Abstract Most proteins carry out their functions through interactions with other molecules. Thus, proteins taking part in similar interactions are likely to carry out related functions. One way to determine whether two proteins do take part in similar interactions is by quantifying the likeness of their structures. This work focuses on the development of methods for the comparison of protein-protein and protein-ligand interactions, as well as their application to structure-based classification schemes. A method based on the MultiMer-align (or MM-align) program was developed and used to compare all known dimeric protein complexes. The results of the comparison demonstrates that the method improves over MM-align in a significant number of cases. The data was employed to classify the complexes, resulting in 1,761 different protein-protein interaction types. Through a statistical model, the number of existing protein-protein interaction types in nature was estimated at around 4,000. The model allowed the establishment of a relationship between the number of quaternary families (sequence-based groups of protein-protein complexes) and quaternary folds (structure-based groups). The interactions between proteins and small organic ligands were studied using sequence-independent methodologies. A new method was introduced to test three similarity metrics. The best of these metrics was subsequently employed, together with five other existing methodologies, to conduct an all-to-all comparison of all the known protein-FAD (Flavin-Adenine Dinucleotide) complexes. The results demonstrates that the new methodology captures the best the similarities between complexes in terms of protein-ligand contacts. Based on the all-to-all comparison, the protein-FAD complexes were subsequently separated into 237 groups. In the majority of cases, the classification divided the complexes according to their annotated function. Using a graph-based description of the FAD-binding sites, each group could be further characterized and uniquely described. The study demonstrates that the newly developed methods are superior to the existing ones. The results indicate that both the known protein-protein and the protein-FAD interactions can be classified into a reduced number of types and that in general terms these classifications are consistent with the proteins' functions. / Tiivistelmä Suurin osa proteiinien toiminnasta tapahtuu vuorovaikutuksessa muiden molekyylien kanssa. Proteiinit, jotka osallistuvat samanlaisiin vuorovaikutuksiin todennäköisesti toimivat samalla tavalla. Kahden proteiinin todennäköisyys esiintyä samanlaisissa vuorovaikutustilanteissa voidaan määrittää tutkimalla niiden rakenteellista samankaltaisuutta. Tämä väitöskirjatyö käsittelee proteiini-proteiini- ja proteiini-ligandi -vuorovaikutusten vertailuun käytettyjen menetelmien kehitystä, ja niiden soveltamista rakenteeseen perustuvissa luokittelujärjestelmissä. Tunnettuja dimeerisiä proteiinikomplekseja tutkittiin uudella MultiMer-align-ohjelmaan (MM-align) perustuvalla menetelmällä. Vertailun tulokset osoittavat, että uusi menetelmä suoriutui MM-alignia paremmin merkittävässä osassa tapauksista. Tuloksia käytettiin myös kompleksien luokitteluun, jonka tuloksena oli 1761 erilaista proteiinien välistä vuorovaikutustyyppiä. Luonnossa esiintyvien proteiinien välisten vuorovaikutusten määrän arvioitiin tilastollisen mallin avulla olevan noin 4000. Tilastollisen mallin avulla saatiin vertailtua sekä sekvenssin (”quaternary families”) sekä rakenteen (”quaternary folds”) mukaan ryhmiteltyjen proteiinikompleksien määriä. Proteiinien ja pienien orgaanisten ligandien välisiä vuorovaikutuksia tutkittiin sekvenssistä riippumattomilla menetelmillä. Uudella menetelmällä testattiin kolmea eri samankaltaisuutta mittaavaa metriikkaa. Näistä parasta käytettiin viiden muun tunnetun menetelmän kanssa vertailemaan kaikkia tunnettuja proteiini-FAD (Flavin-Adenine-Dinucleotide, flaviiniadeniinidinukleotidi) -komplekseja. Proteiini-ligandikontaktien osalta uusi menetelmä kuvasi kompleksien samankaltaisuutta muita menetelmiä paremmin. Vertailun tuloksia hyödyntäen proteiini-FAD-kompleksit luokiteltiin edelleen 237 ryhmään. Suurimmassa osassa tapauksista luokittelujärjestelmä oli onnistunut jakamaan kompleksit ryhmiin niiden toiminnallisuuden mukaisesti. Ryhmät voitiin määritellä yksikäsitteisesti kuvaamalla FAD:n sitoutumispaikka graafisesti. Väitöskirjatyö osoittaa, että siinä kehitetyt menetelmät ovat parempia kuin aikaisemmin käytetyt menetelmät. Tulokset osoittavat, että sekä proteiinien väliset että proteiini-FAD -vuorovaikutukset voidaan luokitella rajattuun määrään vuorovaikutustyyppejä ja yleisesti luokittelu on yhtenevä proteiinien toiminnan suhteen.

Les travaux de cette thèse ont porté sur le développement de deux méthodes de modélisation des enzymes contenant des groupes prosthétiques de la famille des flavines.La première méthode, PredFace, permet de prédire la stéréochimie des produits d'une réaction catalysée par des enzymes contenant des groupes prosthétiques, en identifiant la face libre d'interaction avec les substrats. Le protocole mis en place pour cette méthode implique l'utilisation de huit complexes "sondes", obtenus par des opérations de symétrie à partir de l'état de transition de la réaction de transfert d'un atome d'hydrogène entre le nicotinamide et la lumiflavine. Ces complexes sont positionnés dans le site actif avec le groupe prosthétique comme référence et dans chaque cas l'énergie d'interaction protéine-ligand est évaluée par la fonction de score implémentée dans le logiciel de docking utilisé (AutoDock). L'énergie d'interaction la plus favorable permet d'identifier la face du groupe prosthétique accessible pour la réaction enzymatique dans le site actif. La méthode PredFace a été validée par l'analyse de l'ensemble des structures de la Protein Data Bank contenant des groupes prosthétiques de la famille des flavines (2170). Le protocole mis au point est très rapide (moins d'une minute), ce qui nous a permis de développer un site web afin de mettre cette méthode à la disposition de la communauté.La seconde méthode, ProsthDock, est une nouvelle méthode de docking basée sur le mécanisme d'une réaction enzymatique catalysée par un groupe prosthétique et guidée par la présence de ce groupe prosthétique dans le site actif de l'enzyme. Le développement de cette méthode a été motivé par le fait que les méthodes actuelles de docking, en présence de groupes prosthétiques, se révèlent incapables de produire des poses correctes pour des substrats, en accord avec les réactions enzymatiques. Afin de remédier à ce problème nous avons ajouté à la fonction de score classique un terme supplémentaire, qui rendra compte de l'interaction du ligand avec le groupe prosthétique. Dans un premier temps, nous avons construit un modèle simplifié du complexe NADH/FMN et calculé l'état de transition de la réaction de transfert d'hydrogène entre les deux partenaires. Des surfaces d'énergie potentielle pour cette réaction ont été calculées en variant la distance, l'angle et l'angle dièdre entre les deux réactifs. Un docking sous contrainte est ensuite réalisé et en fonction du positionnement de chaque pose de docking dans le site actif le terme supplémentaire de la fonction de score est calculé à partir des surfaces d'énergie potentielle, ce qui nous permet de modifier le classement des résultats de docking en favorisant les poses qui sont en accord avec la réaction enzymatique. / During this PhD thesis we developped two new molecular modeling methods applied to enzymes containing flavin-type prosthetic groups.The first method, PredFace, predicts the stereochemistry of products from a reaction catalyzed by enzymes containing prosthetic groups, by automatically identifying the solvent-exposed face of the prosthetic group. The protocol involves the use of eigth complexes as "probes", obtained by symmetry operations starting from the transition state of a hydrogen atom transfer reaction between nicotinamide and lumiflavin. These complexes are positioned in the binding site with the prosthetic group as reference and the energy of the protein-ligand interaction is evaluated by the scoring function implemented in the docking software (AutoDock). The most favorable interaction energy allows the identification of the prosthetic group face that is available for the enzymatic reaction in the binding site. The PredFace method has been validated by analyzing all the structures in the Protein Data Bank containing flavin-derived prosthetic groups (2170). This method is very fast (less than a minute), which allowed us to develop a web site open to the scientific community.The second method, ProsthDock, is a new mechanism-based molecular docking method guided by prosthetic groups present in the active sites of enzymes. The development of this method was motivated by the incapacity of the currently available docking methods to provide, in the presence of prosthetic groups, ligand conformations that are compatible with the enzymatic reactions. In this regard, we have added a new term to the classical scoring function, to take into account the interaction between ligand and prosthetic group. We have built a simplified model of the NADH/FMN complex and calculated the transition state of the hydrogen transfer reaction between the two partners. Potential energy surfaces have been calculated for this reaction by variating the angle, diedral angle and distance between the two reaction partners. A subsequent docking with constraints provides binding site conformations of the ligand for which the new term of the scoring function is calculated using the potential energy surfaces. This results in a new ranking of the docking poses, favoring those in agreement with the enzymatic reaction.

Die NAD+-reduzierende Hydrogenase aus Ralstonia eutropha (SH) katalysiert die reversible H2-Oxidation in Verbindung mit der Reduktion von NAD+ in Gegenwart von Sauerstoff. Die bemerkenswerte O2-Toleranz des Enzyms wurde zuvor auf eine für [NiFe]-Hydrogenasen ungewöhnliche Struktur des Wasserstoff-spaltenden Zentrums zurückgeführt. Diese Hypothese wurde in dieser Arbeit mittels in situ-Spektroskopie an SH-haltigen Zellen widerlegt. Um die folgende Untersuchung der aus sechs Untereinheiten und mindestens acht Kofaktoren bestehenden SH zu erleichtern, wurde das Enzym mittels genetischer Methoden in seine beiden Module aufgeteilt. Das die H2-Oxidation katalysierende Hydrogenase-Modul beinhaltete ein FMN-Molekül, welches für die reduktive Reaktivierung des oxidativ modifizierten Zentrums benötigt wird. Das Diaphorase-Modul besaß ebenfalls ein FMN, und die Reduktion von NAD+ wurde von der Anwesenheit von O2 nicht beeinträchtigt. Neben Wasserstoff reagierte das [NiFe]-Zentrum der SH auch mit Sauerstoff. Dabei wurde sowohl Wasserstoffperoxid- als auch Wasser im Hydrogenase-Modul freigesetzt. Die Sauerstofftoleranz der SH basiert auf einer kontinuierlichen Reaktivierung des durch Sauerstoff oxidierten [NiFe]-Zentrums. Aufgrund der außergewöhnlichen Sauerstofftoleranz stellt die SH ein vielversprechendes System für die wasserstoffgetriebene Regeneration von NADH in gekoppelten enzymatischen Reaktionen dar. In dieser Arbeit wurde ein SH-Derivat durch rationale Mutagenese konstruiert, das in der Lage war, ebenso den Kofaktor NADP+ wasserstoffabhängig zu reduzieren. Durch Ganzzellansätze kann die zeitaufwändige und kostenintensive Proteinreinigung vermieden werden. Um die wasserstoffabhängige in-vivo-Kofaktorregeneration zu ermöglichen, wurde die SH in Pseudomonas putida heterolog produziert. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse sind sowohl für das molekulare Verständnis der H2-abhängigen Katalyse als auch für die biotechnologische Anwendung der O2-toleranten SH relevant. / The NAD+ reducing hydrogenase from Ralstonia eutropha (SH) catalyzes the reversible oxidation of hydrogen in connection with the reduction of NAD+ in the presence of oxygen. The remarkable oxygen tolerance was previously related to an unusual [NiFe] active site with four instead of two cyanide ligands. This hypothesis was rejected in this study by using in situ spectroscopy on SH containing cells. To simplify the investigation of the six-subunit and at least eight cofactors containing SH, the enzyme was separated into its two modules by genetic methods. The hydrogen oxidizing hydrogenase module contained one FMN molecule, which was required for the reductive reactivation of the oxidatively modified active site. The diaphorase module carried a second FMN. The reduction of NAD+ was not affected by the presence of oxygen. In addition to hydrogen, the [NiFe] center of the SH reacted with oxygen. Both hydrogen peroxide and water were released by the hydrogenase module. The oxygen tolerance of the SH is based on a continuous reactivation of the oxidized [NiFe] center. Due to the oxygen tolerance, the SH is a promising system for hydrogen based NADH regeneration in coupled enzymatic reactions. In this study a SH derivative was constructed by means of rational mutagenesis. The SH derivative was able to reduce the cofactor NADP+ by hydrogen oxidation. The time consuming and costly protein purification can be avoided by using whole cell approaches. In order to allow the hydrogen dependent in vivo cofactor regeneration, SH was heterologously produced in Pseudomonas putida. The results obtained in this study are relevant for the molecular understanding of hydrogen dependent catalysis and for the biotechnological application of the oxygen tolerant SH.