Human Immunodeficiency Virus Protease (HIV-1 PR). ONC- and HP-RNase- zymogens are activated by the HIV-1 PR in vitro, and mantain a high conformational stability mainly in ONC variants. The increase of catalytic efficiency of the activated form compared to the precursor has been low in ONC zymogens, but 150-fold for those of HP-RNase. ONC zymogens can internalize in human T-lymphocyte Jurkat cells efficiently, and all of them do not show any cytotoxicity in this type of cells before their activation. Finally, the structure and dynamics of intact form of one of ONC zymogens has been determined by Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (NMR). This represents a first step toward the development and optimization of more effective zymogens, as antiviral agents.

Material addicional: http://hdl.handle.net/10230/24645 / In this thesis we aimed to study evolutionary implications of low-complexity regions, protein sequences of very simple amino acid composition. Its uncontrolled expansion causes several human diseases, including Huntington’s disease and other neurodegenerative and developmental diseases. However, they are surprisingly abundant in proteins, which seem paradoxical given their high pathogenic potential. Moreover, experimental data has shown that the formation of novel LCRs, or the modification of existing ones, can have functional consequences. First we wanted to perform a descriptive analysis of low-complexity regions in chordates focusing on lineage and age related features of LCR evolution. Second, we want to assess why low-complexity regions are so common in eukaryotic proteins. Two hypotheses have been proposed: on one hand, they may be an important source of genetic variability and might be involved in adaptive processes. To investigate whether LCRs are important players in the acquisition of novel functions, we examined transcription factor gene duplicates. On the other hand, low-complexity regions may also contribute to the formation of novel coding sequences, facilitating the generation of novel protein functions. We have tested this hypothesis by examining the content of low-complexity sequences in proteins of different age. Both analysis let us to conclude that low-complexity regions may be involved in protein diversification, either providing new functional sequences that will modify existing proteins or being involved in the formation of novel protein coding sequences. / L'objectiu d'aquesta tesi és estudiar les implicacions evolutives de les regions de baixa complexitat (LCRs, en anglès), seqüències de proteïnes amb una composició d'aminoàcids molt simple. La seva expansió incontrolada causa diverses malalties humanes, incloent la malaltia de Huntington i altres malalties neurodegeneratives i del desenvolupament. No obstant això, són sorprenentment abundants en les proteïnes, cosa que pot semblar paradoxal, donat el seu potencial patogènic. A més, estudis experimentals han demostrat que la formació de noves LCRs, o la modificació de les ja existents, pot tenir conseqüències funcionals. En primer lloc hem volgut fer una anàlisi descriptiva de les regions de baixa complexitat en cordats, incidint en les característiques relacionades amb el llinatge i l'edat de les LCRs des d'un punt de vista evolutiu. En segon lloc, hem volgut avaluar per què les LCRs són tan freqüents en les proteïnes d'eucariotes. S'han proposat dues hipòtesis: d'una banda, poden ser una important font de variabilitat genètica i podrien estar implicades en processos d'adaptació. Per tal d'investigar si les LCRs juguen un paper important en L'adquisició de noves funcions, hem examinat factors de transcripció que han patit una duplicació o. D'altra banda, les regions de baixa complexitat també poden contribuir a la formació de noves seqüències codificants, facilitant la generació de funcions noves de les proteïnes. Per comprovar aquesta hipòtesi, hem examinat el contingut de les seqüències de baixa complexitat en proteïnes d'edats diferents. Les dues anàlisis permeten concloure que les regions de baixa complexitat poden estar involucrades en la diversificació de les proteïnes, ja sigui proporcionant noves seqüències funcionals que modifiquen les proteïnes existents o participant en la formació de noves seqüències codificants de proteïnes.

La cistinosi i la malaltia de Niemann-Pick tipus C (NPC) són dues patologies hereditàries monogèniques poc freqüents, per aquest motiu estan classificades dins del grup de malalties anomenades rares. La cistinosi està causada per mutacions al gen CTNS, que codifica per una proteïna transmembrana del lisosoma que rep el nom de cistinosina. En canvi, la malaltia de NPC és deguda a mutacions al gen NPC1 o al gen NPC2, que codifiquen per una proteïna integral de la membrana lisosòmica i una proteïna soluble del lisosoma, respectivament, i aquestes reben el mateix nom que el gen, NPC1 i NPC2. El funcionament incorrecte d’aquestes proteïnes de transport dóna lloc a una acumulació de productes, diferent a ambdós casos, a l’interior del lisosoma, sent classificades com a malalties d’acumulació lisosòmica. Aquesta tesi doctoral s’ha centrat en l’anàlisi molecular de pacients afectes d’alguna d’aquestes dues malalties. S’ha realitzat el primer estudi mutacional de cistinosi a la població espanyola, que ha permès la identificació de 15 mutacions diferents, 7 de les quals no havien estat descrites: tres mutacions de canvi de sentit (p.M1T, p.S270F i p.G309V), tres delecions (c.1-19_61del, c.295_310del i c.320_323delATCA) i una mutació de splicing (c.682-1G>T). La deleció de 57 kb és la mutació més freqüent a Espanya (38% dels al•lels) i conjuntament amb altres 5 mutacions representen el 73% dels al•lels estudiats. S’ha establert que els pacients amb fenotip clínic infantil tenen a ambdós al•lels mutacions que trunquen o que afecten aminoàcids conservats de les regions transmembrana de la proteïna. En canvi, la mutació p.S139F s’ha associat a la forma juvenil de la malaltia. L’estudi mutacional realitzat a la malaltia de Niemann-Pick tipus C ha permès establir el genotip d’un gran nombre de pacients, identificant 74 mutacions diferents, 17 de les quals no havien estat descrites: set mutacions de canvi de sentit (p.P474A, p.G535V, p.F995L, p.F1079S, p.L1106P, p.G1209E i p.S1249G), dues mutacions sense sentit (p.Q775X i p.E1089X), dues insercions (p.L1117PfsX4 i p.I1061NfsX4), una deleció en pauta (p.N916del), quatre mutacions de splicing (c.58-3280C>G, c.882-28A>T, c.2604+5G>A i c.3591+5G>A) i la primera gran deleció que afecta al gen NPC1 i gens flanquejants. També s’han pogut establir correlacions genotip-fenotip per a un conjunt de mutacions. També s’ha demostrat la implicació de diferents mecanismes cel•lulars en la malaltia de Niemann-Pick tipus C, segons els tipus de mutacions causants: el “splicing”, el procés de “nonsense-mediated mRNA decay” i la degradació proteica portada a terme pel proteasoma. S’han identificat mutacions intròniques profundes i s’ha caracteritzat el seu efecte en el mRNA, conjuntament amb el de les mutacions de “splicing” que afecten als llocs canònics. El mecanisme de NMD és el responsable de la degradació del mRNA en tots els al•lels analitzats que codifiquen per un PTC al gen NPC1. La majoria de mutacions de canvi de sentit analitzades condueixen a una reducció significativa o a l’absència de la proteïna NPC1, degut a què la proteïna NPC1 mutada és degradada per la via de la ubiquitina-proteasoma. La proteïna NPC1 mutada recuperada, després del tractament amb els inhibidors del proteasoma (ALLN i MG132), és capaç de disminuir els nivells de colesterol a totes les línies cel•lulars NPC estudiades. Aquesta observació podria obrir la porta a l’ús d’aquests fàrmacs com a futur tractament per a la malaltia de NPC causada per determinades mutacions de canvi de sentit. / TITTLE: “Molecular aspects of both lysosomal transport diseases: cystinosis and Niemann-Pick disease type” TEXT: The cystinosis and Niemann-Pick disease type C (NPC) are two rare monogenic hereditary diseases. The cystinosis is caused by mutations in the gene CTNS, which encodes a transmembrane protein of the lysosome that is called cystinosin. NPC disease is caused by mutations in the NPC1 or NPC2 gene, encoding an integral lysosomal membrane protein and a soluble protein of the lysosome, respectively, and these are the same name as the gene, NPC1 and NPC2. The impaired transport leads to an accumulation of products, different in both cases, inside the lysosome, being classified as lysosomal storage disorders. This thesis has focused on the molecular analysis of patients with any of these diseases. Molecular analysis in the Spanish cystinosis patients has allowed the identification of 15 different mutations, 7 of which had not been described. The 57-kb deletion is the most common mutation in Spain (38% of alleles) and together with other 5 mutations accounted for 73% of the studied alleles. The p.S139F mutation has been associated with the juvenile form of the disease. Molecular analysis in NPC disease has established the mutation profile in a large number of patients. 74 different mutations have been identified, 17 of which had not been described previously, including the first large deletion affecting the whole NPC1 gene and flanking genes. Genotype-phenotype correlations have been established for several mutations. Different cellular mechanisms are involving in NPC disease: splicing, nonsense-mediated mRNA decay and proteasomal degradation. Deep intronic mutations have been identified and the effect on the mRNA has been characterized. NMD process is responsible for the mRNA decay for all analyzed NPC1 PTC-encoding mutations. Several missense mutations lead to a significant reduction or absence of NPC1 protein, because the NPC1 mutant protein is degraded by the ubiquitin-proteasome pathway. Treatment with proteasome inhibitors partially reverses the NPC1 decrease and reduces cholesterol levels in all studied NPC cell lines. This observation might represent a therapeutical approach for future treatments of NPC disease caused by specific missense mutations.

Las filogenias que incorporan información procedente de distintos loci del genoma son fundamentales para resolver las relaciones evolutivas de los seres vivos, así como para determinar con precisión los tiempos de divergencia de las distintas especies y poblaciones y estudiar fenómenos como el flujo genético. En primer lugar, se analizaron los genomas completos de las bases de datos públicas de varias especies de mamíferos y se extrajeron todos los intrones. A continuación se desarrollaron una serie de filtros computacionales automatizados para seleccionar los intrones más adecuados para ser empleados en la filogenia de especies cercanas de mamíferos de acuerdo a criterios de tamaño, copia única, reloj molecular y divergencia, obteniéndose un total de 224 nuevos marcadores intrónicos. Se amplificaron varios de estos marcadores en varias parejas de especies cercanas de mamíferos, confirmando que eran efectivamente variables interespecíficamente, y también intraespecíficamente A continuación, se emplearon 8 de estos intrones junto con marcadores mitocondriales para realizar el primer estudio filogeográfico del desmán ibérico (Galemys pyrenaicus), un mamífero endémico semiacuático de la Península Ibérica. Se obtuvieron muestras de excrementos y tejidos de toda la distribución de la especie, y las secuencias mitocondriales obtenidas revelaron una fuerte estructura filogeográfica con cuatro linajes de distribución parapátrica entre los que no se observó prácticamente flujo genético (si bien los datos nucleares sugirieron cierta presencia de flujo genético en algunas de las zonas de contacto). Los niveles de diversidad genética calculados para G. pyrenaicus fueron muy bajos comparados con la media de los mamíferos, y se observaron importantes diferencias entre los distintos clados mitocondriales, hallándose la mayor diversidad en la zona noroeste de la Península Ibérica (lo que indicaría la presencia de un refugio glacial en esta área) y la menor en los Pirineos (que serían producto de una rápida colonización postglacial). Este escenario se vio corroborado por la elaboración de un modelo de distribución de la especie y la posterior proyección a las condiciones del Último Máximo Glacial, que indicó que la zona de mayor probabilidad de presencia asociada era el Noroeste de la Península Ibérica. Por último, se realizó un estudio de los tiempos de especiación y divergencia de los musgaños europeos del género Neomys empleando metodologías que estiman el árbol de especies incorporando predicciones de la teoría de la coalescencia. Para ello se emplearon 13 intrones del conjunto desarrollado anteriormente, y se halló una notable divergencia entre dos subespecies de Neomys anomalus (N. a. anomalus y N. a. milleri). La estima del árbol de especies permitió datar esta divergencia en medio millón de años, y la aplicación de un modelo de aislamiento con divergencia permitió detectar que no se había producido flujo genético significativo entre ambas. Esto sugiere que la actual clasificación taxonómica no refleja de forma correcta la realidad biológica de estos organismos. La comparación de distintas estrategias en las estimas de árboles de especies y tiempos de divergencia reveló el riesgo asociado a no emplear tasas evolutivas específicas de los organismos y de los marcadores empleados en este tipo de estudios. / Initially, several publicly available genome sequences of mammalian species were analysed and all the introns were extracted. A bioinformatic pipeline was then developed to control for orthology and to filter them following several criteria: that they had an adequate size and molecular clock, they were divergent and single copy. The final result was a new set of 224 introns to be used in closely related species mammalian phylogenetics. Then 8 of these introns, along with mitochondrial markers, were used to perform a phylogeographic study of the Iberian Desman, that is an endangered semiaquatic mammal endemic to the Iberian Peninsula. A strong phylogeographic structure with several mitochondrial lineages with no mixing was revealed, although nuclear DNA data suggest some degree of mixing in some of the contact zones. A low overall genetic diversity for the whole species was found but there were also striking differences between the clades, with the diversity being higher in the Northwestern part of the Peninsula (thus being a potential glacial refugium) and lower in the Pyrenees (which would be the result of a recent colonization). The dating of the origin of all the desman mitochondrial haplotypes to the Middle Pleistocene and the projection of a species distribution model to the conditions of the Last Glacial Maximum also support this scenario, thus highlighting the importance of the Pleistocene glacial cycles in shaping the current genetic structure of this species. Finally, 13 introns were used to obtain the species tree of the genus of European water shrews Neomys using a multilocus coalescent approach. The divergence of two subespecies of Neomys anomalus was estimated at about 0.5 million years ago, and no significant gene flow was detected since their divergence, which suggests that their current taxonomic status might not reflect the biological reality of these taxa. A series of tests to measure the effects of different ways of estimating the rates of the partitions used on the estimation of divergence in species trees were performed. These tests highlighted the importance of using lineage and marker specific estimated rates.

Tesi realitzada a l'Institut de Medicina Predictiva i Personalitzada del Càncer (IMPPC) / In the era of “omics” data, the use of computational approaches to store, integrate and analyze biological information is becoming a priority, particularly in the field of biomedicine and the study of diseases. Bioinformatics methods have been successfully applied to numerous problems derived from this data explosion, such as the integration of experimentally-derived raw data with other sources of biological information in order to analyze it, the identification of features specific for biologically relevant sets of genes (such as those related to disease) or the prioritization of long lists of genes and mutations potentially associated to different phenotypes. In this thesis we will develop a new relational database of genes and mutations associated to disorders where annotations will be mapped to ontologies. By doing so, we will overcome some limitations of existing databases, such as their lack of normalization of annotations. This will provide us an optimal framework to investigate the use of ontologies and enrichment analysis to identify disease-specific mutation features that, hopefully, will help us in understanding some aspects of the underlying molecular biology of these diseases. Finally, we will explore whether networks derived from different types are better are predicting different diseases. Moreover, we will also test several combinations of these networks in order to see if they perform better than the networks alone. / La generación masiva de datos provocada por el incremento en el uso de tecnologías de alcance genómico hace que las técnicas de análisis de datos bioinformáticos sean más necesarias que nunca. En el campo de la identificación de genes y mutaciones asociados a enfermedad, hay dos grupos de técnicas que se están convirtiendo en muy populares para la priorización de listas de genes y mutaciones candidatos: el análisis de enriquecimiento y el uso de redes biológicas. En esta tesis hemos evaluado el uso de estas técnicas para (I) identificar propiedades biológicas que asociadas a mutaciones específicas de ciertas enfermedades y (II) el uso de distintas redes de información biológica y diferentes algoritmos de la teoría de redes para priorizar genes asociados a 5 tipos de enfermedades distintas. Para ello hemos creado una base de datos relacional con información sobre genes y mutaciones asociados a enfermedades y las propiedades biológicas que se alteran en las enfermedades. Todas las anotaciones han sido hechas con ontologías o vocavularios controlados. El análisis de enriquecimiento nos ha permitido identificar propiedades enriquecidas o deplecionadas en mutaciones asociadas a distintas enfermedades. Entre ellas destacan el empobrecimiento en mutaciones asociadas a cáncer en puentes disulfuro, péptidos señal y dominios transmembrana, o el enriquecimiento de mutaciones de cáncer en regions intrínsecamente desesctruturadas, regiones de composición de sesgada y regiones ricas en serina. Nuestra hipótesis es que las propiedades empobrecidas se deben a que su mutación es deleterea para la célula tumoral. Ello se debe a que las células tumorales tienen preactivada una via que puede llevar a apoptosis, la via de respuesta a proteínas malplegadas. La mutación en puentes disulfuro, dominios transmembrana o péptidos señal provoca una acumulación de proteínas en el retículo endoplásmico y una sobractivación de dicha via, provocando la apoptosis de la célula. Por otro lado, creemos que las propiedades enriquecidas en mutaciones de cáncer lo son porqué permiten alterar interacciones proteína-proteína y alterar el proteoma, una propiedad que se ha asociado con propiedades tumorales. En cuanto al uso de redes biológicas para predecir nuevos genes asociados a distintas enfermedades, hemos usado 5 algoritmos distintos, 4 redes con asociaciones derivadas de distintos tipos de información biológica para predecir genes asociados a 5 enfermedades distintas. Los 5 algoritmos usados son: el contaje de vecinos hasta distancias 1, 2 y 3 (DN1, DN y DN3), el Diffusion Kernel (DK) y el caminador aleatorio (RWR). Los 2 últimos pertenecen a un grupo de algoritmos llamados "algoritmos de difusión" y, según publicaciones previas, tienen una mayor capacidad de predicción que los 3 primeros (las variantes del contaje de vecinos). No obstante, según nuestros resultados, esta superioridad no es generalizable y depende en gran medida del tipo de red usada y la enfermedad predecida. Las 4 redes que hemos empleado representan proteínas conectadas por distintos tipos de relaciones: interacciones físicas (que hemos obtenido de HPRD), paralogía (de ENSEMBL), pertenencia a la misma via de señalización o coexpresión en tejido humano sano. El tipo de red más usado con el fin de predecir genes asociados a enfermedad es aquella derivada de datos de interacción, no obstante, nuestros datos demuestran que los otros 3 tipos de redes pueden funcionar tan bien o incluso mejor que ésta para este fin. A continuación hemos tratado de combinar las redes de distinta forma con el fin de mejorar su poder de predicción. Para ello hemos usado distintos algoritmos que pueden ser clasificados en dos grupos en función del momento de combinación de la información: "a priori" (aquellos métodos que combinan las puntuaciones obtenidas para cada gen en las redes independientes, en nuestro caso un clasificador Bayesiano) y "a posteriori" (la combinación de la información se hace antes de usar el algoritmo de redes, en nuestro caso hemos sumado los nodos y las aristas de las redes). De acuerdo a nuestros datos es mejor usar métodos "a priori", ya que el clasificador Bayesiano siempre tiene un menor poder predictivo que la suma de redes. Además, parece que es muy complicado obtener una suma de redes que funcione mejor, en términos de AUC, que la mejor red independiente, ya que sólo para una de las enfermedades, diabetes, hemos encontrado una combinación de redes que cumpliera con estos requisitos. También hemos observado que no existe una correlación entre el número de tipos de información biológica usados para crear la combinación de redes y su capacidad de predicción. Finalmente, hemos comprobado el poder predictivo de una de las mejores combinaciones de redes en un set de datos independiente que hemos obtenido de COSMIC. Este set de datos contiene genes mutados en, al menos, 15 muestras de cáncer colorectal y que no están presentes en nuestra base de datos. Hemos podido predecir estos genes tanto en términos de AUC como en términos de enriquecimiento de "ranking".