La mucopolisacaridosi l, la mucopolisacaridosi II i la leucodistròfia metacromàtica sòn tres malalties Iisosòmiques hereditàries. Totes tres són degudes al defecte funcional d'un enzim Iisosòmic que és incapaç de degradar les macromolècules procedents del recanvi cel•lular. Aquests substrats a mig degradar s'acumulen a les cèl.lules i són els causants del deteriorament i empitjorament de la clínica de forma progressiva. Els pacients amb aquestes malalites presenten un curs fatal, amb quadre degeneratiu progressiu sever i, en alguns casos, dismòrfies, alteracions òssies diverses, afectació ocular i organomegàlies. La mucopolisacaridosi I o malaltia de HurlerlScheie (MPS I; MIM 252800) és una malaltia hereditària d'acumulació lisosòmica produïda per la deficiència de l'enzim alfa-L-iduronidasa. Aquest enzim participa en la degradació dels glucosaminoglicans heparan sulfat i dermatan sulfat. És una malaltia autosòmica recessiva. Els pacients amb MPS I presenten hepatoesplenomegàlia, deformitats esquelètiques, trets facials toscos, rigidesa d'articulacions, retard mental, sordesa i opacitat cornial. Es classifiquen els pacients en tres formes segons d'edat d'aparició dels símptomes: Forma severa o Hurler, forma íntermèdia o HurlerlScheíe i forma lleu o Scheíe. El gen que codifica per l'alfa-L-iduronidasa (IOUA; EC 3.2.1.76) està localitzat al locus 4p16.3, ocupa 16 kb, té 14 exons i un trànscrit de 2.7 kb que codifica per una proteïna de 653 aminoàcids. Fins a l'actualitat s'han descrit una quarantena de mutacions diferents al gen IOUA i algunes d'elles s'han vist amb certa freqüència. També s'han identificat una trentena de polimorfismes al gen IOUA. S'han estudiat 27 pacients espanyols amb MPS I; dels 54 al.lels estudiats, en 32 (un 59.3%) s'ha Identificat la mutació W402X, en 5 al.lels (9.3%) s'ha identificat la mutació P533R i en 4 (7.4%) la mutació Q70X. Així doncs, amb l'estudi d'aquestes tres mutacions es cobreix un 76% dels al.lels de la malaltia i un 63% dels genotips, el que fa recomanable començar l'estudi de nous pacients analitzant aquestes tres mutacions. Així mateix, ja anteriorment s'havia descrit que aquestes mutacions estaven associades a la forma severa de la malaltia, i els resultats en pacients espanyols reforcen aquestes observacions. La mucopolisacaridosi II o malaltia de Hunter (MPS II; MIM 309900) és una malaltia hereditària d'acumulació Iisosòmica produïda per la deficiència de l'enzim iduronat-2-sulfatasa. Aquest enzim participa també en la degradació dels glucosaminoglicans heparan sulfat i dermatan sulfat. És una malaltia recessiva lligada al cromosoma X. Els pacients amb MPS II presenten una clínica molt similar a la que presenten els pacients amb MPS I, amb l'excepciò que els pacients Hunter no acostumen a presentar opacitat cornial. Es classifiquen els pacients en tres formes segons l'afectació neurològica: Forma severa, forma intermèdia i forma lleu. El gen que codifica per l'iduronat-2-sulfatasa (lOS; EC 3.1.6.13) està localitzat al locus Xq28, ocupa 24 kb, té 9 exons i un trànscrit de 2.3 kb que codifica per una proteïna de 550 aminoàcids. Respecte les mutacions descrites al gen lOS, s'ha vist que entre un 15 i un 20% dels pacients presenten grans delecions o reordenaments del gen, respecte les mutacions puntuals fins a l'actualitat se n'han descrit unes dues-centes de diferents. Gairebé totes sòn de caràcter particular, o sigui que cada família presenta una mutació diferent. Els exons que presenten major nombre de mutacions són l'exó III, V, VIII i IX. S'han estudiat 36 pacients espanyols amb MPS II,4 d'ells (11.1%) presenten una deleció total, parcial o un reordenament del gen, els 32 restants presenten 26 mutacions puntuals diferents, 21 de les quals han estat descrites per primera vegada. Totes les mutacions puntuals s'han identificat en una sola família a excepció de les mutacions G374G i R443X que s'han identificat en tres pacients cada una, i la R468Q que s'ha identificat en dos pacients. Això mostra que en aquesta malaltia existeix una gran heterogeneïtat al•lèlica. Els exons que presenten més mutacions als pacients espanyols són el VIII i el IX. L'existència d'aquesta gran heterogeneïtat genètica en aquesta malaltia dificulta el poder establir una correlació genotip-fenotip, sols els pacients que presenten grans delecions o reordenaments del gen s'ha vist que presenten sempre la forma severa de la malaltia. El fet que cada pacient í cada família presenti una mutació diferent fa difícil el poder establir una estratègia de recerca de mutacions, ja que cada nou cas comporta l'estudi del gen sencer, és per això que es considera que una bona estratègia de cara al diagnòstic de les familiars femenines dels nous pacients és l'estudi indirecte per marcadors polimòrfics intra i/o extragènics propers al gen. La leucodistròfia metacromàtica (LOM; MIM 250100) és una malaltia hereditària d'acumulació lisosòmica produïda per la deficiència de l'enzim arilsulfatasa A que afecta el metabolisme de la mielina. Aquest enzim participa en la degradació dels sulfolipids gaiactosil sulfat (o cerebròsid sulfat) i lactosil sulfat. La seva deficiència provoca l'acumulació en la substància blanca del sistema nerviós central i als nervis perifèrics d'aquests substrats a mig degradar i són els causants del deteriorament i empitjorament de la clínica de forma progressiva. És una malaltia autosòmica recessiva. Els pacients amb LDM presenten desmielinització progressiva, atrófia óptica, demència i moren en estat decerebrat. Els pacients es classifiquen en tres formes segons l'edat d'aparició dels slmptomes: Forma infantil, forma juvenil i forma adulta. El gen que codifica per l'arilsulfatasa A (ARSA; EC 3.1.6.8) està localitzat al locus 22q13.31-qter, ocupa 3.2Kb, té 8 exons i un trànscrit de 2.1Kb que codifica per una proteïna de 507 aminoàcids. Fins a l'actualitat s'han descrit unes setenta mutacions diferents al gen ARSA, algunes d'elles amb certa freqüència a diferents poblacions i tambè s'han identificat nou polimorfismes diferents. S'han estudiat 20 pacients espanyols amb LDM i s'han identificat 18 mutacions diferents en els 40 al.lels analitzats, de les quals 12 són mutacions descrites per primera vegada. Aixl mateix s'han identificat tres nous polimorfismes. De les 18 mutacions identificades, tres d'elles s'han trobat amb certa freqüència en la Nostra població. Aquest és el cas de la mutació IVS2+1G -> A que s'ha identificat en 10 dels 40 al.lels (25%), la mutació D255H que s'ha identificat en 7 dels al.lels (17.5%) i la mutació nova T3271 que s'ha identificat en 4 al.lels més (10%). Aixi, amb l'estudi d'aquestes tres mutacions es cobreix un 52.5% dels al.lels LDM. Aixi mateix s'ha pogut veure per estudi d'haplotips que aquestes mutacions freqüents estan cada una d'elles en desequilibri de lligament amb un determinat haplotip, el que indicaria un possible origen únic per cada d'aquestes mutacions. Anteriorment s'havia observat que la mutació IVS2+1 G -> A estava associada a la forma infantil de la malaltia, els resultats en pacients espanyols recolzen aquesta observació i, d'altra banda, és la primera vegada que s'estableix la correlació entre la mutació D255H i la forma infantil de la malaltia. També s'ha pogut observar que existeix una correlació clara entre l'activitat enzimàtica i ia clinica dels pacients. Aixi doncs, en aquesta malaltia, ès recomanable iniciar l'estudi dels nous pacients analitzant les tres mutacions freqüents IVS2+1G-> A, D255H i T3271. / Mucopolysaccharidosis I (MPS I, M/M 252800), mucopo/ysaccharidosis II (MPS II, MIM 309900) and metachromatic leukodystrophy (MLD, M/M 250100) are three hereditary Iysosomal storage diseases due to the deficiency of a Iysosomal enzyme. We have studied the genes codifying the defective enzymes in the Spanish patients. MPS / is an autosomal recessive disease. We studied 27 patients. We identified mutation W402X in 59.3% of MPS I alleles, mutation P533R in 9.3% and mutation Q70X in 7.4%. We cover 76% of the alleles and 63% of the genotypes with the analysis of these three mutations. Correlation between these three mutations and the severe form of the disease seen in the Spanish patients agrees with previous results in other populations. MPS II is an X-Iinked recessive disease. We studied 36 patients. Four patients had a total or partial deletion or a rearrangement of the gene. These gene alterations are related with the severe form of the disease. The rest of the patients presented with a particular point mutation, showing the existence of a high genetic heterogeneity in this disease. Such heterogeneity would difficult the routine molecular diagnosis, although it remains as the best issue for detection. MLD is an autosomal recessive disease. We studied 20 patients. Mutation IVS2+1G -> A was identified in 25% of the alleles. This change is associated with the late-infantile form of the disease. Mutation D255H was identified in 17.5% of the alleles and for the first time we have established a c1ear correlation between this mutation and MLD severe forms. The newly identified mutation T3271 was found in 10% of the alleles. Analysis of these three mutations allows to cover 52.5% of the mutated alleles. Haplotype analyses showed that these three frequent mutations might have a unique origin.

En el presente trabajo investigamos algunos de los mecanismos endocrinos implicados en el crecimiento oocitario del lenguado senegalés (Solea senegalensis), así como el desarrollo de métodos para el control de su reproducción en cautividad. La tesis se dividió en tres partes diferentes:(i) Capítulo 1: Introducción General donde se resume el estado actual de conocimientos sobre los mecanismos endocrinos implicados en la reproducción de teleósteos, y se introduce al lector en los beneficios y problemas actuales de la acuicultura de peces planos, especialmente del lenguado senegalés (Solea senegalensis);(ii) Capítulos 2 y 3, donde se investiga el proceso de vitelogénesis en el lenguado senegalés. En el Capítulo 2, se caracteriza el ADN complementario de ambas isoformas del receptor de lipoproteínas de muy baja densidad/vitelogenina (Vtg), vtgr, y de una nueva proteína de unión a ácidos grasos (FABP), FABP11, encontrada exclusivamente en peces teleósteos. El análisis de expresión de estos genes en ovario de lenguado senegalés, sugiere que el nivel de los transcritos de vtgr puede ser utilizado como marcador molecular para determinar el número de oocitos reclutados en vitelogénesis, mientras que los niveles de expresión de fabp11 pueden funcionar como un marcador molecular muy útil para determinar los procesos celulares y factores ambientales que regulan el proceso de la atresia folicular. En el Capítulo 3, se valida un ELISA homologo para determinar la concentración de Vtg en plasma. Mediante este análisis se correlacionan las variaciones anuales de Vtg con los niveles de 17-estradiol, índice gonadosomático y porcentaje de oocitos en diferente estadio de desarrollo oocitario; y(iii) Capítulos 4 y 5, donde se investiga la aplicación de diferentes métodos hormonales para inducir a la ovulación y a la espermiación en lenguado senegalés en condiciones de cautividad. En el Capítulo 4, se tratan machos y hembras con un agonista de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRHa), tanto mediante inyecciones sucesivas como mediante implantes de liberación sostenida. El tratamiento con GnRHa resulta eficaz para inducir la ovulación y la puesta en hembras F1 incapaces de reproducirse en cautividad. En cambio, el mismo tratamiento con GnRHa en machos es aparentemente ineficaz para aumentar la producción de esperma y/o estimular la espermatogénesis. En el Capítulo 5, el tratamiento de machos adultos con GnRHa en combinación con 11-ketoandrostenediona (OA), precursor de 11-ketotestosterona (11-KT), acelera la espermatogénesis y aumenta los niveles plasmáticos de los metabolitos 5β-reducidos de 17α,20β-dihidroxi-4-pregnan-3-ona (17,20βP), esteroide implicado en la maduración del esperma en salmónidos. Además, la motilidad del esperma producido por los machos tratados con GnRHa+OA, se ve duplicada respecto al esperma producido por el grupo control o el grupo tratado sólo con GnRHa. Por tanto, el tratamiento de machos de lenguado senegalés con GnRHa+OA puede ser empleado como potencial terapia hormonal para mejorar disfunciones reproductivas de machos de lenguado senegalés en condiciones de cautividad.En resumen, la presente tesis ha contribuido a profundizar en el conocimiento de los mecanismos endocrinos implicados en la gametogénesis del lenguado senegalés, y ha establecido algunos protocolos para la inducción de la ovulación y la espermiogénesis a través de terapias hormonales en esta especie de elevado interés comercial. / The present work was aimed at the investigation of some endocrine mechanisms involved in oocyte growth in the Senegalese sole (Solea senegalensis), as well as to develop methods for the control of reproduction of this species in captivity. The thesis was divided into three separate parts:(i) Chapter 1, a General Introduction where it was reviewed the endocrine regulation of reproduction in teleosts, and it introduced the reader into the significance and current problems in the culture of flatfish, particularly the Senegalese sole;(ii) Chapters 2 and 3, in which it was investigated the vitellogenic process of Senegalese sole. In chapter 2, it is described the isolation of complementary DNAs encoding two isoforms of very low-density lipoprotein/vitellogenin receptor (VtgR) and a novel fatty acid-binding protein (FABP), FAB11. The analysis of expression of these genes suggested that the the level of vtgr transcripts in the ovary may be used as a functional marker to quantify the number of oocytes recruited for vitellogenesis, while that of fabp11 may be a very useful molecular marker for determining cellular events and environmental factors that regulate follicular atresia. In chapter 3, an homologous EIA to quantify plasma vitellogenin was developed, and annual plasma levels of vitellogenin were correlated with changes in plasma 17-estradiol, gonadosomatic index, and percentage of oocyte at different developmental stage in the ovary; and(iii) Chapters 4 and 5, in which it was investigated the induction of ovulation and spermiation in Senegalese sole. In chapter 4, males and females were treated with gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRHa). Treatment was able to induce ovulation and spawning of F1 females that often fail to reproduce. However, this treatment was ineffective in males. Further studies were performed in chapter 5, where GnRHa treatment in combination with a biosynthetic precursor of 11-ketotestosterone, stimulated spermatogenesis, increasing the production of conjugated forms of 17,20-dihydroxy-4-pregnen-3-one, enhancing the motility of spermatozoa by 2-fold. In conclusion, the present work has contributed with novel information on the endocrine mechanisms involved in gametogenesis in Senegalese sole, and has established some protocols for the induction of ovulation and spermiation in this species through hormonal therapies.

A stereotyped tubular epithelial network forms many of our bodies’ organs and, defects in the formation of these tubules often leads to organ failure. My Thesis project aims to further understand the mechanisms underling the formation of tubular networks using the tracheal system of Drosophila melanogaster as a model system. Tramtrack (Ttk) is a widely expressed transcription factor (TF) whose function has been analysed in different adult and embryonic tissues in Drosophila. Interestingly, previous work from our lab showed Ttk as a key tracheal regulator. Ttk is involved in a wide range of developmental decisions, ranging from early embryonic patterning to differentiation processes in organogenesis (Araújo et al., 2007). Given the wide spectrum of functions and pleiotropic effects that hinder a comprehensive characterisation, many of the tissue specific functions of this transcription factor are poorly understood. We profiled gene expression experiments after Ttk loss- and gain-of-function in whole embryos and cell populations enriched for tracheal cells in order to identified some of the underlying genetic components that are responsible for the tracheal phenotypes of Ttk mutants. Our transcriptomes analysis revealed widespread changes in gene expression. Interestingly, one of the most prominent gene classes that showed significant opposing responses to loss- and gain-of-function was annotated with functions in chitin metabolism, along with additional genes that are linked to cellular responses, which are impaired in ttk mutants. The expression changes of these genes were validated by quantitative real-time PCR and further functional analysis of these candidate genes and other genes also expected to control tracheal tube size revealed at least a partial explanation of Ttk’s role in tube size regulation (Rotstein et al., 2011). In addition, from all the target genes found in this study, we identified and selected one of them expressed in the tracheal system, CG13188, for further functional analysis. After validating CG13188 differential expression by quantitative PCR, we corroborated and refined CG13188 expression pattern by generating an anti-CG13188 antibody. This protein accumulation analysis recapitulated the predicted CG13188 mRNA expression, but also indicated that CG13188 has a dynamic sub-cellular accumulation during the development of the tracheal system. We have confirmed that CG13188 protein expression levels are, as expected, dependent on the general regulator ttk. Interestingly, we saw that ttk also controls CG13188 protein localization, as in ttk mutant embryos, CG13188 protein did not accumulate apically in the tracheal cells at late embryonic stages, as compared to wild-type. These results suggested on one hand, that CG13188 in order to perform its function might need to be transported from the cytoplasm to the apical membrane of the tracheal cells. On the other hand, the CG13188 protein accumulation differences observed could be just a consequence of CG13188 protein levels between the conditions analysed. We have also observed that CG13188 expression is also controlled by the branch specific regulator spalt. CG13188-RNAi down-regulation in the tracheal system gave tracheal morphogenesis defects during mid and late embryonic stages. In particular, we observed that from embryonic stage 15, CG13188-RNAi embryos can not accumulate chitin into the luminal space of the most dorsal and ventral tracheal branches. These experiments indicated that CG13188 gene is required to form the chitin luminal cable in a branch specific manner. Its down-regulation in the tracheal system produced also physiological maturation phenotypes at late embryonic stages, as CG13188-RNAi embryos did not gas filled completely. Together our results suggested on one hand, the possibility of coexistence of more than one ECM assembly mechanism involved in tracheal tube size control. This novel chitin organisation mechanism might be dependent on branch type. On the other hand, our results might provide a first evidence of a link between chitin cable formation and gas filling tube morphogenesis processes.

Fa aproximadament uns 20 anys del descobriment de la poli(ADP-ribosa), únic homopolímer que s'uneix de manera covalent a les proteïnes cromosòmiques. Des d'aleshores s'han fet detallats estudis de l'estructura, metabolisme, enzimologia, com també de les funcions fisiològiques relacionades amb el polímer. Nombroses evidències suggereixen que la poli(ADP-ribosa) es troba àmpliament distribuïda als eucariotes i està involucrada en la regulació de la proliferació cel·lular, síntesi de proteïnes i metabolisme dels àcids nucleics.Així mateix, també hi ha força dades que indiquen que la mono(ADP-ribosilació) és una manera comuna de modificar covalentment les proteïnes i la seva funció. L'ADP-ribosilació es l'única reacció bioquímica en la qual el NAD, un coenzim respiratori, és utilitzat com a donador de grups ADP-ribosil.La importància dels nucleòtids de piridina NAD i NADP com a coenzims de les reaccions d'oxidació-reducció cel·lulars pot observar-se fàcilment en considerar la utilització d'aquests compostos per les deshidrogenases i reductases que ocupen posicions crítiques de les vies metabòliques. El fet que el NAD sigui el més abundant dels coenzims ha suggerit que la funció d'aquest nucleòtid no es limita a les oxidacions biològiques. L'altre paper important del NAD és servir de substrat per a la modificació de les proteïnes per ADP-ribosilació.

Los discos imaginales de Drosophila melanogaster son los primordios de las estructuras cuticulares del adulto. El disco imaginal dará lugar al ala adulta, constituida por dos capas celulares continuas donde podemos diferenciar tres componentes básicos: las estructuras del margen, las venas y las regiones de intervena. El primer objetivo de esta tesis fue el estudio de una colección de mutantes generados por inserción de un elemento P-lacW en el cromosoma III de Drosophila melanogaster con la finalidad de identificar mutaciones que afectasen a la proliferación, morfogénesis y/o diferenciación de los discos imaginales y estudiar su función. De un total de 2.368 líneas mutantes se estudiaron las líneas letales en larva III/pupa y las líneas semiletales o viables. De entre todas las líneas se seleccionó la línea I(3)112411, constituyendo su estudio monográfico, el segundo objetivo de este trabajo.

La tesi doctoral "Selenoproteïnes i estrès oxidatiu a Drosophila: regulació negativa de la via Ras/MAPK i activació de l'apoptosi" està dividida en els següents apartats: 1. La Introducció tracta la temàtica de les selenoproteïnes i els radicals lliures, i presenta el mutant selD[ptuf] de Drosophila melanogaster com a model d'estudi. Les selenoproteïnes són proteïnes que es caracteritzen per la presencia de Seleni en forma de l'aminoàcid selenocisteïna (Sec). Les selenoproteïnes identificades de les quals es coneix la seva funció actuen com antioxidants protegint les cèl·lules de l'acció nociva dels radicals lliures. Els radicals lliures són la conseqüència del metabolisme aeròbic i per tant es generen constantment. Si bé en determinades situacions els radicals lliures tenen una funció fisiològica, també són nocius per la cèl·lules que han desenvolupat mecanismes de defensa entre els que destaquen les selenoproteïnes. La mutació selD[ptuf] és una mutació nul·la en un element de la ruta de biosíntesi de les selenoproteïnes. Així el mutant selD[ptuf] no té selenoproteïnes i acumula radicals lliures el que el converteix en un model perfecte per a l'estudi dels efectes de l'estrès oxidatiu durant el desenvolupament. 2. Objectius. Els objectius concrets d'aquests tesi doctoral han estat:- estudiar la relació entre les selenoproteïnes i la via de transducció del senyal Ras/MAPK- analitzar quina o quines vies apoptòtiques s'engeguen en resposta a una situació d'estrès oxidatiu- identificar selenoproteïnes concretes que poguessin explicar els fenotips observats3. L'apartat de Resultats està dividit en tres capítols:- Capítol 1: En aquest capítol es mostra com l'increment de radicals lliures causat per la mutació selD[ptuf] regula negativament la via Ras/MAPK (Morey et al., 2001 Dev Biol 238:145-156). També es demostra que el mutant és sensible a situacions d'estrès oxidatiu (Morey et al., 2003 FEBS Lett 534:111-114).- Capítol 2: En aquest capítol es mostra com l'increment de radicals lliures causat per la mutació indueix apoptosi a través de la via Dmp53/Rpr (Morey et al., enviat a J. Cell Sci)- Capítol 3: En aquest capítol es presenta la identificació dues noves selenoproteïnes: dselM i dselG (Castellano et al., 2001 EMBO Rep. 2: 697-702), les quals podrien ser les responsables dels fenotips observats .4. L'apartat de Discussió està dividit en cinc seccions cada una de les quals prosa una funció del gen selD.- La mutació selD[ptuf] genera una situació d'estrès oxidatiu.- Importància de les selenoproteïnes de Drosophila en el control de ROS- L'increment de ROS modula negativament la via Ras/MAPK- L'increment de ROS activa l'apoptosi a través de la via Dmp53/Rpr- Una visió integrada: defectes en proliferació i activació de l'apoptosi en el mutant selD[ptuf]5. Conclusions. D'aquest treball se n'extreuen les següents conclusions:- El gen selD modula la via Ras/MAPK a través de la síntesi de selenoproteïnes i la seva funció antioxidant- L'increment de radicals lliures causat per la mutació selD[ptuf] engega l'apoptosi majoritàriament a través de la via depenent de caspases Dmp53/Rpr.- A part de la selenoproteïna Sps2, Drosophila té dues altres selenoproteïnes: dselG i dselM.

Durant el desenvolupament dels organismes multicel·lulars els fenòmens de transducció de senyals estan íntimament lligats als mecanismes de comunicació cèl·lula-cèl·lula. En el marc d'un teixit epitelial, la formació i manteniment de l'arquitectura cel·lular i dels contactes que estableixen les cèl·lules són processos altament regulats. Una de les vies de senyalització més coneguda, i alhora estudiada, és la via de Ras/Raf/MAPK. L'activació d'aquesta via es dóna per lligands externs a la cèl·lula i s'interpreta per factors de membrana i citosòlics que transduiran el senyal intracel·lular cap al nucli. Aquesta via està altament conservada en tots els organismes eucariotes i s'usa reiteradament durant el desenvolupament en processos tan importants com la diferenciació cel·lular, la proliferació, l'apoptosi o la supervivència cel·lular. Per això, és indispensable entendre com es modula la via de Ras/Raf/MAPK, ja que segons la durada, magnitud i compartimentalització d'aquest senyal es pot donar una resposta cel·lular específica. Per tal d'identificar nous factors implicats en la regulació de la via Ras/Raf/MAPK es va dissenyar un screening genètic a Drosophila utilitzant com a model la determinació del fotoreceptor R7 durant el desenvolupament de l'ull. Per l'especificació d'aquest fotoreceptor es requereix de l'activació de dos receptors tirosina quinasa, Sevenless (Sev) i Epidermal growth factor receptor (Egfr). Una activació constitutiva del receptor Sev es manifesta en un increment en el nombre de fotoreceptors R7 en l'omatidi, i l'ull esdevé rugós. L'screening genètic per guany de funció en aquest fons sensibilitzat es basava en la cerca de factors que suprimissin aquest fenotip d'ull rugós i per extensió, factors que serien reguladors negatius de la via. D'entre els resultats que es van obtenir es va identificar un gen, center divider (cdi), la funció del qual està vinculada a la reorganització del citoesquelet d'actina cortical. Cdi és una serina/treonina quinasa encarregada de fosforilar per inactivar el factor despolimeritzador dels filaments d'actina, la ADF/Cofilina. En la present Tesi Doctoral s'ha estudiat el patró d'expressió i la funció del gen cdi en el desenvolupament de l'ull de Drosophila. Un guany de funció d'aquest gen és capaç de promoure un acúmul d'actina polimeritzada en el grup de cèl·lules de l'omatidi. També s'ha demostrat que tant el guany com la pèrdua de funció de cdi alteren la localització en l'eix apico-basal de factors integrals de les unions adherents i dels receptors i lligands propis de la via de Sev. A banda d'altres estudis fets en Drosophila per caracteritzar la funció de cdi i entendre el mecanisme d'acció en la regulació de la via de Sev, s'ha emprat el model de cèl·lules en cultiu de mamífers per analitzar el paper que té TESK1, l'homòleg de cdi en mamífers, en la regulació de la via Ras/Raf/MAPK. S'ha observat que TESK1 té l'habilitat d'inhibir la diferenciació neuronal de les cèl·lules PC12, i també que aquesta proteïna interacciona i modifica el perfil de l'activació de la MAPK. / "Celular Architecture and Signal Transduction:cdi/TESK1 gene as a modulator of Sevenless"How cellular behaviors such as cell-to-cell communication, epithelial organization and cell shape reorganization are coordinated during development is poorly understood. The developing Drosophila eye offers an ideal model system to study these processes. Localized actin polymerization is required to constrict the apical surface of epithelial cells of the eye imaginal disc to maintain the refined arrangement of the developing ommatidia. The identity of each photoreceptor cell within the epithelium is determined by cell-to-cell contacts involving signal transduction events. The R7 photoreceptor cell requires the activity of the Sevenless RTK to adopt a proper cell fate. We performed an EP screen for negative regulators of this inductive process, and we identified the serine/threonine kinase Center divider (cdi) as a suppressor of the phenotype caused by an activated Sevenless receptor. Cdi is homologous to the human testis-specific kinase 1 (TESK1), a member of the LIM kinases involved in cytoskeleton control through ADF/cofilin phosphorylation. We have analyzed the effects of gain- and loss-of-function of cdi and found alterations in actin organization and in the adherens junctions proteins DE-cadherin and β-catenin, as well as in Sevenless apical localization. Interference with the function of the ADF/cofilin phosphatase Slingshot (ssh), which antagonizes Cdi, also results in a suppression of signaling triggered by the Sevenless RTK. The results of this first chapter of the Thesis reveal a critical interplay between the localization of molecules involved in epithelial organization and signal transduction.In the second chapter of this Thesis we describe the role of the mammalian homolog of cdi, testis-specific kinase 1 (TESK1), in PC12 neuronal cell differentiation and fibroblast proliferation. In addition, we show data indicating that TESK1 interferes with both the magnitude and duration of the ERK activation profile.

Aquesta tesi es centra en la genètica de la migranya. La migranya comuna és un trastorn neurològic caracteritzat per episodis recurrents de mal de cap. Els criteris de la IHS (International Headache Society) subclasifiquen la malaltia en migranya amb aura (MA) i migranya sense aura (MO). L'aura són símptomes neurològics transitoris que poden acompanyar el mal de cap. Les aures més freqüents són les aures visuals, tot i que també existeixen les aures sensorials essent l'aura hemiplègica la seva forma severa. La nostra investigació es va dividir en dues areas d'acord amb la base genètica dels trastorns, d'una banda, s'ha estudiat la genètica complexa de la migranya comuna, d'altra banda s'ha estudiat una forma rara de la migranya que presenta una herència mendeliana anomenada migranya hemiplègica familiar (FHM). Per entendre més la base genètica de la migranya comuna es va utilitzar un estudi d'associació tipus cas-control amb gens candidats. Amb aquesta finalitat es van seleccionar al voltant de 550 pacients amb migranya (MA i MO) i el seu corresponent grup de control. Per tal d'analitzar la seva implicació en la susceptibilitat genètica a la migranya, es van triar gens que codifiquen per als canals de la superfamília heterogeni de potencial receptor transitori (Transient Receptor Potential- TRP) que se sap que estan implicats en les vies nociceptives. Aquesta feina ha donat lloc a una publicació (Carreño et al. SNP variants within the vanilloid TRPV1 and TRPV3 receptor genes are associated with migraine in the Spanish population. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2012). En el cas particular de les formes monogèniques de FHM es coneixen tres gens involucrats en la malatia (CACNA1A, ATP1A2 i SCN1A), les proteïnes codificades per aquests gens tenen un paper rellevant en la neurotransmissió del glutamat. L'anàlisi funcional de les mutacions que causen FHM han mostrat en última instància un augment de l'alliberament de la neurotransmissió. En el cas de mutacions al CACNA1A s'ha vist un efecte de guany de funció, a diferència de les mutacions al ATP1A2 que presenten un efecte de pèrdua de funció. En aquest treball s'ha fet un screening mutacional per identificar mutacions en pacients per seqüenciació directa. Quan les mutacions eren suficientment interessants s'han generat construccions en vectors d'expressió per subseqüents estudis funcionals en cèl·lules eucariotes. Aquesta feina ha donat lloc a tres publicacions. A la primera (Serra et al. A mutation in the first intracellular loop of CACNA1A prevents P/Q channel modulation by SNARE proteins and lowers exocytosis. Proc Natl Acad Sci. 2010) es va identificar un canvi que modula la funció del canal de CACNA1A. Aquest estudi ajuda a explicar la contribució genètica en la heterogeneïtat clínica d'una família i a entendre millor el mecanisme molecular dels canals de calci tipus P/Q. El segon (Carreño et al. Acute striatal necrosis in hemiplegic migraine with the novo CACNA1A mutation. Headache. 2011) és un informe d'un pacient que presenta una necrosi aguda stratial. Té una rellevància clínica a causa de l'aparició primerenca dels símptomes neurològics previs als atacs hemiplègics. El tercer i últim treball (Carreño et al. Screening of the ATP1A2 and CACNA1A genes in patients with hemiplegic migraine: clinical, genetic and functional studies. [work in progress]) recull l'screening mutacional al gens ATP1A2 i CACNA1A en 19 pacients amb FHM. Es van identificar 5 mutacions prèviament descrites i dues mutacions noves. / This Thesis is focused in migraine genetics, migraine is a prevalent neurological disorder characterized by recurrent episodes of headache. This research was divided in two areas according to the genetic basis of the disorders; on the one hand we studied the common migraine with a complex genetics, on the other hand we studied the rare mendelian forms of familial hemiplegic migraine (FHM). To understand more the genetic basis of the common migraine a case-control association study approach was used with candidate genes. For that purpose, around 550 patients with migraine and their corresponding control group were selected. In order to analyze their involvement in the genetic susceptibility to migraine, we chose genes encoding for channels of the heterogeneous superfamily of Transient Receptor Potential (TRP) which are known to be involved in the nociceptive pathway. In the particular case of FHM, a monogenic form of the disorder, there are three genes known to be involved in the FHM (CACNA1A, ATP1A2 and SCN1A), whose encoded proteins are playing a relevant role in the neurotransmission of the glutamate. Functional analysis of the mutations causing FHM have shown ultimately an increased neurotransmission release. CACNA1A previous studies reveled a gain-of-function effect from FHM mutations, unlike mutations on ATP1A2 that present a loss-of-function effect. Our work consisted on identifying mutations in patients by direct sequencing. If the mutations were interesting enough vector constructions were generated for functional studies in eukaryotic cells. This work gave rise to three publications: First; the identification of a change that modulates the function of the CACNA1A channel. This study contributes to explain the genetic contribution in the clinical heterogeneity of one family and to know more about the molecular mechanism of the P/Q calcium channel. Second; a report of a patient that presents an acute stratial necrosis that had clinical relevance because of the early onset of the neurological symptoms previous to the hemiplegic attacks. Third; a mutational screening of ATP1A2 and CACNA1A genes in 19 patients with FHM. 5 previously described mutations and two new mutations were found. Functional studies were carried out for the newly mutations.

Las invasiones biológicas son un tema de especial importancia para los biólogos marinos. Estas invasiones pueden causar daños tanto ecológicos como económicos. El Mar Mediterráneo es uno de los ecosistemas marinos con más biodiversidad de todo el globo. No obstante, es uno de los mares más castigados y contaminados por la gran actividad humana costera y por la explotación de sus recursos. En consecuencia, es una región altamente vulnerable para la introducción de especies de diferentes orígenes. Siguiendo la introducción a una nueva área (dispersión pre-frontera), los procesos post-frontera determinan el éxito en el establecimiento de las especies no indígenas. Sin embargo, se conoce poco sobre cómo estos procesos post-frontera dan forma a la composición genética de las especies no indígenas a escalas regionales. Además, las introducciones recurrentes de especies no indígenas generan interacciones nuevas entre especies residentes que varían con las condiciones locales y la composición de la comunidad receptora. Por otro lado, el estudio de especies invasoras es a menudo confundido por cuestiones taxonómicas y por lo tanto estas especies pueden no ser reconocidas como introducidas en nuevas áreas colonizadas. De entre los organismos marinos invasores, las ascidias se han convertido en un problema global. Puertos, marinas, instalaciones de acuacultura y otras estructuras artificiales suelen ser los hábitats donde son introducidas y proliferan. Concretamente, las ascidias no indígenas son una especial preocupación para la industria de acuacultura y, paradójicamente, el stock de bivalvos representa una importante vía para transportar estas ascidias por todo el mundo. El objetivo principal de esta tesis doctoral es estudiar ciertos aspectos ecológicos y genéticos de la biología de cuatro ascidias invasoras en el Mediterráneo occidental. En el primer capítulo profundizamos en los procesos post-frontera de Microcosmus squamiger estudiando su estructura genética poblacional. Esta ascidia presenta una capacidad relativamente alta de dispersión post-frontera que le permite un flujo genético entre diferentes poblaciones a pequeña escala, además, presenta dos grupos genéticos relacionados con las dos fuentes originarias (Australia) de las poblaciones introducidas mundialmente. Estos acervos genéticos están mezclados a nivel poblacional pero no a nivel de individuo. En el segundo capítulo evaluamos los interacciones biológicas en los primeros estadios del desarrollo de Microcosmus squamiger y Styela plicata entre ellas y con mejillones, otros dominantes en las comunidades bentónicas. Parece que las dos ascidias no presentan interacciones a nivel espermático y tampoco a nivel de asentamiento larvario. En cambio, los mejillones juveniles presentan altos niveles de depredación de las larvas de estas dos ascidias, además de influenciar en su comportamiento larvario. Esto nos demuestra la importancia de la comunidad residente para el establecimiento de especies introducidas. En el tercer capítulo estudiamos el ciclo de vida y la estructura genética poblacional del invasor Didemnum. vexillum. Esta ascidia presenta un ciclo de crecimiento y reproductor claramente estacional, afectado negativamente por las temperaturas cálidas del verano. Además, las poblaciones introducidas en el Mediterráneo muestran una diversidad baja, sugiriendo un proceso de cuello de botella en el proceso de introducción. Finalmente, en el cuarto capítulo estudiamos el ciclo de vida de Clavelina oblonga. Veremos que esta ascidia es una especie introducida en el Mediterráneo desde hace más de 80 años pero que fue erróneamente identificada como C. phlegraea, nativa de la región. Su ciclo reproductor y de crecimiento es marcadamente estacional, favorecido por las temperaturas altas del verano, presentando hibernación en los meses más fríos. / Biological invasions are of special concern to marine biologists. The Mediterranean is one of the most harmed seas by human activities. Among invasive marine organisms, ascidians have become a global problem. The main goal of this PhD thesis is to study ecological and genetic aspects of the biology of four invasive ascidians in the western Mediterranean. In the first chapter, we delve into the post-border processes of the ascidian Microcosmus squamiger studying its population genetic structure. This ascidian has a relatively high capacity of post-border dispersion, which allows gene flow between populations on a small scale. Moreover there are two genetic clusters related to the two original sources of the introduced worldwide populations. These genetic pools are mixed at the population level but not at the individual level. In the second chapter, we evaluate biological interactions in early-life history stages of Microcosmus squamiger and Styelaplicata, among themselves and with mussels. No interactions between the two ascidians were found in fertilization or larval settlement and metamorphosis processes. In contrast, larvae of both ascidians were consumed by the juvenile mussels, and the ascidians also presented shifts in larval behavior in the presence of the mussels. This highlights the importance of the resident community for the establishment of introduced species. In the third chapter, we study the life cycle and population genetic structure of the invasive Didemnum vexillum. The ascidian showed a marked seasonal growth and reproductive cycle, negatively influenced by warm summer temperatures. Additionally, introduced populations in the Mediterranean showed low diversity, suggesting a bottleneck process in the introduction. Finally, in the fourth chapter, we study the life cycle of Clavelina oblonga. This ascidian is in fact an introduced species in the Mediterranean for more than 80 years ago but was erroneously identified as C. phlegraea, native to the region. Their reproductive and growth cycle was markedly seasonal, favored by warm summer temperatures, hibernating in colder months.

One of the most important challenges in marine ecology is understanding the dispersal capabilities of species. Connectivity, if from en evolutionary perspective or a more current ecological perspective, is highly important in determining the natural regulation of populations. By considering both time scales, it is possible to estimate the persistence of a species and its populations. Hence, correct management decisions on conservation issues should include genetic population data combined with oceanographic processes as well as direct measurements of larval dispersal for the full understanding of the population dynamics of species. Therefore, in this thesis I evaluated the population structure, larval dispersal and gene expression in several fish species from the Mediterranean Sea. In this thesis, I approach a variety of ecological and evolutionary challenges from different angles. In chapter 3.1 I analyze the genetic population structure of two different Mediterranean fish species. The first analysis focuses on the conservation of the endangered species Epinephelus marginatus and attempts to give indications on the status of the species as well as population genetic information for the correct design of management strategies. As it becomes clear that oceanographic processes, such as fronts and currents, are important factors in influencing genetic population structure, I proceed with a more multi-disciplinary analysis of the genetic structuring of Serranus cabrilla, a common Mediterranean fish species. The approach includes the comparison of genetic data with oceanographic particle simulations and can give indications on the degree of influence that the physical environment can have on a species genetic distribution. In chapter 3.2 I move from a population approach to the individual level approach. The development, physiology and behavior of an organism determine the life history traits as well as the adaptability to changing conditions. I investigate this by evaluating the differences in gene expression and function for males displaying alternative reproductive tactics as well as females. This is the first genome-wide study for a non-molecular model species in the context of alternative mating strategies and provides essential information on the molecular basis of social dominance. With the production of a de novo transcriptome assembly in chapter 3.2, it can be possible to identify in silico single nucleotide polymorphism markers from this type of data. I start in chapter 3.3 with the development of such markers in Tripterygion delaisi exploring for an optimal protocol allowing future SNP developments in non-model species. This type of genetic markers permits a more time and resource-efficient genotyping for a large amount of samples. Therefore, I used SNPs to explore connectivity patterns by using paternity analysis. The direct evidence of dispersal requires a large amount of individuals, but can provide very important insights and is essential to understanding current connectivity patterns in different marine habitats. This study especially complements the investigations in chapter 3.1 granting a wholesome understanding of population connectivity on evolutionary as well as ecological time scales. / Uno de los retos más importantes en ecología marina es la comprensión de las capacidades de dispersión de las especies. En consecuencia, las decisiones sobre la conservación correcta de nuestros ecosistemas marinos deben incluir datos de genética de poblaciones y procesos oceanográficos, así como medidas directas de la dispersión larvaria para una comprensión más completa sobre la dinámica poblacional de las especies. Por lo tanto, en esta tesis evalúo la estructura poblacional, la dispersión larvaria y expresión génica en varias especies de peces del mar Mediterráneo. El primer análisis se centra en la conservación de la especie amenazada Epinephelus marginatus para dar indicaciones sobre el estado de la especie, así como la información genética de las poblaciones para la gestión adecuada de la especie. Se demuestra que los procesos oceanográficos, como frentes y corrientes, influyen en la estructura genética de las poblaciones, se procede a un análisis más multidisciplinar de la estructuración genética de Serranus cabrilla, una especie común de peces del Mediterráneo. El enfoque incluye la comparación de los datos genéticos con simulaciones de partículas oceanográficos y da indicaciones del grado de influencia que el entorno físico puede tener en una distribución de una especie. En el próximo capítulo investigo la base molecular de las diferencias entre tipos de machos con tácticas reproductivas alternativas mediante la evaluación de las diferencias en la expresión génica. Este es el primer estudio de una especie no-modelo con estrategias de apareamiento alternativas y proporciona información esencial sobre la base molecular de la dominación social. El ultimo capitulo trata con el desarrollo de marcadores SNPs de datos de ultra secuenciación para Tripterygion delaisi explorando un protocolo óptimo que permite el desarrollo de SNPs en especies no -modelos. Finalmente, he usado SNPs para explorar los patrones de conectividad mediante el uso de análisis de paternidad. La evidencia directa de la dispersión requiere una gran cantidad de muestras, pero puede proporcionar información muy importante y es esencial para la comprensión de los patrones de conectividad actuales en diferentes hábitats marinos.