Universiẗat, Diss., 2005--Gießen.

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Heutzutage beeinflusst die Biometrie mehr und mehr unsere Leben. Diese Technologie soll uns Sicherheit und auch Bequemlichkeit erschaffen. Biometrische Systeme ersetzen jeden Tag ältere Sicherheitssysteme und die Firmen versprechen sich mehr Leistung zu bekommen. Aber trotzdem kann man über viele Bereiche der Biometrie sagen, dass sie noch zurückgeblieben sind. In meiner Arbeit analysiere ich den Zustand der ganzen biometrischen Industrie, ich lerne die neuesten Technologien kennen. Die Mängel dieser Industrie sind noch deutlich und es müssen noch viele Innovationen durchgesetzt werden. Ich widme mich meistens der Sicherheit der biometrischen Systeme, konkret orientiere ich mich auf die Fingerabdruckstechnologie. Nach der Analyse der neuesten Angriffe und Sicherheitsvorgänge, werte ich die Technik der Erkennung der feinen Hautbewegungen der Fingerspitzen aus.

Background: Structure-based drug repositioning has emerged as a promising alternative to conventional drug development. Regardless of the many success stories reported over the past years and the novel breakthroughs on the AI-based system AlphaFold for structure prediction, the availability of structural data for protein–drug complexes remains very limited. Whereas the chemical libraries contain millions of drug compounds, the vast majority of them do not have structures to crystallized targets,and it is, therefore, impossible to characterize their binding to targets from a structural view. However, the concept of building blocks offers a novel perspective on the structural problem. A drug compound is considered a complex of small chemical blocks or fragments, which confer the relevant properties to the drug and have a high proportion of functional groups involved in protein binding. Based on this, we propose a novel approach to expand the scope of structure-based repositioning approaches by transferring the structural knowledge from a fragment to a compound level. - Results: We fragmented over 100,000 compounds in the Protein Data Bank (PDB) and characterized the structural binding mode of 153,000 fragments to their crystallized targets. Using the fragment’s data, we were able to artificially reconstruct the binding mode of over 7,800 complexes between ChEMBL compounds and their known targets, for which no structural data is available. We proved that the conserved binding tendency of fragments, when binding to the same targets, highly influences the drug’s binding specificity and carries the key information to reconstruct full drugs binding mode. Furthermore, our approach was able to reconstruct multiple compound-target pairs at optimal thresholds and high similarity to the actual binding mode. - Conclusions: Such reconstructions are of great value and benefit structure-based drug repositioning since they automatically enlarge the technique’s scope and allow exploring the so far ‘unexplored compounds’ from a structural perspective. In general, the transfer of structural information is a promising technique that could be applied to any chemical library, to any compound that has no crystal structure available in PDB, and even to transfer any other feature that may be relevant for the drug discovery process and that due to data limitations is not yet fully available. In that sense, the results of this work document the full potential of structure-based screening even beyond PDB.

Mitochondriopathien sind Multisystemerkrankungen die durch verschiedene Defekte in den Energie (ATP) produzierenden Stoffwechselwegen der Mitochondrien verursacht sind. Will man Mitochondriopathien auf molekularer Ebene diagnostizieren, stößt man auf folgende Schwierigkeiten: (A) Ungefähr 1000 Gene sind an der Biogenese des Mitochondriums beteiligt. Die Dysfunktion jedes einzelnen dieser Gene kann potentiell zur Mitochondriopathie führen. (B) Mitochondriale Proteine werden durch zwei Genome, durch die mitochondriale und durch die nukleäre DNA kodiert. (C) Die klinischen Symptome der Patienten weisen selten auf die molekulare Diagnose, da der Phänotyp oft nur auf einem sekundären Energiemangel beruht. In der Regel besteht keine sichere Genotyp-Phänotyp-Relation. Mit den gegenwärtig zur Verfügung stehenden Methoden lassen sich bei nur 20% der Patienten Mutationen finden. Wir wollten daher eine neue Screening-Methode entwickeln, mit deren Hilfe wir hoffen, die Aufspürungsrate für mitochondriale Mutationen zu erhöhen. Die Gesamtheit der Proteine einer Organelle oder einer ganzen Zelle (ihr "Proteom") stellt das Verbindungsglied zwischen Geno- und Phänotyp dar. Aus diesem Grunde wollten wir das mitochondriale Proteom von gesunden Kontrollpersonen und von Patienten mit Mitochondriopathien untersuchen. Protein-Muster, die zwischen diesen beiden Gruppen abweichen, könnten die Aufmerksamkeit auf Gene und Proteine richten, die an der Entstehung des Krankheits-Phänotyps beteiligt sind. Um solch eine vergleichende Studie durchzuführen, muß zunächst eine Referenzkarte des normalen mitochondrialen Proteoms erstellt werden. In meinem Dissertationsprojekt habe ich diese grundlegende Arbeit durchgeführt und zahlreiche Proteine auf der Proteomkarte menschlicher Mitochondrien identifiziert, die aus Epstein-Barr-Virus-transformierten lymphoblastoiden Zellen gewonnen worden waren. Ich wählte diese Zellsorte als Untersuchungsmaterial, da sie nicht nur einfach von Patienten gewonnen werden, sondern auch potentiell permanent wachsen kann. Dies erlaubt die Züchtung einer hohen Zellzahl ohne übermäßigen Aufwand. Ich optimierte ein Protokoll zur Zentrifugation in einem hybriden Gradienten, mit dem genug gereinigte Mitochondrien aus 108 Zellen gewonnen werden konnten. Für die Referenzkarte benutzte ich die lymphoblastoide Zellline einer gesunden Kontrollperson. Die Methode der Wahl zur Proteinidentifikation in Proteom-Projekten ist die zweidimensionale Proteinelektrophorese gekoppelt mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Ich entdeckte mehr als 400 Punkte in meinem silbergefärbten zweidimensionalen Gel und analysierte die 141 stärksten Punkte nach in-gel Trypsin-Verdau und anschließender MALDI-TOF-Massenspektrometrie in einem Verfahren, das als "Peptide Mass Fingerprinting" (Peptidmassen-Fingerabdruck) bezeichnet wird. Mit Hilfe entsprechender Datenbanken konnte ich schließlich 115 verschiedene Proteinpunkte (entsprechen 95 verschiedenen Proteinen) identifizieren. 90 dieser Punkte (entsprechend 74 verschiedenen Proteinen) waren sicher mitochondrialer Herkunft und sind Komponenten aller wesentlichen im Mitochondrium lokalisierten Stoffwechselwege. 16 der 74 identifizierten mitochondrialen Proteine gehören zur Atmungskette. Obwohl 18 mitochondriale Proteine in der Datenbank SWISS-PROT als "Membran-assoziiert" annotiert sind, identifizierte ich nur vier Proteine mit sicheren Transmembrandomänen. Ich entdeckte keine der 13 durch die mitochondriale DNA kodierten Proteine, die alle stark hydrophobe Membranproteine sind. Andere Forscher sind bei dem Versuch diese Proteine zu identifizieren, auf die gleichen Schwierigkeiten gestoßen. Mit meiner Dissertationsarbeit habe ich unsere eigene Datenbank und Referenzkarte des mitochondrialen Proteoms lyphoblastoider Zellen erstellt. Diese Daten ermöglichen nun die Analyse des mitochondrialen Proteoms von Patienten. Meine weiteren Untersuchungen auf diesem Gebiet werden sich nun auf die genetische Variabilität des Proteoms gesunder Kontrollpersonen und auf das Proteom der Patienten mit Mitochondriopathien beziehen. / Mitochondrial disorders are multisystem diseases that can be caused by any defect in the energy (ATP) generating pathways in the mitochondria. The difficulty in diagnosing mitochondrial diseases on the molecular level arises from several obstacles: (A) About 1000 genes are involved in the biogenesis of mitochondria. The dysfunction of each of them may potentially cause mitochondriopathy. (B) The mitochondrial proteins are encoded by two genomes: the mitochondrial DNA and the nuclear DNA. (C) The clinical symptoms of the patients rarely suggest a molecular diagnosis since in most cases, the phenotype is a secondary phenomenon to energy depletion. Generally there is no genotype-phenotype relation. Based on current diagnostic methods in only 20% of the patients a mutation can be found. We therefore wanted to develop a new screening method by which we hope to increase the identification rate. Since the numerous proteins of an organelle or of a whole cell (its "proteome") connect the genotype with the phenotype, we set out to study the proteome of the mitochondrion in healthy individuals and in patients with mitochondrial diseases. Deviating protein patterns between the two individuals could direct the attention to disease-specific proteins and genes, which might be involved in the expression of a disease-phenotype. In order to perform such a comparison I first had to establish a normal reference map. In my dissertation project I performed this basic task and identified numerous mitochondrial proteins on the proteome-map of human mitochondria, which had been extracted from lymphoblastoid cells. I selected Epstein-Barr-Virus-transformed lymphoblastoid cells as samples not only because they are easily obtained from patients, but also due to their potential permanent growth. This approach allows the cultivation of high cell numbers without excessive expenditure of work and cost. I optimized a protocol for hybrid gradient centrifugation, by which enough mitochondria can be purified from 108 cells. I used a cultured lymphoblastoid cell line from a normal control patient and isolated mitochondria from it by using hybrid gradient centrifugation. In proteomics the combination of the high-resolution two-dimensional electrophoresis and matrix assisted laser desorption/ionization-time-of-flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) is currently the method of choice for protein identification. I detected more than 400 spots in a silver-stained two-dimensional gel. I analyzed the 141 strongest spots of it by trypsin in gel digestion and subsequent MALDI-TOF mass spectrometry in a process termed "peptide mass fingerprinting". After database search, I finally identified 115 protein spots (corresponding to 95 different proteins), 90 of which (corresponding to 74 different proteins) are of confirmed mitochondrial origin. These identified proteins are components of the main biological pathways located in the mitochondrion. 16 of the 74 identified mitochondrial proteins belong to the respiratory chain. Despite the fact that 18 mitochondrial proteins are annotated in the SWISS-PROT-database as "membrane associated proteins", only four of them have clear transmembrane domains. None of the proteins encoded by the mitochondrial DNA could be detected. All of them are hydrophobic membrane proteins. A similar difficulty in resolving these proteins was encountered by other research groups. With my dissertation I established our own database and reference map of the mitochondrial proteome of lymphoblastoid cells. These data will facilitate the analysis of the mitochondrial proteome in patients. My future research based on this dissertation will mainly focus on the genetic variation of the proteome of healthy individuals and on patients with mitochondrial diseases.

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Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung von Mikroalgen-Kulturstämmen unterhalb des Artniveaus. Für Service-Kulturensammlungen sind diese Untersuchungen wichtig, um die genetische Diversität der vorhandenen bzw. neu aufzunehmender Kulturen zu erfassen, Stämme eindeutig zu identifizieren oder auch Kontaminationen auszuschließen. Zu diesem Zweck wurden häufig in der Forschung genutzte Stämme von Mikroalgen mithilfe von genetischen Fingerabdrücken, die mit der AFLP (amplified fragment length polymorphism) Technik generiert wurden, untersucht. Mittels AFLP was es möglich, verschiedene Stämme derselben Art (Chlorella vulgaris) zu unterscheiden und für jedes Isolat einen charakteristischen genetischen Fingerabdruck zu erhalten. Da diese genomischen Variationen innerhalb derselben Art auch mit Unterschieden in physiologischen/biochemischen Eigenschaften korreliert sein können, ist es wichtig genau festzuhalten, welches Isolat für einen Versuch oder eine biotechnologische Anwendung verwendet wurde. Mit der AFLP-Technik war es ferner möglich, phänotypisch unterschiedliche Mutanten von Parachlorella kessleri und den entsprechenden Wildtyp zu unterscheiden. Normalerweise ist es mit AFLP nicht möglich, Algenkulturen zu untersuchen, die mit anderen Organismen kontaminiert sind. Das Problem hierbei ist, dass bei den generierten Fragmenten nicht unterschieden werden kann, ob sie von der Alge stammen oder von der Kontamination. Es konnte hier jedoch gezeigt werden, dass kontaminierte Kulturen trotzdem mit AFLP untersucht werden können. Hierzu war es nötig, Kulturen mit unterschiedlichem Verhältnis von Algen- und Bakterienzellen zu untersuchen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Infektionen von Algenkulturen mit Viren, die meistens schwer nachzuweisen sind, mittels AFLP festgestellt werden können. Kryokonservierung ist mittlerweile die Methode der Wahl zur Langzeitaufbewahrung von Mikroalgen. Es wird davon ausgegangen, dass diese Aufbewahrungsmethode genetisch stabile Kulturen über Jahrzehnte hinweg garantieren kann. Jedoch wurde bis heute die genetische Stabilität von kryokonservierten Algen noch nicht überprüft und deshalb in der vorliegenden Arbeit mithilfe der AFLP-Technik untersucht.