Fluorigenic aromatic molecules have found wide application in Fluorescence Spectroscopy. Commercially available fluorigenic reagents have been used to detect amines, amino acids, peptides and proteins. Orthophthalaldehyde (OPA) is an aromatic dialdehyde which is specific for a primary amino group. Three polyaromatic dialdehyde molecules similar to this compound have been synthesised and investigated for their analytical applications. They are: (1) naphthalene-2,3- dicarboxaldehyde (NDA), (2) 1-phenylnaphthalene-2, 3- dicarboxaldehyde (0NDA) and (3) anthracene-2,3- dicarboxaldehyde (ADA).

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Orientadores: Ivo Milton Raimundo Junior, María Cruz Moreno-Bondi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-17T08:47:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinheiro_SilviaCristinaLopes_D.pdf: 3031586 bytes, checksum: d04087a8b894575a32142d906b54d76b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi desenvolver sensores fluorimétricos empregando os reagentes luminescentes ZOX (2-piridin-2-il-benzooxazol), [Ru(s2d)2(bim)] (complexo de Ru(II), onde s2d: 1,10-fenantrolina-4,7-di-il) bis(benzenossulfonato e bim: 2,2¿-biimidazol) bpySOH (4-[2-(4¿-metil-[2,2¿] bipiridil-4-il)-vinil]-fenol) e bpySOMA (2-metileno ácido butírico-4-[2-(4¿-metil-[2,2¿] bipiridil-4-il)-vinil]-fenil éster) para a determinação simultânea de metais pesados em águas. Os fluoróforos ZOX e [Ru(s2d)2(bim)] não forneceram resultados satisfatórios uma vez que sofreram lixiviação das matrizes (sol-gel) nas quais estavam imobilizados. Por outro lado, o reagente bpySOH e seu derivado bpySOMA forneceram bons resultados na caracterização em solução assim como na forma imobilizada. Estudos espectrofotométricos em solução com o bpySOH demonstraram estequiometrias de complexação ligante:metal de 1:1 para Cd(II), Ni(II) e Zn(II) e de 2:1 para Cu(II) e Hg(II). As constantes de estabilidade calculadas através de dados espectrofotométricos indicaram que os complexos de Cu(II), Hg(II) e Zn(II) são os mais estáveis. Estudos mostraram que Cu(II), Ni(II) e Zn(II) desativam a emissão do ligante, enquanto Hg(II) e Cd(II) incrementam essa propriedade. Experimentos de tempo de vida demonstraram um mecanismo de supressão estática da fluorescência para todos os complexos. Como estratégia de imobilização do ligante, avaliou-se uma matriz sol-gel (a partir do precursor TMOS). Imobilizado, o ligante mostrou resposta reversível para Cu(II), Hg(II) e Zn(II). O intervalo de resposta obtido para os íons metálicos foi de 2,50¿30,0 mmol L. A determinação simultânea em misturas contendo 2 ou 3 íons foi realizada utilizando Regressão por Mínimos Quadrados Parciais. Os modelos de calibração multivariada apresentaram resultados de previsão satisfatórios com valores de RMSEP inferiores a 3,00 mmol L. O derivado bpySOMA, por sua vez, apresentou comportamento semelhante em termos de valores de estequiometrias de complexação e constantes de estabilidade. Para imobilizá-lo, empregou-se um MIP seletivo para Cu(II). Estudos indicaram a seletividade para este metal frente a Cd(II), Hg(II), Ni(II), Pb(II) e Zn(II). Uma faixa de resposta foi obtida no intervalo de 0,1¿6,0 mmol L. O sensor foi aplicado à determinação de Cu(II) em águas de torneira fortificadas com o metal. Os resultados obtidos, quando comparados com um método de referência (FAAS) indicaram a aplicabilidade do sensor e que o mesmo apresenta potencialidade para trabalhos futuros. / Abstract: This thesis is aimed at developing fluorimetric sensors employing luminescent reagents ZOX (2-pyridin-2-yl-benzooxazole), [Ru(s2d)2(bim)](Ru complex, where s2d: 1,10-phenanthroline-4,7-diyl)bis(benzenesulfonate) and bim: 2,2¿-biimidazole), bpySOH (4-[2-(4¿-methyl-[2,2¿]bipyridinil-4-yl)-vinyl]-phenol) and bpySOMA (2-methylene-butyric acid 4-[2-4¿-methyl-[2,2¿]bipyridinyl-4-yl)-vinyl]-phenyl ester) for the simultaneous determination of heavy metals in waters. The fluorophores ZOX and [Ru(s2d)2(bim)] did not provide satisfactory results, being leached out from the matrix in which they were immobilized. On the other hand, bpySOH and its derivative bpySOMA provided good results in solution as well as after immobilization. Spectrophotometric studies of bpySOH in solution showed stoichiometries ligand:metal of 1:1 for Cd(II), Ni(II) and Zn(II) while 2:1 ratio was obtained for Cu(II) and Hg(II). Stability constants calculated from spectrophotometric data indicated that Cu(II), Ni(II) and Zn(II) complexes are the most stable. In addition, it was observed that Cu(II), Ni(II) and Zn(II) quench the fluorescence of the ligand, while Hg(II) and Cd(II) enhance this property. Lifetime studies demonstrated a static mechanism of quenching of fluorescence for all complexes. The ligand was immobilized in a sol-gel matrix (obtained from TMOS precursor), which presented reversible response for Cu(II), Hg(II) and Zn(II). The response range for the metal ions was 2.50¿30.0 mmol L. Simultaneous determinations of mixtures containing 2 or 3 ions were performed using the Partial Least Square method. Multivariate calibration models showed satisfactory prediction results, with RMSEP values lower than 3.00 mmol L. The derivative ligand bpySOMA showed similar results in terms of complexation stoichiometries and stability constant values. It was immobilized as a molecularly imprinted polymer selective to Cu(II), confirmed by the response of the non-imprinted polymer for Cd(II), Hg(II), Ni(II), Pb(II) and Zn(II) ions. A response range of 0.1¿6.0 mmol Lwas obtained. The sensor was applied to the determination of Cu(II) in tap water and the results agreed with those obtained by Flame Atomic Absorption Spectrometry. / Doutorado / Quimica Analitica / Doutor em Ciências

La détection et l'identification de bactéries pathogènes revêt une grande importance dans de nombreux domaines tels que la santé et l’industrie agroalimentaire. Dans ce contexte, les travaux de thèse s’intéressent à détection non invasive de Salmonella via la fraction volatile de son métabolome dont les métabolites volatils caractéristiques sont le sulfure d’hydrogène et la cadavérine. Ils illustrent également le concept de substrats osmogènes libérant des mCOV exogènes sous l’action d’enzyme spécifique d’Escherichia coli. Un premier capteur colorimétrique capable de distinguer le sulfure d’hydrogène du méthanethiol a été préparé. Il s’agit d’une matrice de silicate nanoporeuse dopée avec les réactifs N,N-diméthyl-p-phénylènediamine et ions Fe3+. Une bonne stabilité de l’intermédiaire réactionnel issu de ces réactifs, la quinonediimine (QD), est obtenue pour une forte concentration d’acide chlorhydrique. La réaction entre QD et 1000 ppm de sulfure d’hydrogène et de méthanethiol entraîne l’apparition respective d’une coloration verte et rouge-marron du capteur. Le capteur fluorimétrique de cadavérine, basé sur la formation d’un complexe fluorescent entre le Naphthol AS-BI déméthylé (ArOH) et la cadavérine, permet de détecter 250 ppb de cadavérine. La preuve de concept de substrats osmogènes a été illustrée avec la détection de p-nitrophénol (pNP) et de β-naphthylamine (β-NA) libérés en présence d’enzymes de E. coli, β-D-glucuronidase et L-alanine- β-naphthylamidase. Les capteurs nanoporeux produits, de taille de pores contrôlée, peuvent détecter 100 ppm de pNP, composé coloré (jaune) et 100 ppm de β-NA, composé fluorescent, ou encore 100 ppm de β-NA par dérivation chimique de ce dernier avec le diméthyl-p-aminocinnamaldéhyde (formation d’un produit rouge). En milieu biologique, l’eau est un interférent majeur. / Microbial contamination of food and biological samples is a big issue in the industry as much as in the medical field. In that context, the present thesis brings innovative solutions. A first explored way is the identification of Salmonella by detecting and measuring the specific metabolomics volatile organic compounds (mVOC) released, H2S and cadaverine. Another new concept is the use of osmogenic substrates able to release mVOC under the action of specific enzyme of Escherichia coli.A first colorimetric sensor able to discriminate H2S from CH3SH was produced, using a nanoporous silicate matrix doped with N,N-dimethyl-p-phenylenediamine and Fe3+ ions. A very acidic medium is needed to stabilize the “key” intermediate of the reaction, the quinonediimine species (QD), which gives with H2S and CH3SH a green and red-brown product, respectively. The fluorimetric sensor of cadaverine is based on the formation of a fluorescent complex between AS-BI demethylated Naphthol and cadaverine and can detect 250 ppb of cadaverine. A proof of concept of osmogenic substrates is given with the detection of p-nitrophenol (pNP) et de β-naphthylamine (β-NA) released under the action of Escherichia coli enzymes, β-D-glucuronidase et L-alanine- β-naphthylamidase. Various nanoporous sensors are produced with tailored pore size, which can detect 100 ppm of the yellow pNP, 100 ppm of the fluorescent β-NA and 100 ppm of the red product issued from the derivation of β-NA with dimethyl-p-aminocinnamaldehyde. In biological media, water remains the major interfering agent.

[pt] Métodos baseados na cromatografia líquida micelar (MLC) com detecção fluorimétrica foram desenvolvidos para dois estudos de caso. No primeiro deles, seis B-carbolinas (harmol, harmalol, harmane, norharmane, harmine e harmaline) foram plenamente separadas de modo a se aplicar o método para a determinação dos alcaloides em formulações de Passiflora incarnata L., extrato seco de Passiflora alata Dryander e em urina. A separação foi realizada em coluna cromatográfica C18, utilizando fase móvel tamponada (pH 8,0) contendo 220 mmol L-1 de dodecilsulfato de sódio (SDS)/acetonitrila (97/3 por cento v/v). A detecção fluorimétrica permitiu que se atingissem limites de detecção (LOD) abaixo de 3,6 ng g-1 com repetibilidade e precisão intermediária entre 0,1 e 5 por cento. As incertezas combinadas associadas à concentração das B-carbolinas ficaram entre 1 e 9 por cento. O método proposto foi comparado ao método baseado na cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) com detecção absorciométrica e os resultados com MLC se mostraram superiores do ponto de vista da capacidade de detecção (por serem os alcaloides naturalmente muito fluorescentes) e de recuperação. Para as amostras de fitoterápicos, o harmol foi quantificado tanto nas amostras de medicamento de Passiflora incarnata quanto em urina de voluntário após a administração de fitoterápico. O harmine foi detectado apenas na amostra de medicamento. Os alcaloides norharmane, harmine e harmaline foram identificados no chá misto de Maracujá, no qual continha em sua composição extrato seco de Passiflora alata Dryander. Na segunda abordagem, um método por MLC foi desenvolvido para a determinação de galantamina e de seus principais metabólitos (N-desmetil galantamina, O-desmetil galantamina, epigalantamina e N-óxido galantamina). A separação da galantamina e dos metabólitos foi feita utilizando coluna cromatográfica C18 com porosidade de 300 angstroms e fase móvel constituída de tampão (pH 5,0) contendo 25 mmol L-1 de SDS/acetonitrila (97/3 por cento v/v). A detecção fluorimétrica permitiu limites de detecção abaixo de 343 ng g-1, repetibilidade e precisão intermediária entre 2,2 e 4 por cento. As incertezas combinadas associadas à concentração de galantamina e dos metabólitos ficaram entre 0,3 e 11 por cento. Ensaios de recuperação foram realizados em amostra de urina fortificada com padrões da galantamina e metabólitos e os resultados obtidos ficaram entre de 91,4 e 114,8 por cento. A comparação entre o método por MLC e o método por cromatografia líquida de alta eficiência com fase reversa foram feitas com amostras de medicamento cujo princípio ativo era o hidrobrometo de galantamina. Os resultados dos teores de galantamina e as variâncias das medidas obtidas por ambos os métodos foram estatisticamente iguais. A sensibilidade da curva analítica obtida por MLC foi duas vezes maior do que a encontrada por cromatografia por fase reversa. Análises de urina de ratos coletadas após a administração do medicamento foram realizadas com o método proposto, sendo que a galantamina mais os metabólitos N-óxido galantamina e N-desmetil galantamina foram identificados nas amostras. Para melhor avaliar o efeito de amplificação de fluorescência da galantamina pelo ambiente organizado, experimentos foram feitos com a separação cromatográfica de fase reversa e com a adição de solução rica em micelas de SDS após a passagem do analito pela coluna cromatográfica. As condições de separação incluíram o uso de coluna cromatográfica C18, fase móvel constituída por tampão (pH 5,0) contendo 2 por cento de propano-2-ol (v/v)/ acetonitrila (80/20 por cento v/v). A solução micelar de SDS (100 mmol L-1), misturada à fase móvel após a coluna cromatográfica, foi preparada com a mesma composição da fase móvel. A sensibilidade da curva analítica de galantamina foi três vezes maior quando o meio micelar foi usado. O resultado prova que o ambiente micelar favorece a medição fluorimétrica de galantam / [en] Methods based on micellar liquid chromatography (MLC) with fluorimetric detection have been developed for two case studies. In the first, six B-carbolines (harmol, harmalol, harmane, norharmane, harmine and harmaline) were fully separated allowing the application of the method for the determination of these alkaloids in Passiflora incarnata L. formulations, in Passiflora alata Dryander dry extract and in urine. The chromatographic separation was performed on a C18 column using a buffered mobile phase consisting of disodium hydrogen phosphate (pH 8.0) containing 220 mmol L-1 of sodium dodecyl sulfate (SDS)/acetonitrile (97/3 percent v/v). The fluorimetric detection allowed limits of detection (LOD) below than 3.6 ng g-1 to be achieved with intermediary precision and repeatability between 0.1 and 5 percent. The calculated combined uncertainties of the concentration of B-carbolines were between 1 and 9 percent. The proposed method was compared with the method based on micellar electrokinetic chromatography (MEKC) with absortionmetric detection. The MLC results were superior from the viewpoint of the detection power (since they are very fluorescent alkaloids) and also in terms of recovery. The harmol was quantified in Passiflora incarnata phitotherapic samples and in urine collected from a voluntary after of the administration of herbal medicine. The harmine was detected only in the phitotherapic sample. The norharmane, harmine and harmaline alkaloids were identified in Passion Fruit tea, which contained dry extract of Passiflora alata Dryander. In the second approach, a method for MLC was developed for the determination of galantamine and its main metabolites (N-demethyl galantamine, O-demethyl galantamine, epigalantamine and N-oxide galantamine). The separation was performed using a C18 chromatography column with porosity of 300 angstroms and with mobile phase consisting of buffer (pH 5.0) containing SDS (25 mmol L-1)/acetonitrile (97/3 percent v/v). The fluorimetric detection enabled LOD below 343 ng g-1 with intermediate precision and repeatability between 2.2 and 4 percent. Combined uncertainties for concentration of galantamine and metabolites were between 0.3 and 11 percent. Recovery experiments were performed on urine samples fortified with galantamine standards and metabolites with results between 91.4 and 114.8 percent. A comparison between the proposed MLC method and reverse phase high performance liquid chromatography was made using medicine samples containing galantamine hydrobromide as the active principle. Galantamine levels and variances achieved with these methods were statistically equal. The analytical curve sensitivity by MLC was two times higher than that found with reverse phase high performance liquid chromatography. Analysis of rat urine, collected after the administration of the medicine, were performed with the proposed method enabling the identification of galantamine, N-oxide galantamine and N-demethyl galantamine. To better evaluate the fluorescence amplification effect of galantamine in the organized environment, experiments were made with conventional chromatographic separation and post-column addition of the aqueous solution rich in micelles. The separation conditions included the use of C18 chromatographic column, mobile phase consisting of buffer (pH 5.0) containing 2 percent of propan-2-ol (v/v)/acetonitrile (80/20 percent v/v). The micellar solution of SDS (100 mmol L-1), added after the chromatographic column, was prepared with the same composition of the mobile phase. The column temperature was 25 degrees C and the sample volume was 20 uL. The sensitivity of the analytical curve of galantamine was three times higher when the micellar solution was mixed, proving that the organized environment favors the galantamine fluorescence even at flow regime. Recoveries with or without post-column mixing with the micelle rich solution were between 97.5 and 102.2 percent.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The present work reports the development of new methodologies to evaluate the in vitro and in vivo antioxidant capacity against peroxyl and hydroxyl radicals in five medicinal plant samples (Matricaria chamomilla L., Psidium guajava, Achyrocline satureoides, Baccharis genistelloides and Cymbopogon citratus) and seven phenolic compounds (rutin, quercetin, resveratrol, gallic acid, ferulic acid, caffeic acid and rosmarinic acid). The antioxidant capacity of the samples was analyzed by two independent methods. In the first one, a new approach was used to detect hydroxyl radicals indirectly using an electrochemical procedure, in which the radicals destroy a thiol self-assembled monolayer (SAM) on a gold electrode. This monolayer can block the electrochemical signal of a dissolved redox probe. When such an electrode with a SAM is exposed to free radicals, these radicals destroy the SAM and the electrochemical signal of a redox probe recovers to a degree proportional to the extent of dissolution of the SAM. In the second method, the evaluation of antioxidant capacity against peroxyl and hydroxyl radicals is based on the indirect detection of these reactive oxygen species (ROS) by fluorimetry (ex/em: 485/520 nm) employing 2 -7 -dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA) as a fluorescent probe. After the deacetilation reaction of DCFH-DA, it can be oxidized by ROS to the fluorescent compound DCF. The peroxyl radicals were produced at 37ºC by thermal decomposition of 2,2 -azobis (2 methylpropianamidine) dihydrochloride (ABAP), while hydroxyl radicals were generated by the Fenton reaction. In vivo assays were evaluated using zebrafish (Danio rerio) hepatocytes exposed to P. guajava and C. citratus extracts (better and worst in vitro results, respectively). The results obtained by the electrochemical and fluorimetric methods show that it is difficult to classify the tested plants according to their antioxidant capacity, since the results depended strongly on the extract concentration and composition as well as on the principle of the analytical method. However, there was a good correlation between the in vitro and in vivo assays for P. guajava and C. citratus extracts, since these results showed a reduction in the intracellular ROS concentration in the hepatocytes exposed to P. guajava extract. Furthermore, no antioxidant effect was observed in the assay with C. citrates extract, what is in agreement with the in vitro assays for this plant species. At last, the thesis intended to proof and to highlight the discrepant results obtained by independent methods for the same antioxidant species. Additionally, it aimed to compare the different methods according to the differences among the experimental procedures by using different ROS. Furthermore, the stability, reactivity and the half-life time of the free radicals are discussed. / O presente trabalho visa ao desenvolvimento de novas metodologias para a determinação da capacidade antioxidante in vitro e in vivo contra radicais peroxila e hidroxila em amostras de 5 plantas medicinais (Matricaria chamomilla L., Psidium guajava, Achyrocline satureoides, Baccharis genistelloides e Cymbopogon citratus) e sete compostos fenólicos (rutina, quercetina, resveratrol, ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido gálico e ácido rosmarínico). A capacidade antioxidante das amostras foi determinada por dois métodos independentes. No primeiro, testou-se uma nova forma para a detecção de radicais hidroxila, usando-se um procedimento eletroquímico no qual os radicais destroem uma monocamada auto-organizada de hexanotiol sob um eletrodo de ouro. Esta monocamada consegue inibir o sinal eletroquímico de um par redox dissolvido, e, ao ser atacada por radicais livres, estes a destroem, e a recuperação do sinal eletroquímico do par redox se dá de forma proporcional à extensão de dissolução da monocamada. No segundo método, a determinação da capacidade antioxidante contra radicais peroxila e hidroxila ocorre através da detecção indireta destes radicais por fluorimetria (ex/em: 485/520 nm), empregando diacetato de 2 ,7 -diclorofluoresceína (DCFH-DA) como substrato. O DCFH-DA, após sofrer desacetilação, pode ser oxidado por espécies reativas de oxigênio (ERO), gerando fluorescência. Os radicais peroxila foram gerados através da termodegradação do reagente cloreto de 2,2 -azobis (2-metilamidinopropano) (ABAP) a 37ºC, enquanto os radicais hidroxila foram gerados pela reação de Fenton. Ensaios in vivo foram avaliados utilizando-se hepatócitos do peixe zebra (Danio rerio), expostos aos extratos das plantas P. guajava e C. citratus (melhor e pior desempenho in vitro, respectivamente). Os resultados obtidos pelos métodos eletroquímico e fluorimétrico demonstram que é extremamente difícil classificar as plantas de acordo com sua capacidade antioxidante, uma vez que o resultado obtido depende fortemente da concentração e da composição química dos extratos, além do princípio do método analítico empregado. Entretanto, obteve-se uma boa correlação entre os ensaios in vitro e in vivo feitos para os extratos das plantas P. guajava e C. citratus, já que os resultados obtidos mostraram uma redução da concentração de ERO intracelular em forma dose-dependete nos hepatócitos expostos a P. guajava, sem se observar efeito antioxidante no ensaio com C. citratus, a exemplo dos ensaios in vitro realizados. O presente trabalho pretende chamar a atenção para esses diferentes resultados obtidos, e compara os diferentes métodos levando em consideração as diferenças existentes entre as metodologias, assim como as diferenças existentes entre os radicais testados. Além disso, discute-se a estabilidade, a reatividade e tempo de meia-vida destas espécies.