Realizou-se revisão bibliográfica sobre a utilização do teste imunoenzimático, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) na Vigilância Epidemiológica de infecções causadas por arbovírus da Família Flaviviridae, gênero Flavivirus e da Família Togaviridae, gênero Alphavirus. Foram consultados trabalhos publicados a partir de 1979, ano da introdução do teste em pesquisas de arboviroses. Observou-se que o teste tem sido empregado na pesquisa de anticorpos em humanos, de anticorpos e antígenos em reservatórios não humanos e na identificação de antígenos e da fonte alimentar de mosquitos vetores. Analisou-se o desempenho de ELISA comparando-o a técnicas tradicionalmente empregadas para identificação de anticorpos e antígenos de arbovírus. O teste apresentou 100,0 por cento de sensibilidade e especificidade média de 84,5 por cento na identificação de anticorpos anti-Alphayirus em humanos. A técnica também foi muito sensível para Flavivirus, com valor médio de 95,2 por cento e apresentou especificidade média de 77,6 por cento. Na identificação de anticorpos anti-arbovírus em resevatórios não humanos, ELISA mostrou sensibilidade de 100,0 por cento e especificidade de 97,4 por cento. Na pesquisa de antígenos vir ais em mosquitos vetores a técnica apresentou especificidade média de 93,6 por cento e sensibilidade média de 76,5 por cento. A técnica apresentou alto valor preditivo positivo, o que foi observado quando calculou-se a média dos valores apresentados em cada um dos trabalhos em que esse parâmetro foi pesquisado e obteve-se um resultado de 89,0 por cento. Nos trabalhos em que foi estudada a reprodutibilidade do teste observou-se coeficiente de variação de 3,0 a 14,0 por cento nos resultados. Observou-se grande diversidade quanto aos critérios de positividade adotados, impossibilitando a comparação dos resultados. Notou-se uma tendência a encurtar o tempo de realização do teste e torná-lo factível em condições de trabalho de campo. Verificou-se que o teste já está incorporado à rotina da Vigilância Epidemiológica de algumas arboviroses como encefalite Japonesa nos países asiáticos e encefalites do Leste, Oeste e de St.Louis, nos Estados Unidos da América. Os autores estudados foram unânimes em concluir que trata-se de teste rápido, apresenta simplicidade dos procedimentos técnicos e permite diagnóstico presuntivo de infecção aguda com apenas uma amostra de soro, características que o capacitam para uso na Vigilância Epidemiológica de arboviroses. / The author makes a review of the use of enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA, in the surveillance of infections caused by arbovirus belonging to the Flaviviridae family (genus Flavivirus) and to the Togaviridae family (genus Alphavirus). Publications dating since 1979, when the use of ELISA in arbovirus research began, were consulted. It was noted that this assay was used for antibody identification on not human reservoirs, and for antigen and blood meal identification on mosquito vectors. ELISA\'s perfomance was compared to standard tests used for laboratorial diagnosis of arboviruses. The test presented 100.0 per cent sensitivity and an average specificity of 84.5 per cent in Alphavirus antibody identification in humans; and was also sensitive for Flavivirus with average values of 95.2 per cent and specificity average values of 77.6 per cent. ELISA furthermore showed 100.0 per cent sensitivity and 97.4 per cent specificity for antibody identification in not human reservoirs. For the antigen identification in mosquito vectors, the assay presented an average specificity of 93.6 per cent and an average sensitivity of 76.5 per cent. The immunoassay presented high predictive values (average of 89.0 per cent) and it was reproducible when this characteristic was studied with a coefficient variation index ranging from 3.0 to 14.0 per cent There was a great variety in the positivity criteria, making the comparison of results difficult. An attempt to process the test in the shortest time and in field conditions is noted in many publications. The assay is used routinely on surveillance of Japanese encephalitis in Asian countries and in eastern and western equine encephalitis and St.Louis encephalitis in the USA. ELISA was considered a rapid assay with sirnple procedures when it is cornpared to tradicional tests and provides presuntive diagnosis of an acute infection with a single serurn sarnple. These characteristics suggest that the test is a useful tool for arbovirus surveillance.

A Febre Amarela (FA) é uma doença viral infecciosa, não contagiosa que pode se manifestar desde um quadro febril até a forma clássica íctero-hemorrágica, cujo agente etiológico é o vírus da febre amarela (VFA). A doença tem avançando para as regiões Sudeste e Sul com um aumento de 4 vezes no número de vítimas fatais. O presente trabalho teve como objetivos avaliar a possível circulação do vírus da febre amarela silvestre, através da detecção de anticorpos IgM por meio da técnica de MAC-ELISA, e anticorpos IgG, pelas técnicas de Inibição da hemaglutinação e Neutralização; detecção do genoma viral utilizando a técnica de RT-PCR no soro de indivíduos assintomáticos; bem como avaliar a proteção vacinal, por meio da técnica de neutralização em soros de indivíduos das zonas rurais do município de Jacupiranga e Teodoro Sampaio. Um total de 238 soros foram coletados, 152 (Jacupiranga) e 86 (Teodoro Sampaio). Foram detectados um total 15,9% (38/238) de anticorpos IH contra o vírus selvagem e/ou vacinal. Destes 13,16% (5/38) anticorpos IH foram provenientes dos soros de Jacupiranga e 86,84 (33/38) de Teodoro Sampaio. Anticorpos neutralizantes foram detectados em 34% (13N/38IH) dos IH reativos, destes 15,38% (2/13) foram oriundos deJacupiranga e 84,62% (11/13). A detecçção de anticorpos neutralizantes nos indivíduos de Jacupiranga levantam a necessidade de pesquisas futuras na busca do vírus da febre amarela nos seus reservatórios selvagens e vetores. Não houve a detecção do genoma viral por RTPCR nas duas populações, bem como a detecção de anticorpos IgM específicos, por meio das reações de MACELISA, o que evidencia a não circulação recente deste vírus na população estudada. O grau de imunizaçao na população de Teodoro Sampaio, com histórico de vacinação, por meio das reações de IH e Neutralização foi baixo, uma vez que somente 42,30% da população apresentou anticorpos inibidores da hemaglutinação e o grau de proteção pela reação de neutralização foi de apenas 33,33%. Este trabalho aponta não só para a necessidade de monitoramento pós-vacinal em áreas endêmicas de febre amarela, com indicação de vacinação, como também a necessidade de estudos epidemiológicos, uma vez que se detectou reação monotípica no teste do IH, além de anticorpos neutralizantes para o vírus selvagem da febre amarela em um indivíduo residente em município de risco para a febre amarela. / Yellow fever (YF) is an non-contagious infection disease. The clinical signs can be a nonspecific fever or the classical ictero-hemorrhagic form as a result of the Yellow Fever virus (YFV) infection. Considering the recent spread of the disease to the South and Southeast of Brazilian regions and the increased number of fatal cases, the aim of this study was to evaluate the possible circulation of the YFV, using the IgM enzyme-linked immnunosorbent assay (MACELISA) and Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), as well as, to conduct a serological inquire and evaluate the protective vaccine response, by the hemagglutination inhibition test (HI) and serum neutralization test (SN), in the rural population of Jacupiranga and Teodoro Sampaio, located in the southern region of Brazil. A total of 238 serum samples were tested, 152 from Jacupirang and 86 from Teodoro Sampaio. Of the serum collected, 15,9% (38/238) were positive by HI, using wild and vaccine strains of YF, and out of these 13,16% (5/38) were from Jacupiranga and 86,84% (33/38) were from Teodoro Sampaio. Neutralizing antibodies were detected in 34% of the HI positive samples (13SN/38HI) and out of these 15,38% (2/13) were from Jacupiranga and 84,62% (11/13) were from Teodoro Sampaio. None of the samples were positive by MACELISA and RT-PCR indicating no evidences of recent virus circulation in the population analyzed in this study. However, the YF neutralizing antibodies detection in samples from Jacupiranga indicates the necessity of further researches in order to detect the YFV in its wild reservoirs and vectors. On the other hand, considering that 42,30% of the Teodoro Sampaio samples were positive by HI and out of these only 33,33% had neutralizing antibodies to the YFV, our results also pointed out to the importance of pos-vaccination protective immunity surveys, in order to evaluate the efficiency of the vaccines in endemic areas.

Orientador: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Marilia de Freitas Calmon / Banca: Aripuanã Sakurada Aranha Watanabe / Resumo: No Brasil, a presença de ecossistemas com uma grande riqueza e diversidade de animais e cidades grandes e densamente povoadas oferece condições para a ocorrência de diversas arboviroses. Vários arbovírus transmitidos por mosquitos do gênero Culex pertencem ao gênero Flavivirus. Vírus desse gênero são conhecidos por causar doenças em humanos e animais, no entanto, flavivírus que não infectam ou causam doença em vertebrados, replicando somente em artrópodes têm sido descritos. O vírus Culex flavivirus é um exemplo. Ele foi isolado de espécies de mosquitos do gênero Culex na América do Norte, América Central, América do Sul, África e Ásia. Apesar dos estudos realizados em outras partes do mundo, no Brasil há ainda pouca informação sobre esse vírus. Nesse trabalho, realizamos o seqüenciamento do genoma completo do vírus Culex flavivirus (CxFV) isolado de mosquitos Culex de São José do Rio Preto (SP), por meio das técnicas de RT-PCR e seqüenciamento nucleotídico. O genoma viral do isolado CxFV_RPBR07_2007, o qual foi obtido no presente estudo apresentou 10.706 nucleotídeos com uma ORF de 10.092 nucleotídeos (3.364 aminoácidos) flanqueada por uma 5'UTR de 32 nucleotídeos e uma 3'UTR de 582 nucleotídeos. Análises filogenéticas revelaram que o CxFV_RPBR07_2007 agrupa-se com outros flavivírus de insetos, como o Cell fusing agent virus (CFAV) e o Kamiti River virus (KRV), e relaciona-se intimamente com isolados de CxFV do México (América Latina) e de Uganda (África); mantendo relação também com isolados dos Estados Unidos (América do Norte) e do Japão (Ásia). Esses agrupamentos foram também observados em outros estudos filogenéticos / Abstract: In Brazil, the presence of ecosystems with a wealth and diversity of animals, and cities large and densely populated offers conditions for the occurrence of many arboviruses. Several arboviruses transmitted by mosquitoes of the genus Culex belong to the genus Flavivirus. Viruses of this genus are known to cause disease in humans and animals, however, flaviviruses do not infect or cause disease in vertebrates, replicating only in arthropods have been described. Culex flavivirus virus is an example. He was isolated from species of mosquitoes of the genus Culex in North America, Central America, South America, Africa and Asia. Although studies conducted in other parts of the world, in Brazil there is still little information about this virus. In this work we performed the sequencing of the complete genome of Culex flavivirus virus (CxFV) isolated from Culex mosquitoes in São José do Rio Preto (SP) using the techniques of RT-PCR and nucleotide sequencing. The viral genome of the isolated (CxFV_RPBR07_2007) obtained in the present study presented 10.706 nucleotides with an ORF of 10.092 nucleotides (3.364 amino acids) flanked by a 5'UTR of 32 nucleotides and a 3'UTR of 582 nucleotides. Phylogenetic analyzes revealed that the CxFV_RPBR07_2007 groups with other insect flaviviruses such as the Cell fusing agent virus (CFAV) and Kamiti River virus (KRV), and is closely related to CxFV isolates from Mexico (Latin America) and Uganda (Africa); also maintaining relationship with isolates from the United States of America (North America) and Japan (Asia). These groupings were also observed in other phylogenetic studies / Mestre

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-01-26T14:06:49Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ReplicacaoViralPadrao.pdf: 2703656 bytes, checksum: ccbaf5da11f1dbae865d35717cc46fc9 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-01-27T13:37:12Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ReplicacaoViralPadrao.pdf: 2703656 bytes, checksum: ccbaf5da11f1dbae865d35717cc46fc9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-27T13:37:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ReplicacaoViralPadrao.pdf: 2703656 bytes, checksum: ccbaf5da11f1dbae865d35717cc46fc9 (MD5) Previous issue date: 2015-07-13 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os arbovírus pertencentes ao gênero Flavivirus (Família Flaviviridae) são responsáveis por considerável morbi-mortalidade, podendo causar quadros graves de encefalite, febre hemorrágica, hepatite e doença febril em vertebrados, incluindo humanos. O flavivírus Rocio (VROC) é de grande importância para a saúde pública no Brasil, pois representa uma grave ameaça de ocorrência de súbitos surtos de encefalite. A imunopatologia das encefalites causadas por flavivírus ainda não está completamente esclarecida e muitos aspectos inerentes à modulação das respostas imunes do SNC carecem por ser desvendados. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi analisar o padrão de expressão gênica de citocinas em cultura primária de células neurais submetidas à infecção pelo vírus Rocio. Culturas primárias mistas (neurônio/glia), obtidas a partir de cérebros de camundongos isogênicos neonatos da linhagem BALB/c, foram inoculadas com o VROC (MOI igual a 2) no sétimo dia de cultivo, a confirmação da infecção foi feita por imunocitoquímica (anti-VROC). Quantificou-se a replicação viral nas culturas primárias infectadas, em função do período infeccioso, pelo método da titulação viral. O RNA celular total foi extraído e utilizado para a detecção de citocinas através da técnica de RT-qPCR em tempo real. O estudo demonstrou que cultura primária de células neurais constitui um bom modelo experimental para estudo de infecções do SNC pelo flavivírus Rocio. O VROC infectou eficientemente a cultura primária de células neurais gerando alterações citopatogênicas a partir do 2º dia p.i., momento em que se detectou maior título viral. A cultura primária infectada com o VROC sobreviveu até 7 dias p.i. e a quantificação da carga viral revelou uma cinética de replicação viral compatível com a cinética de morte celular da cultura infectada pelo VROC. Durante os cinco primeiros dias p.i. da cultura primária, houve redução da expressão gênica de INF-α, INF-β, INF-γ e IL-1β, não houve alteração na expressão de TNF-α e houve aumento na expressão de TGF-β no 1º, 3º e 5º dia p.i. Os achados deste estudo sugerem que o VROC tem a capacidade de regular negativamente a expressão de citocinas moduladoras das respostas imunes antivirais e inflamatórias e que, neste modelo experimental, a imunorregulação exercida pelo TGF-β predomina sobre a modulação das respostas imunes antivirais e inflamatórias, sendo necessários maiores estudos para elucidar a imunopatologia da infecção do SNC pelo VROC. / Arboviruses belonging to the genus Flavivirus (Flaviviridae family) are responsible for considerable morbidity and mortality, may cause severe cases of encephalitis, hemorrhagic fever, hepatitis and febrile disease in vertebrates, including humans. Rocio flavivirus (ROCV) is very important for public health in Brazil, as it represents a serious threat of occurrence of sudden encephalitis outbreaks. The immunopathology of encephalitis caused by flavivirus is not yet fully understood and many aspects involved in modulation of immune responses in the CNS need to be unraveled. Thus, the aim of this study was to analyze the pattern of gene expression of cytokines in primary culture of neural cells when exposed to infection with Rocio. Mixed primary cultures (neuron/glia), obtained from the brains of BALB/C lineage isogenic newborns mice were inoculated with ROCV (MOI equal to 2) on the seventh day of culture and confirmation of infection was made by immunocytochemistry (anti-VROC). Viral replication was quantified in infected primary cultures, depending on the infectious period, by viral titer method. Total cellular RNA was extracted and used for detection of cytokines by real time RT-qPCR techniques. The study showed that primary cultures of neural cells is a good experimental model for the study of CNS infections by Rocio flavivirus. ROCV efficiently infected the primary cultured neural cells leading to cytopathic changes from the 2nd day a.i., when it detected the higher viral titer. The ROCV-infected primary culture survived up to 7 days a.i. and quantification of viral load showed a viral replication kinetics compatible with cell death kinetics of culture infected by ROCV. During the first five days a.i. of the primary culture, there was reduction of IFN-α gene expression, IFN-β, IFN-γ and IL-1β, there was no change in TNF-α expression and there was an increase in TGF-β expression in the 1st, 3rd and 5th day a.i.. The findings of this study suggest that ROCV has the ability to downregulate modulators cytokines of antiviral and inflammatory immune responses and, in this experimental model, immunoregulation exerted by TGF-β predominates over the modulation of inflammatory and antiviral immune responses, larger studies are needed to elucidate immunopathology of CNS infection by ROCV.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / No Brasil, a maioria das viroses transmitidas por artrópodes (arboviroses) pertence ao gênero Flavivirus, no entanto, aqueles transmitidos por carrapatos são menos estudados do que os transmitidos por insetos. Além dos vírus, outros microrganismos possuem grande relevância em saúde pública. Riquétsias são os principais agentes de zoonoses transmitidas por carrapatos no Brasil, especialmente as do Grupo da Febre Maculosa (GFM), que inclui diversas espécies patogênicas e que são transmitidas por carrapatos. Dentre os diversos biomas, dois foram particularmente degradados no Brasil, a Mata Atlântica e o Cerrado. Diante destes motivos, esta tese compõe-se de três capítulos, que tiveram como objetivo identificar carrapatos vetores em áreas do Cerrado e Mata Atlântica adjacentes a áreas com atividade humana, pesquisando por patógenos causadores de zoonoses, Rickettsia spp. e Flavivirus. No primeiro capítulo, a presença de riquétsias foi averiguada em carrapatos de cães e carnívoros da região de Cumari-GO. Pesquisou-se por esse microrganismo em oito espécies de carnívoros silvestres e em cães domésticos. Duas amostras amplificaram fragmentos do gene ompB, presente em riquétsias do GFM, e ao mesmo tempo amplificaram fragmentos específicos para Rickettsia bellii, que não pertence a esse grupo. Isso demonstra uma possível infecção cruzada, podendo o carrapato manter concomitantemente estas duas espécies divergentes. O segundo capítulo, dados de carrapatos de tamanduás (Myrmecophaga tridactyla e Tamandua tetradactyla) referentes a um período de 18 anos foram analisados, 169 amostras foram avaliadas quanto à presença de riquétsias. Quatro destas amostras exibiram sequência de ompA com 100% de identidade com outras sequências de carrapato Amblyomma nodosum, indicando que Rickettsia spp. do grupo da febre maculosa (SFG) em Amblyomma nodosum estava circulando no entorno da cidade de Uberlândia e estado de São Paulo, podendo outros carrapatos, tais como A. sculptum serem infectados, gerando risco para animais domésticos e seres humanos. No último capítulo, carrapatos de seis áreas, uma pertencente à Mata Atlântica e as outras do bioma Cerrado, foram avaliados quanto à presença de Flavivirus. Nestes locais foram pesquisados carrapatos de doze espécies diferentes, sendo onze da família Ixodidae e um da família Argasidae, estes pertenciam às espécies: Amblyomma sculptum, Rhipicephalus sanguineus, Rhipicephalus microplus, Dermacentor nitens, Amblyomma ovale, Amblyomma dubitatum, Amblyomma parvum, Amblyomma rotundatum, Amblyomma incisum, Amblyomma brasiliense, Amblyomma naponense e Ornithodoros sp. Detectou-se a presença de um flavivírus em carrapatos R. microplus coletados na região de Uberlândia. Estas amostras exibiram aproximadamente 98% de identidade com o Vírus do Carrapato Mogiana (MGTV). Todos os carrapatos que exibiram resultados positivos para flavivírus ou riquétsias, foram coletados em áreas antropizadas, confirmando a importância do estudo de vetores hematófagos na epidemiologia de agentes virais e bacterianos de animais domésticos e selvagens. / In Brazil, most arthropod-transmitted viruses (arboviruses) belong to Flavivirus genus, being tick-transmitted less studied than insect-transmitted ones. Other microorganisms have great public health relevance, such as Rickettsia, the main agent of tick-borne diseases in Brazil, specially the Macular Fever (MF) group, which includes several pathogenic species that are transmitted by ticks. Within different biomes, both the Atlantic Forest and the Cerrado were severely degraded in Brazil. This thesis consisted of three chapters, aiming to identify ticks in areas of Cerrado and Atlantic Forest with surrounding human activity, looking for both Rickettsia and Flavivirus infected ticks. In the first chapter, the presence of Rickettsia was investigated in ticks from dogs and other carnivores, being eight wild carnivores species and domestic dogs in Cumari, Goiás state, Brazil. Two samples were positive for ompB gene, common in the MF group, being also positive for specific genes found in Rickettsia bellii, which does not belong to the MF group. This result shows a possible cross-infection, being tick able to maintain these two different species simultaneously. The second chapter, an 18- year-study-data from anteater ticks (Myrmecophaga tridactyla and Tamandua tetradactyla) was analyzed, accounting 169 samples evaluated for the presence of Rickettsia. Four samples were positive for ompA gene, being 100% identical to other tick sequences present in Amblyomma nodosum, indicating that Rickettsia from the MF group in A. nodosum was circulating around the city of Uberlândia and state of São Paulo. Other ticks, such as A. sculptum, could become infected by the Rickettsia presence, generating risk for domestic animals and humans. In the last chapter, ticks from six areas, being one from the Atlantic Forest and the others from the Cerrado biome, were evaluated for the presence of Flavivirus. 12 different species were accounted, in which eleven were from the Ixodidae family and one was from the Argasidae family, having the following species identified: Amblyomma sculptum, Rhipicephalus sanguineus, Rhipicephalus microplus, Dermacentor nitens, Amblyomma ovale, Amblyomma dubitatum, Amblyomma parvum, Amblyomma rotundatum, Amblyomma incisum, Amblyomma brasiliense, Amblyomma naponense and Ornithodoros sp. The presence of a Flavivirus in R. microplus ticks collected in the Uberlândia region was detected. These samples exhibited approximately 98% identity with the Mogiana Tick Virus (MGTV). All ticks that were positive for Flavivirus or Rickettsia were collected in areas with human activities, stating the importance of studies on hematophagous vectors in the epidemiology of both viral and bacterial agents in domestic and wild animals. / Tese (Doutorado)