La alta afinidad de los bisfosfonatos (BPs) por la hidroxiapatita del hueso y la capacidad que tienen para inhibir la resorción ósea hace que sean el medicamento de elección para la prevención y el tratamiento de enfermedades donde la acti-vidad osteoclástica se encuentra exacerbada. Sin embargo, el mecanismo de acción preciso de los BPs, principalmente en osteoblastos, aún no ha sido completamente elucidado. En el presente trabajo de tesis se investigó la existencia de una entidad receptora para el amino-BP Alendronato (ALN) en células osteoblásticas ROS 17/2.8, a partir del cual se induce un mecanismo de transducción de señales intracelulares. Además, se estudió la modulación por ALN de las cascadas de señalización de las proteínas quinasas activadas por mitóge-nos (MAPKs), y su participación en la proliferación de estas células. Los estudios realizados demuestran que las células osteoblásticas presentan un sitio de unión específico para el ALN, que es reversible, saturable y de alta afinidad. Mediante ensayos de ligado en células (HeLa) que no expresan conexina 43 (Cx43), se determinó que esta proteína no es necesaria para la unión del BP a la célula. Además, el ligado específico en osteoblastos cuya Cx43 basal se trató con desacoplantes de hemicanales demostró que la formación del conexón tampoco es necesaria para la unión del BP a la célula. Adicio-nalmente, se comprobó en ambas líneas celulares que el BP es capaz de ingresar, por un mecanismo aún no estudiado, observándose mayor distribución en citoplasma y región perinuclear. El desplazamiento de ALN ligado observado en presencia de sustratos de fosfatasas, evidenció a estas enzimas como posibles moléculas blanco de BP. A su vez, se demostró por primera vez la expresión basal de proteínas tirosina fosfatasas (PTPs) receptoras de membrana y citoplas-máticas en osteoblastos y se observó que ALN inhibió la actividad de todas las PTPs estudiadas, al igual que el conoci-do inhibidor de PTPs, ortovanadato. Tratamientos a tiempos cortos con ALN promovieron la fosforilación de las MAPKs ERK1/2, ERK5, p38 y p46 JNK, en forma dependiente del tiempo. De la misma manera que los inhibidores de fosfatasas, ortovanadato y fluoruro de sodio, el BP produjo un aumento en la proliferación, tanto de células ROS 17/2.8 como de aquellas que no expresan Cx43, a 48 h de tratamiento en forma dependiente de la dosis. Estos resultados en conjunto indican que si bien esta proteína es requerida en la acción anti-apoptótica del BP en osteocitos y osteoblastos según estudios previos, no es necesaria para el ligado de ALN a la célula como tampoco para su efecto proliferativo. Los resul-tados presentados en este trabajo de tesis son aportes originales al conocimiento del mecanismo de acción de los amino-BPs en células osteoblásticas y podrían ser de relevancia para la mejora de las terapias preventivas de enfermedades metabólicas óseas frecuentes. / The high affinity of bisphosphonates (BPs) for hydroxyapatite and their ability to inhibit bone resorption makes them the drug widely used in the clinic for the prevention and treatment of diseases in which osteoclast activity is exacer-bated. However, the precise mechanism of action of BPs, particularly in osteoblasts, has not yet been completely understood. In this thesis work it was investigated the existence of a receptor entity for the amino-BP alendronate (ALN) in ROS 17/2.8 osteoblastic cells, from which it induces a mechanism of intracellular signal transduction. In addition, the modulation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) signaling pathways induced by ALN and their involvement in the proliferation of osteoblasts were studied. The results reported here provide strong evidences that osteoblastic cells present a specific binding site, which is reversible and satu-rable, with high affinity for ALN. Binding assays in cells (HeLa) that do not express connexin 43 (Cx43), demonstrated that this protein is not necessary for BP binding to the cell. Furthermore, specific ALN binding to osteoblasts treated with agents that disassemble Cx43 hemichannels showed that the pore formation is not either required for BP binding to the cell. Additionally, both cell lines internalized ALN from solution, by a mechanism not yet studied, showing a wide distribution in cytosol and peri-nuclear region. The displacement of ALN bound to ROS 17/2.8 cells by phosphatases substrates, suggests that these enzymes may be molecular targets. Moreover, it was demonstrated for the first time the basal expression of cytoplasmic and receptor-like protein tyrosine phosphatase (PTPs) in osteoblasts. Additionally, like the most frequently used PTP inhibitor, orthovanadate; ALN inhibited the phosphatase activity of all the PTPs evaluated. Short-term treatment with BP increased phosphorilation of ERK1/2, ERK5, p38 and p46 JNK MAPKs in a time-dependent manner. Like the PTPs inhibitors, orthovanadate and sodium fluoride, the BP induced an increase in osteoblastic cells proliferation, as well as in cells that do not express Cx43, in a dose-dependent manner after 48 h of treatment. These results altogether indicate that Cx43 is not necessary for the BP binding to the cell and the proliferative effect, even though this protein is required for the antiapoptotic action of ALN on osteoblasts and osteocytes. The results presented in this thesis work are original contributions to the knowledge of amino-BP mechanism of action on osteoblastic cells and may be of relevance to the improvement of the preventive therapies applied for common bone diseases.

Doctor en Química / En esta tesis doctoral se estudió, en forma experimental y teórica, la reacción de acoplamiento oxidativo de las quinonas carbo- y heterocíclicas 2-metil-1,4-benzoquinona, 8,8-dimetilnaftalen-l,4,5(8H)-triona y el éster metílico del ácido 1,3-dimetil-5,8-dioxo-5,8-dihidro-isoquinolin-4-carboxílico (una isoquinolin quinona), con aminas alifáticas (derivados de N-fenilpiperazina) y aromáticas (derivados de anilina), comparando un medio de reacción orgánico como el diclorometano con un medio de reacción sustentable como el agua. Se aplicó la metodología sintética desarrollada en la obtención de nuevos inhibidores de la enzima fosfatasa Cdc25B, implicada en el control de la proliferación celular y asociada con cáncer. Los compuestos fueron también estudiados como inhibidores de la respiración mitocondrial, un blanco donde comúnmente actúan compuestos quinonicos, además de su efecto antiproliferativo en células tumorales de ratón y humanas. Se encontró que el medio acuoso puede incrementar tanto la reactividad como la regioselectividad, en las reacciones de acoplamiento C-N de aminas con quinonas. Para los casos estudiados en este trabajo, las reacciones en agua dan mejores, o al menos, los mismos resultados que al usar un medio de reacción convencional como diclorometano. Los cálculos teóricos, basados en índices de reactividad DFT y el potencial electrostático molecular ayudaron a racionalizar los cambios en la reactividad observada experimentalmente. A partir de la quinona 8,8-dimetilnaftalen-l,4,5(8H)-triona, se obtuvieron nuevos inhibidores de la enzima Cdc25B de tipo aminiquinonicos, los cuales presentaron inhibición de tipo mixta, con Ki y Ki´ en el rango micromolar y en un caso con Ki´ submicromolar. Los cálculos de docking permitieron visualizar la forma de unión de los compuestos en el sitio activo de la enzima, lo que explica en parte la acción inhibitoria de los compuestos. Los resultados de la inhibición de la respiración mitocondrial mostraron que la adición de un sustituyente amino, ya sea anilina, fenilpiperazina o bisfenilamina en la quinona 8,8-dimetolnaftalen-l,4,5(8H)-triona inactiva su acción. Los resultados de inhibición de la proliferación celular de las aminoquinonas obtenidas, mostraron que para el caso de las células de ratón la relación de proliferación de células cancerosas/células normales es siempre mayor a uno, indicando una selectividad por las células cancerosas, en cambio en las células humanas esta relación se invirtió, siendo siempre las células normales más susceptibles que las cancerosas. El compuesto más activo frente a las células tumorales de ratón TA3 fue la o-acetil anilinquinona (1,29 uM), mientras que frente a las células tumorales humanas MCF7 el compuesto más activo fue la o-cloro anilinquinona (18,67 uM) / The oxidative coupling reactions of carbo- and heterocyclic quinones 2-methyl-1,4-benzoquinone, 8,8- dimethylnaphthalene- l,4,5(8H)-trione and the methyl ester of 1,3-dimethyl-5,8-dioxo -5,8- dihydro-isoquinoline -4- carboxylic acid with aliphatic amines (N-phenylpiperazine derivatives) and aromatic (aniline derivatives) were studied experimentally and theoretically. A comparison between a typical organic solvent such as dichloromethane and water, a sustainable reaction medium, was performed. The developed synthetic methodology was applied in the synthesis of new inhibitors of Cdc25B phosphatase enzyme, which is involved in the control of cell proliferation and therefore proposed as a target in cancer research. The inhibition of mitochondrial respiration and the antiproliferative effects in mouse and human tumor cells provoked by the series of compounds were also studied. The results of these studies show that water enhance both reactivity and regioselectivity, in the coupling C-N reactions of quinones with amines. The experimental changes in reactivity were explained by theoretical calculations based on DFT reactivity indexes and molecular electrostatic potential. Starting from 8,8-dimethylnaphthalen-l,4,5(8H)-trione, new aminoquinone Cdc25B enzyme inhibitors were obtained. These compounds showed inhibition of mixed type, with Ki and Ki' in the micromolar range and in one case with Ki' submicromolar. Docking calculations showed the binding of compounds in the active site of the enzyme, explaining partially their inhibitory action. The results on mitochondrial respiration showed that the addition of an amino substituent, either aniline, bisphenilamine or phenylpiperazine to 8,8-dimetolnaftalen-l,4,5(8H)-trione inactivate its inhibitory activity. For the case of mouse cells the results on cell proliferation showed that, the ratio of inhibition of proliferation of cancer versus normal cells is always greater than one. This indicates selectivity for cancer cells. The opposite is observed in human cells. The most active compound against tumor cells mouse TA3 was o-acetyl anilinquinone (1.29 uM ) while facing MCF7 human tumor cells the most active compound was o-chloro anilinquinone (18.67 uM). / FONDECYT

Las proteínas Ppz1 y Ppz2 de Saccharomyces cerevisiae son Ser/Thr fosfatasas involucradas en diferentes procesos celulares, tales como el mantenimiento de la integridad celular, la tolerancia salina y la regulación del ciclo celular en la transición G1/S. La mayor parte de los fenotipos asociados con la ausencia o la sobreexpresión de las fosfatasas Ppz son la consecuencia de la inhibición que ejercen estas fosfatasas sobre los transportadores de potasio de alta afinidad Trk1/2. En las primeras fases de este trabajo, sólo se había identificado una subunidad reguladora para estas fosfatasas, la proteína Hal3, y aunque el mecanismo mediante el cual ejerce esta inhibición se desconocía, sí se había descrito que esta proteína actúa como inhibidora de Ppz1 y Ppz2 en todas las funciones conocidas de Ppz1 En este trabajo presentamos nuevas dianas biológicas de las fosfatasas Ppz, como son la vía de calcio/calcineurina y el sistema de transporte de potasio de baja afinidad. En primer lugar, describimos que células que carecen de Ppz1 son hipertolerantes a altas concentraciones de sodio o litio debido a un incremento en la expresión del gen ENA1, que codifica el componente principal para la tolerancia salina en la levadura. Este efecto en la expresión de ENA1 es independiente de Trk1/2 pero totalmente dependiente de la vía de señalización de la fosfatasa calcineurina, sugiriendo así que Ppz1 inhibe, directa o indirectamente, la actividad de la calcineurina. Respecto a esta función, demostramos que Ppz1 actúa como un regulador negativo de la entrada de calcio que tiene lugar a través de la membrana plasmática. Por otro lado, células que carecen de Ppz1/2 y Trk1/2 necesitan más potasio para sobrevivir que células que carecen sólo de los transportadores de potasio de alta afinidad, hecho que sugiere que las fosfatasas Ppz son reguladores positivos de la entrada de potasio de baja afinidad Trk-independiente.También hemos identificado una segunda subunidad reguladora de las fosfatasas Ppz, denominada Vhs3. Vhs3 actúa inhibiendo las fosfatasas Ppz de igual modo a como lo hace su homólogo Hal3, aunque este último parece ser más eficiente. Además, demostramos que Hal3/Vhs3 participan en el proceso celular de la floculación. Ambas regulan negativamente la vía de señalización de la PKA que, a través de la activación del factor de transcripción Flo8, induce la expresión de la floculina Flo11 causando la floculación. Este efecto es dependiente de las fosfatasas Ppz y podría ser explicado por la regulación negativa que ejercen éstas sobre los transportadores de potasio Trk1/2.Finalmente, demostramos que Vhs3 y Hal3, que presentan homólogos en plantas y mamíferos, están involucradas en una función esencial que es independiente de su papel sobre Ppz1/2, ya que el doble mutante hal3 vhs3 y el cuádruple mutante hal3 vhs3 ppz1 ppz2 son letales mientras que el mutante ppz1 ppz2 no lo es. Además, la letalidad de la cepa hal3 vhs3 se suprime por la sobreexpresión de otros homólogos de Hal3, como es el caso de AtHal3a de Arabidopsis thaliana, sugiriendo que las funciones de Hal3 y Vhs3 Ppz-independientes están conservadas en otros eucariotas. Experimentos in vitro revelan que la proteína Hal3 de plantas (AtHal3a) cataliza uno de los pasos de la biosíntesis de coenzima A y que para ello requiere de dos residuos: la His90 y la Cys175. Aunque Vhs3 y Hal3 conservan el residuo histidina, no conservan el residuo equivalente a la Cys175, por tanto, no es evidente que esta nueva función sea participar en la síntesis de CoA. / The Saccharomyces cerevisiae Ppz1 and Ppz2 are Ser/Thr protein phosphatases involved in several cell processes, such as maintenance of cell integrity, salt tolerance and regulation of cell cycle at the G1/S transition. Most of the phenotypes associated with the absence or the overexpression of the Ppz phosphatases are the consequence of the inhibition that these phosphatases exert on the Trk1/2 high-affinity potassium transporters. At the early steps of this work, only one regulatory subunit of these phosphatases, Hal3, have been identified and, although its specific mechanism of function is still unknown, it has been described that this protein acts as an inhibitor of Ppz1 and Ppz2 for all the known functions of Ppz1.In this work we report evidences about the existence of other biological targets of the Ppz phosphatases, such as the calcium/calcineurin pathway and the low-affinity potassium uptake. First, we describe that cells lacking Ppz1 are hypertolerant to high concentrations of sodium or lithium due to an increased expression of the ENA1 gene, which codifies the major determinant for salt tolerance in yeast. This effect on ENA1 expression is independent of Trk1/2 but is fully dependent on the calcineurin pathway and suggests that Ppz1 inhibits, either directly or indirectly, the calcineurin activity. Concerning to this function, we reveal that Ppz1 acts as a negative regulator of the calcium import across the plasma membrane. On the other hand, cells lacking Ppz1/2 and Trk1/2 need more potassium than cells lacking only the high-affinity potassium transporters to survive, suggesting that the Ppz phosphatases are positive regulators of the Trk-independent low affinity potassium uptake.We also identify a second regulatory subunit of the Ppz phosphatases, named Vhs3. Vhs3 functions inhibiting the phosphatases Ppz, essentially as its homolog Hal3 does, although the last one seems to work more efficiently. In addition, we demonstrate that Hal3/Vhs3 proteins play a role in the flocculation process. They negatively regulate the PKA signalling pathway which, through the activation of the transcription factor Flo8, induces the expression of the Flo11 flocculine causing the flocculation. This effect is dependent on the Ppz phosphatases and could be explained by their inhibitory activity on Trk1/2. Finally, we demonstrate that Vhs3 and Hal3, which have homologs in both plants and mammals, are involved in an essential function that is independent of their role in regulating Ppz1/2, as the double mutant hal3 vhs3 and the hal3 vhs3 ppz1 ppz2 are lethal whereas the ppz1 ppz2 is not. The lethality of the hal3 vhs3 strain is suppressed by overexpression of other Hal3 homologs, such as the AtHal3a in Arabidopsis thaliana, suggesting that the Ppz-independent functions of Hal3 and Vhs3 are conserved in eukaryotes. In vitro experiments revealed that the plant Hal3 (AtHal3a) is involved in one step of the coenzyme A biosynthesis and that there are two residues completely necessary for this function: His90 and Cys175. Vhs3 and Hal3 have the histidine equivalent to His90, but neither of them possesses the equivalent Cys175 suggesting that the yeast homologs could not be involved in the biosynthesis of CoA.