La fosfatidilcolina (PC) es uno de los glicerofosfolípidos más abundantes en las membranas celulares y es además fuente de segundos mensajeros lipídicos tales como el diacilglicerol (DAG), el ácido fosfatídico (PA), el ácido araquidónico (AA) y la lisofosfatidilcolina (LPC). Por su parte, el DAG es capaz de mediar eventos celulares claves a través de la regulación de diversas proteínas entre las que encontramos: las proteínas quinasas C (PKC), las proteínas quinasas D (PKD), las quimerinas, las proteínas liberadoras de nucleótidos de guanina de Ras (RasGRPs), las Munc13s y las DAG quinasas (DAGK). Estos efectores del DAG participan en funciones celulares como la fusión y el tráfico de las membranas, la inflamación, la proliferación, la diferenciación y la muerte celular. La generación de DAG por hidrólisis de la PC se produce en respuesta a diversos estímulos celulares y es catalizada principalmente por la acción de dos vías enzimáticas: por la activación de la fosfolipasa D (PLD) (enzima que genera PA, el cual es hidrolizado a DAG por la acción de una fosfatasa de ácido fosfatídico tipo 2 o PAP2) y por la reacción catalizada por la fosfolipasa C específica para PC (PC-PLC) la cual genera DAG y fosfocolina. Los principales objetivos de la presente tesis doctoral fueron demostrar la presencia de la vía de la PC-PLC en las terminales sinápticas (sinaptosomas) de la corteza cerebral de rata y estudiar el efecto del estrés oxidativo en la generación de DAG a partir de la PC. Los resultados de esta tesis fueron divididos en dos capítulos, en la primera parte estudiamos la presencia de la PC-PLC en los sinaptosomas de ratas adultas y seniles y realizamos la caracterización de esta actividad enzimática. En los sinaptosomas (Syn) de ratas adultas los agentes tensioactivos Triton X-100 y deoxicolato de sodio (DOC) estimularon la formación del DAG observándose la máxima generación en presencia de Triton X-100 al 0,1%, concentración que incrementó la generación de DAG en un 330% con respecto al control. Por otra parte, el agregado de los iones Ca2+ (2 mM) y Mg2+ (1 mM) exógenos inhibió la formación de DAG en un 73% y en un 50% respectivamente. En presencia de etanol (2%) evaluamos la reacción de transfosfatidilación catalizada por la PLD por la cual se genera fosfatidiletanol (PEth) en lugar de PA. Dado que la PAP2 no puede hidrolizar el PEth al incluir este alcohol primario en la reacción enzimática pudimos medir la generación de DAG que proviene exclusivamente de la vía de la PC-PLC. Mediante la utilización de etanol, del inhibidor de la PC-PLC (D609) y del DL-propranolol como inhibidor de la PAP2, demostramos que ambas vías enzimáticas (PC-PLC y PLD) participan en la generación de DAG. Luego de 20 min de incubación la vía de la PLD aportó el 40% del DAG generado mientras que la PC-PLC fue responsable del 60% del DAG generado. Este mismo aporte porcentual se observó en los sinaptosomas provenientes de ratas seniles. Los ensayos cinéticos realizados en presencia de etanol permitieron determinar la constante aparente de Michaelis-Menten (KM) y velocidad máxima (Vmáx) para la PC-PLC sinaptosomal, las cuales fueron de 350 μM y 3.7 nmol DAG x (mg proteína x h)-1 respectivamente. Ensayos de Western blot utilizando un suero policlonal anti-PC-PLC de Bacillus cereus evidenciaron la presencia de dos bandas muy próximas, de un peso molecular cercano a 66 kDa, tanto en las terminales sinápticas de ratas adultas como de ratas seniles. La generación de DAG se evaluó en la fracción de membrana plasmática sinaptosomal (SPM), en esta fracción la formación de DAG fue un 73% mayor respecto a la generación en los sinaptosomas mientras que en la fracción soluble la hidrólisis de la PC a DAG fue prácticamente indetectable. Mediante la utilización de etanol demostramos que la actividad específica de la PC-PLC es un 80% mayor en la fracción SPM que en los Syn. Estudiamos también la hidrólisis de la PC en la fracción de membrana resistente a detergentes (DRMs). Esta fracción (aislada por el tratamiento de los Syn de ratas adultas y seniles con Triton X-100 1% a 4C) presentó características de rafts de membrana, ya que se encontró enriquecida en esfingomielina y colesterol, así como también en proteínas marcadoras de rafts como la caveolina y c-Src. La fracción DRM presentó además un perfil proteico diferencial al de los Syn y un enriquecimiento en la isoforma PLD1, mientras que ensayos de Slot blot mostraron que la PC-PLC se localiza en ambas fracciones. También en las DRMs se observó la generación de DAG por hidrólisis de la PC, sin embargo la presencia de etanol en el ensayo no disminuyó la formación de DAG. Estos resultados indicaron que, a pesar de encontrarse enriquecida en la isoforma PLD1, no se detectó actividad de la PLD en la fracción resistente a detergentes. Por el contrario, la actividad de la PC-PLC fue aproximadamente un 60% mayor en las DRMs con respecto a los Syn. En la segunda parte de la tesis estudiamos el efecto del estrés oxidativo inducido por Fe2+ en la hidrólisis de la PC. La incubación de los Syn de ratas adultas con FeSO4 (50μM) generó un marcado aumento en la peroxidación lipídica que se observó a partir de tiempos cortos de incubación. También se afectó la funcionalidad mitocondrial y la integridad de la membrana plasmática, aunque estos dos parámetros se vieron afectados luego de 60 min de incubación con el agente inductor de la injuria oxidativa. El tratamiento de los Syn de ratas adultas con el hierro provocó una mayor generación de DAG por hidrólisis de la PC, este aumento fue del 77, 50 y 65% luego de 5, 30 y 60 min de preincubación respectivamente. En forma contraria, la generación de ácidos grasos libres (AGL) se inhibió en un 50% luego de 5 y de 60 min de preincubación con el hierro. Evaluando la generación de DAG en presencia de etanol (actividad de la PC-PLC) y la formación de PEth como marcador de la actividad de la PLD, demostramos que ambas vías enzimáticas contribuyen a la formación de DAG bajo condiciones de estrés oxidativo. El mismo efecto en la generación de DAG y AGL se observó en las terminales sinápticas de ratas seniles. Tampoco se observaron diferencias en los niveles de peroxidación lipídica en los Syn de ratas seniles con respecto a las adultas. La generación de DAG en los Syn de ratas adultas fue independiente de la activación de la vía de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) y de la actividad de tirosinas quinasas. Por otra parte, la inhibición de la fosfolipasa C específica para fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2-PLC) disminuyó significativamente la generación de DAG en los Syn expuestos al Fe2+, sin embargo este efecto no fue mediado por la actividad de las PKCs. La inhibición de las vías metabolizadoras, DAGK y DAG lipasa (DAGL), tampoco modificó los niveles de DAG generados tanto en la condición control como en la experimental, esto se observó en los Syn de ratas adultas y seniles. En conclusión, nuestros resultados demostraron por primera vez la presencia de la PC-PLC en las terminales sinápticas de la corteza cerebral de rata. Nuestros hallazgos constituyen el primer indicio acerca de la activación de las vías de la PC-PLC y de la PLD en condiciones de estrés oxidativo en las terminales sinápticas, representando el punto de partida para el estudio del rol de estas vías de generación de segundos mensajeros lipídicos en los procesos neurodegenerativos. / Phosphatidylcholine (PC) is one of the most abundant glycerophospholipids in cellular membranes and is also the source of second lipid messengers such as diacylglycerol (DAG), phosphatidic acid (PA), arachidonic acid (AA) and lyso phosphatidylcholine (LPC). DAG can mediate key cellular events through the regulation of several proteins such as protein kinase C (PKC), protein kinase D (PKD), chimaerins, Ras guanine-releasing protein (RasGRP), Munc13 and DAG kinase (DAGK). These DAG-regulated proteins participate in cellular functions such as membrane fusion and traffic, inflammation, proliferation, differentiation and cell death. In response to several stimuli, DAG generation through PC hydrolysis can be catalyzed mainly by two enzyme pathways, namely by means of the activation of phospholipase D (PLD, which yields PA which is, in turn, hydrolyzed to DAG by a phosphatidic acid phosphatase type 2 or PAP2) or by means of the action of a PC-specific phospholipase C (PC-PLC) that generates DAG and phophocholine. In view of the above, the main objectives of this thesis were to demonstrate the presence of the PC-PLC pathway in rat cerebral cortex synaptic endings (synaptosomes) and to study the effect of oxidative stress on DAG generation from PC. The results collected were divided into two chapters. Chapter I focuses on the presence of PC-PLC in synaptosomes from adult and aged rats and it includes the characterization of this enzyme activity. It was observed that in synaptosomes (Syn) from adult rats the tensioactive agents Triton X-100 and sodium deoxycholate (DOC) stimulated DAG generation which was highest in the presence of 0.1 % Triton X-100. This concentration enhanced DAG formation by 330% with respect to the control condition. Furthermore, the addition of Ca2+ (2 mM) and Mg2+ (1 mM) decreased DAG generation by 73% and 50%, respectively. In the presence of ethanol (2%) we evaluated the transphosphatidylation reaction produced by PLD which generates phosphatidylethanol (PEth) instead of PA. Under this condition DAG generation was evaluated exclusively from PC-PLC because PEth cannot be hydrolyzed by PAP2. The use of ethanol, PC-PLC inhibitor (D609) and DL-propranolol as PAP2 inhibitor, allowed us to demonstrate that both enzyme pathways (PC-PLC and PLD) participate in DAG generation. After 20 min of incubation PLD pathway generated 40% of total DAG whereas PC PLC generated the remaining 60%. The same contribution was observed in synaptosomes from aged rats. Kinetic studies carried out in the presence of ethanol showed a KM and Vmax values for the synaptosomal PC-PLC of 350 μM and 3.7 nmol DAG x (mg protein x h)-1, respectively. Western blot analysis using an anti-PC-PLC polyclonal antibody raised against Bacillus cereus PC-PLC showed two bands with a molecular weight close to 66 kDa in synaptic endings from adult and aged rats. DAG generation was evaluated in the synaptosomal plasma membrane fraction (SPM). In this fraction DAG generation was increased by 73% with respect to that in synaptosomes. In addition, PC hydrolysis to DAG was negligible in the soluble fraction. By using ethanol it was possible to demonstrate that PC-PLC specific activity was increased by 80% in the SPM fraction with respect to Syn. We also studied PC hydrolysis in the detergent resistant membrane fraction (DRMs). This fraction, which was isolated by treating Syn of adult and aged rats with 1% Triton X-100 at 4C, evidenced characteristics similar to those of rafts, as it was enriched in sphingomyelin and cholesterol as well as in raft marker proteins such as caveolin and c-Src. The DRM fraction also showed a different protein profile from that of Syn. DRMs were also enriched in PLD1 while Slot blot assays showed that PC-PLC was located in Syn and DRM fractions. DAG formation from PC was also observed in DRMs. However, in this fraction the presence of ethanol did not decrease DAG formation. These results indicated that, despite being enriched in PLD1, PLD activity was not detected in DRM fraction. In contrast, PC-PLC activity was 60% higher in DRMs with respect to Syn. Chapter II of this thesis deals with the effect of Fe2+-induced oxidative stress on PC hydrolysis. The incubation of adult rat Syn with FeSO4 (50μM) generated a marked increase in lipid peroxidation which could be observed after short incubation times. Mitochondrial viability and plasma membrane integrity were also affected although these parameters were affected with the oxidative stress inductor after 60 min of incubbtfznÐßKn ulwE 4W#Sv{ E gï erb*was stimulated by FeSO4 (50 μM) after 5, 30 and 60 min of incubation by 77, 50 and 65%, respectively. On the other hand, free fatty acid (FFA) generation was inhibited by 50% after 5 and 60 min of incubation with iron. By measuring DAG generation in the presence of ethanol and PEth formation as a marker of PLD activity, we demonstrated that both enzyme pathways contribute to DAG formation under oxidative stress conditions. The same effect on DAG and FFA formation was observed in synaptic endings from aged rats. No differences in lipid peroxidation levels were observed in aged rats Syn with respect to adult rats. DAG generation in Syn from adult rats was independent of tyrosine kinases activity and of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway. On the other hand, the inhibition of phosphatidylinositol bisphosphate-specific phospholipase C (PIP2-PLC) decreased DAG formation in Syn exposed to Fe2+. However this effect was not mediated by PKC. The inhibition of metabolizing pathways (DAGK and DAG lipase) did not modify DAG levels generated under control and experimental conditjoaf;ÞjisRas# Vved in Syn from adult and aged rats. In conclussion our results demonstrated for the first time the presence of PC-PLC in rat cerebral corte{ |lnfwicàndjkWadpnÞslgeûMer/E58findings constitute the first evidence of PC-PLC and PLC activation in Syn under oxidative stress conditions and represent the starting point for further studies aimed at understanding the role of lipid second messengers in neurodegenerative events.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Corynebacterium pseudotuberculosis es el microorganismo causante de la linfoadenitis caseosa en pequeños rumiantes, así como de la linfangitis ulcerativa y abscesos en equinos y bovinos, causando pérdidas económicas importantes ya que disminuye el rendimiento productivo del ganado. Uno de los principales factores de virulencia de esta bacteria es la presencia de una esfingomielinasa específica, la fosfolipasa D, que favorece la diseminación de la bacteria dentro del hospedero. En este estudio se determina la presencia del gen que codifica esta exotoxina y se cuantifica la capacidad hemolítica de la misma, en aislados de C. pseudotuberculosis obtenidos desde ovinos, caprinos y equinos. Como resultado se obtuvo que existen diferencias dependiendo del origen, lo que puede estar generando las características de expresión de la enfermedad, ya que las cepas de origen ovino tienen mayor capacidad hemolítica que las de otras especies. Se sugiere que la capacidad hemolítica de las diferentes cepas puede estar relacionada con presentaciones clínicas diferentes en las especies animales en estudio y se propone un método de medición cualitativa de hemólisis en placas de agar sangre

Purifica la isoforma ácida presente en el veneno de Bothrops pictus mediante el uso de dos pasos cromatográficos: CM Sephadex C-50 seguido de Superdex 75 10/300 GL, lográndose un rendimiento de 7.5% y un factor de purificación de 19.8 veces. Se obtiene una sola banda con un peso molecular de 16.6 kDa en condiciones reductoras y 15.2 kDa en condiciones no reductoras empleando la técnica de PAGE-SDS. Se determina el peso molecular en solución mediante la técnica de dynamic light scattering obteniéndose una única población de proteínas monodispersa de radio hidrodinámico de 4.254 ± 0.778 (nm) correspondiente a un peso molecular de 19.7 ± 3.7 kDa. La enzima BpicPLA2ácida es altamente termoestable debido a que mantiene casi intacta su actividad incluso después de incubarla por 10 min a 100 ⁰C. El ion que incrementa en mayor medida su actividad es el calcio y el agente con mayor inhibición es el ditiotreitol. Los estudios de dicroísmo circular demostraron que la estructura secundaria predominante en la BpicPLA2ácida son las α hélices. La secuencia de aminoácidos de BpicPLA2ácida tomada del GenBank muestra la presencia de un sitio catalítico (His48, Asp49, Tyr52 y Asp99) conservado, mientras que el sitio de unión a calcio no es completamente conservado, debido a una mutación en la posición 28 de la tirosina por fenilalanina. El modelo de la estructura tridimensional reportado, demuestra que la isoforma BpicPLA2ácida es una enzima que pertenece a la familia de las fosfolipasas A2 de la clase II y que además presenta una mayor relación evolutiva con otras PLA2 ácidas. / Tesis

La acumulación de hierro (Fe) y el estrés oxidativo son eventos patognomónicos de las retinas de pacientes que padecen degeneración macular relacionada con la edad (AMD, del inglés age-related macular degeneration). En este trabajo de tesis hemos caracterizado un modelo de sobrecarga de Fe en retinas bovinas incubadas in vitro con la finalidad de estudiar los eventos que ocurren en la degeneración retiniana provocada por el estrés oxidativo. Específicamente, hemos estudiado la función de las siguientes isoformas de la fosfolipasa A2 (PLA2): la isoforma citosólica (cPLA2), la isoforma independiente de calcio (iPLA2) y la isoforma secretoria (sPLA2), durante la toxicidad retiniana inducida por Fe2+. También analizamos las implicancias de las diferentes PLA2s en la regulación de la ciclooxigenasa (COX)-2, el factor de transcripción nuclear kappa B (NF-κB, del inglés nuclear factor kappa B) y las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAKP, del inglés mitogen-activated protein kinase). En retinas enteras aisladas y expuestas a concentraciones crecientes de Fe2+ (25, 200 o 800 M) o a su vehículo, logramos determinar cuál es la incorporación efectiva de Fe por medio de técnicas analíticas e histoquímicas (espectrometría de emisión atómica por plasma de acoplamiento inductivo y tinción de Perls). El estrés oxidativo asociado a esta incorporación fue evaluado a través del estudio de diversos parámetros, tales como los niveles de peroxidación lipídica, la generación de dienos conjugados, la funcionalidad mitocondrial, la capacidad antioxidante de la retina, y la integridad de la membrana celular. La incorporación de Fe en las retinas fue dependiente de la concentración de Fe2+ utilizada en cada incubación. Esta acumulación de Fe produjo un incremento tiempo- y concentración-dependiente en los niveles de peroxidación lipídica de la retina. Por su parte, la viabilidad mitocondrial solo se vio afectada en menor grado luego de 60 minutos de exposición a la injuria oxidativa. Los niveles de dienos conjugados sufrieron un incremento tiempo-dependiente en tanto que la capacidad de captación de radicales libres solo se vio afectada a altas concentraciones de Fe2+. En concordancia con estos resultados, se observó que la pérdida de la integridad de la membrana celular evidencia un leve incremento en las retinas expuestas a todas las concentraciones de Fe2+ consideradas. Los niveles de peroxidación lipídica, la viabilidad celular y la pérdida de integridad de la membrana celular también fueron analizados en presencia de inhibidores específicos de las distintas isoformas de la PLA2, a saber araquidonoil trifluorometil cetona (ATK, del inglés arachidonoyl trifluoromethyl ketone –inhibidor de la cPLA2–), bromoenol lactona (BEL, del inglés bromoenol lactone –inhibidor de la iPLA2–) e YM 26734 (inhibidor de la sPLA2). La pre-incubación de las retinas con ATK provocó una disminución de los niveles de peroxidación lipídica y también una inhibición de la activación de las proteínas quinasas reguladas por señal extracelular (ERK1/2, del inglés extracellular signal-regulated kinase) a bajas y medianas concentraciones de Fe2+. Por su parte, el inhibidor BEL provocó un aumento en los niveles de peroxidación lipídica y retrasó la activación de las ERK1/2. En cuanto al inhibidor YM 26743, si bien este no demostró tener efecto alguno en la peroxidación lipídica, sí demostró tener la capacidad de retrasar la activación de las ERK1/2. También fue posible observar que ninguno de estos inhibidores afecta la viabilidad celular ni la permeabilidad de la membrana plasmática. Se detectó también una liberación diferencial de ácido araquidónico (AA, del inglés arachidonic acid) y de ácido palmítico (PAL, del inglés palmitic acid) catalizada por la cPLA2 y la iPLA2, respectivamente, en las fracciones microsomales y citosólicas obtenidas a partir de retinas incubadas con Fe2+. En el caso de la cPLA2, demostramos que, en respuesta a la incubación con Fe2+, la forma activa (la forma fosforilada en los residuos de Serina 505) se encuentra asociada principalmente a las fracciones citosólicas y que dicha asociación disminuye en las fracciones microsomales. Fue posible demostrar también que el perfil de liberación de AA producido por la actividad de la cPLA2 se encuentra regulado por acción de las ERK1/2 ya que la inhibición de estas quinasas por medio del inhibidor U0126 provocó la completa abolición de la liberación diferencial del AA. Por otra parte, observamos que la liberación de AA disminuye a la vez que la asociación de la proteína COX-2 aumenta en los microsomas de las retinas expuestas al Fe2+. Se observó también que la sPLA2 se localiza en la fracción citosólica de manera concentración-dependiente. Mediante ensayos de inmunoprecipitación fue posible observar que aumenta la asociación entre la sPLA2 y la proteína COX-2 en las retinas expuestas a la sobrecarga de Fe2+. Sin embargo, a pesar de la mayor asociación de esta proteína con la sPLA2, la generación de prostaglandinas se vio disminuida. Al estudiar los niveles de p65 (RelA) NF-κB encontramos que estos aumentan en las fracciones nucleares de las retinas expuestas a Fe2+. En presencia de los inhibidores ATK e YM 26734, observamos que la localización nuclear de ambas subunidades de NF-κB, p65 y p50, es restaurada a los niveles control en las retinas expuestas al estrés oxidativo inducido por Fe2+. 4 Resumen Los mecanismos de reparación de la membrana también fueron analizados mediante el estudio de la participación de las aciltransferasas en la remodelación fosfolipídica que ocurre durante el estrés oxidativo sufrido por la retina. Los fosfolípidos acídicos, tales como el fosfatidilinositol (PI) y la fosfatidilserina (PS), mostraron una inhibición en el perfil de acilación en las retinas expuestas a Fe2+ mientras que la fosfatidiletanolamina (PE) mostró resultados opuestos. El uso de inhibidores de la PLA2 demostró que la PS es activamente deacilada durante el estrés oxidativo inducido por Fe2+. Nuestros resultados demuestran que las distintas isoformas de la PLA2 participan en diferentes mecanismos regulatorios en este modelo experimental que mimetiza la DME del siguiente modo: i) la cPLA2 promueve el daño inducido por el estrés oxidativo dado que cumple una función en la señalización inflamatoria, liberando AA. ii) La iPLA2 tiene un rol protector debido a que interviene en la remodelación de las membranas mediante la remoción de los ácidos grasos peroxidados, lo cual atenúa los efectos nocivos del Fe2+ sobre las membranas celulares. iii) La sPLA2 Grupo V tiene múltiples blancos intracelulares relacionados con la respuesta inflamatoria porque participa en la regulación del factor NF-κB y de la proteína COX-2. Los hallazgos aquí presentados aportan nuevos conocimientos acerca de los mecanismos moleculares que operan en la degeneración retiniana inducida por el estrés oxidativo. / Iron (Fe) accumulation and oxidative stress are hallmarks of retinas in patients with age-related macular degeneration (AMD). In this thesis work we have characterized an in vitro model of iron-overloaded bovine retinas for the study of retinal degeneration during iron-induced oxidative stress. In particular, we have studied the role of the different phospholipase A2 (PLA2) isoforms, namely cytosolic isoform (cPLA2), calcium-independent isoform (iPLA2) and secretory isoform (sPLA2) during iron-induced retinal toxicity. Furthermore, we have analyzed the implications of PLA2s in the regulation of cyclooxigenase (COX)-2, nuclear factor kappa B (NF-κB) and MAPK pathways. In isolated retinas exposed to increasing Fe2+ concentrations (25, 200 or 800 M) or its vehicle, the effective iron incorporation into retinas was analyzed by means of analytical and histochemical techniques (inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy and Perls´ staining). Oxidative stress associated to this incorporation was also analyzed taking into account several parameters, such as lipid peroxidation and conjugated diene levels, mitochondrial function, anti-oxidant ability and cell membrane integrity. Fe accumulation led to a time- and concentration-dependent increase in retinal lipid peroxidation levels whereas retinal cell viability was only affected after 60 minutes of oxidative injury. Conjugated diene levels underwent a time-dependent increase whereas radical scavenging ability was only affected at high Fe2+ concentrations. In agreement with these results, cell membrane integrity was slightly increased at all Fe2+ concentrations. Retinal lipid peroxidation, cell viability and cell membrane integrity were also analyzed in the presence of specific PLA2 isoform inhibitors, namely arachidonoyl trifluoromethyl ketone (ATK, cPLA2 inhibitor), bromoenol lactone (BEL, iPLA2 inhibitor) and YM 26734 (sPLA2 inhibitor). ATK was found to decrease lipid peroxidation levels as well as ERK1/2 activation. BEL showed the same effect on ERK1/2 activation but the opposite effect on lipid peroxidation. YM 26743 was observed to have no effect on lipid peroxidation although it demonstrated to have the ability to delay ERK1/2 activation. None of these inhibitors was found to affect either cell viability or cell membrane permeability. A differential release of arachidonic acid (AA) and palmitic acid (PAL), catalized by cPLA2 and iPLA2 activities, respectively, was also observed in microsomal and cytosolic fractions obtained from Fe2+-incubated retinas. In the case of cPLA2, we demonstrated that in response to Fe2+ incubation, the active form (the phosphorylated form) is associated mainly to the cytosolic fraction whereas this association is lower in the microsomal fraction. We also demonstrated that AA release profile caused by cPLA2 activity is regulated through ERK1/2 action as shown by the complete abolition of AA differential release through ERK 1/2 inhibition. It was also observed that AA release decreases whereas COX-2 association increases in microsomes of the retinas exposed to Fe2+. It could also be observed that sPLA2 is localized in the cytosolic fraction in a concentration-dependent manner. Via immunoprecipitation assays we demonstrated an increase in the association between sPLA2 and COX-2 in the retinas exposed to Fe2+ overload. Furthermore, in spite of the higher association of COX-2 with sPLA2, prostaglandins generation was found to decrease. The analysis of p65 (RelA) NF-κB levels showed that they increased in the nuclear fractions from the retinas exposed to Fe2+. In the presence of ATK and YM 26734, the nuclear localization of both p65 and p50 NF-κB subunits was found to be restored to control levels in the retinas exposed to Fe2+-induced oxidative stress. Membrane repair mechanisms were also analyzed by studying the participation of acyltransferases in phospholipid remodeling during retinal oxidative stress. Acidic phospholipids, such as phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylserine (PS), were observed to show an inhibited acylation profile in the retinas exposed to Fe2+ whereas phosphatidylethanolamine (PE) showed exactly the opposite. The use of PLA2 inhibitors demonstrated that PS is actively deacylated during Fe2+-induced oxidative stress. Our results demonstrate that the PLA2 isoforms analyzed in this Ph. D. thesis participate in different regulatory mechanisms in our experimental model mimicking AMD. Such participation can be summarized as follows: i) cPLA2 promotes oxidative stress-induced damage by having a role in inflammatory signaling; ii) iPLA2 has a protective role by remodeling membranes to remove peroxidated fatty acids, thus attenuating the harmful effects of Fe2+ on cell membranes; iii) Group V sPLA2 has multiple intracellular targets related to the inflammatory response by its participation in the regulation of NF-κB and COX-2. The findings herein reported provide new knowledge about the molecular mechanisms operating in retinal degeneration induced by oxidative stress.

En la presente investigación se estudian las propiedades, bioquímicas, biológicas, inmunológicas y moleculares de una isoforma básica de Fosfolipasa A2 presente en el veneno de la serpiente peruana Lachesis muta(PLA2básicaL.muta). La purificación se realizó mediante cromatografía de intercambio iónico, filtración y de alta performance; la enzima fue purificada 41,2 veces con un rendimiento de 64%. Se obtuvo una única banda proteica de 14,7 kDa por PAGE-SDS en condiciones reductoras y no reductoras, demostrando ser una proteína monomérica. Su pH óptimo es de 7,8 y es fuertemente inhibida por el PMSF, EDTA y glutatión. En cuanto a su acción biológica, se obtuvo la dosis hemolítica media (DH50) en 4,35µg, la dosis miotóxica mínima (DMM) en 18,96µg/ml y la dosis edemática mínima (DEM) 23,56μg. La enzima no mostró actividad hemorrágica ni acción anticoagulante. Adicionalmente las pruebas de inmunodifusión e inmunoelectroforesis revelaron que PLA2básicaL.muta es reconocida e inhibida parcialmente por el suero monovalente antilachésico (INSPerú). Empleando la metodología de RT-PCR se obtuvo la secuencia completa del cDNA de PLA2básicaL.muta, con 445 pb; análisis bioinformáticos indican que la secuencia posee un marco de lectura abierta de 414 nucleótidos que codifica un péptido señal de 16 aminoácidos y una proteína madura de 122 residuos, el peso molecular fue de 13,86 kDa y un pI de 8,316. La secuencia aminoacídica, contiene residuos conservados para el sitio catalítico, His48, Asp49, Tyr52 así como para unión al Ca+2, Tyr18, Gly30 y Gly32. El modelaje tridimensional de la PLA2, muestra que está formada por tres hélices-, una lámina- y un lazo de unión al Ca+2. PLA2básicaL.muta mostró alta homología estructural con otras sPLA2 de venenos de serpientes. Finalmente, los estudios revelan que la PLA2básicaL.muta pertenece al grupo sPLA2 [Asp49] básicas de bajo peso molecular. Este es el primer estudio que correlaciona la estructura y función de una enzima proveniente del veneno de una serpiente peruana. Palabras claves: Fosfolipasa A2, Isoenzima, Lachesis muta, sitio farmacológico, transcrito. / --- In the present research the biochemical, biological, immunological, as well as molecular properties of a basic isoform of Phospholipase A2 from venom of peruvian snake Lachesis muta (PLA2BasicL.muta), were studied. This enzyme was purified using ion exchange, filtration and high performance chromatographical steps, respectively. The enzyme was purified 41,2 times with a yield of 64%. SDA-PAGE analysis showed a unique protein band of 14,7 kDa under reducing and no reducing conditions indicating that the enzyme is a single polypeptide chain. Furthermore, the enzyme had a optimal pH of 7,8 and was inhibited by PMSF, EDTA and glutation. In relation to its biologic activity, a Medium Hemolytic Doses (DH50) of 4,35µg/tube, Minimum Miotoxic Doses (MMD) of 18,96µg/ml and the Minimum Edematic Doses (MED) of 91,5μg were obtained. For another hand, the PLA2 didn´t show either hemorrhagic or anticoagulant activities, and was recognized and partially inhibited by monovalent antilachesic serum (INS-Perú) by immunodiffusion and immunoelectrophoresis. Using RT-PCR methodology and bioinformátics analysis the complete cDNA sequence of PLA2basicL.muta with 445 bp and an open reading frames of 414 nucleotides, were obtained, which encodes a peptide signal of 16 amino acids and a matured protein of 122 residues with 13, 86 kDa and a pI value of 8,3, calculated by in silico analysis. The amino acidic sequence contains conserved residues of His48, Asp49, Tyr52 in the catalytic site, as well as Tyr18, Gly30 y Gly32 in the Ca+2 -binding site. Three-dimensional model of PLA2basicL.muta showed that was conformed by three α-helix, one β-sheet and one Ca+2 -binding ribbon. PLA2basicL.muta shows a high structural homology with other snake venom phospholipases. Finally, studies reveal that PLA2basicL.muta belongs to the group of lower molecular weigh basic sPLA2 [asp49]. This work is the first study that correlate the structure and function of a Peruvian snake venom enzyme. Key words: Phospholipase A2, Isoenzyme, Lachesis muta, pharmacologic site, transcript. / Tesis

Las enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por la muerte de las neuronas de forma selectiva y progresiva que lleva a la pérdida de funciones primordiales, y muchas veces vitales, en distintas zonas del cerebro. Se desarrollan, por lo general, en una forma familiar hereditaria y una esporádica, siendo esta última la de mayor prevalencia. En líneas generales, presentan ciertas características moleculares que parecen ser comunes a todas ellas: la presencia de estrés oxidativo y agregados patológicos de proteínas, lo que desencadena proteotoxicidad y disfunción mitocondrial. La formación de agregados proteicos intra- o extracelulares ha sido objeto de estudio recurrente en estas patologías. Estas proteínas se encuentran, por lo general, mal plegadas, con predominio de estructuras en lámina β, lo que lleva a la formación de oligómeros en primer lugar, que luego se transforman en fibrillas y, por último, en agregados macromoleculares. La α-sinucleína es una proteína de bajo peso molecular (19 kDa) a la que se le han atribuido diversas funciones biológicas entre las que se encuentran la regulación de la plasticidad sináptica y el flujo y liberación de vesículas sinápticas en el proceso de neurotransmisión. Sin embargo, la sobreproducción de la proteína o su agregación patológica son marcadores comunes en un conjunto de enfermedades neurodegenerativas llamadas sinucleinopatías, entre las que se incluye a la enfermedad de Parkinson. En este trabajo, entonces, buscamos conocer la respuesta neuronal ante la sobreexpresión de la α-sinucleína inducida por dos mecanismos diferentes: la transfección de una línea neuronal con la forma salvaje de la proteína y el tratamiento con un pesticida cuya exposición ha demostrado ser inductora de parkinsonismo. En el primer capítulo, sabiendo que una característica aún no completamente dilucidada es la relación de la α-sinucleína con los lípidos, estudiamos el rol de la vía de la fosfolipasa D1 (PLD1) y su producto, el ácido fosfatídico, en la respuesta a la sobreexpresión de la α-sinucleína. Utilizamos la línea celular IMR32 transfectada con la forma salvaje de la α- sinucleína (WT α-sin) y como controles, la misma línea sin transfectar (st) y transfectada con el vector vacío (vv). La sobreexpresión de la α-sinucleína, que fue de entre 2 y 3 veces mayor que en los controles, provocó una significativa disminución de los niveles del marcador neuronal neurofilamento liviano y alteraciones en el citoesqueleto de actina, todos estos efectos se reflejaron en una disminución en la viabilidad celular de un 20 %, por lo que consideramos que el modelo de trabajo representaba los estadios tempranos de la neurodegeneración asociada a las sinucleinopatías. Se observó que la sobreexpresión de la α-sinucleína causó la disminución tanto de los niveles proteicos como de ARNm de la PLD1, así como también de la actividad de la enzima, lo cual se manifestó con una menor producción de ácido fosfatídico. La inhibición de la PLD1 inducida por el aumento de expresión de la α-sinucleína provocó defectos en la señalización de las quinasas 1 y 2 reguladas por señales extracelulares (ERK1/2) representados por una disminuida expresión y fosforilación de estas quinasas, así como su secuestro en la fracción nuclear. Con estos datos, y para dilucidar una posible relación entre la PLD1, las ERK1/2 y la α-sinucleína, utilizamos un inhibidor farmacológico de la PLD1 en células st y observamos que el inhibidor produjo una disminución en la fosforilación de las ERK1/2 y un cambio en su distribución subcelular, translocando al núcleo en el caso de las células tratadas con inhibidor. Este efecto se vio potenciado en las células WT α-sin, lo que indicaría una relación entre la inhibición de la expresión y la actividad de la PLD1 y la desregulación de la vía de las ERK1/2 con su predominante localización nuclear. El uso de este inhibidor selectivo de la actividad de la PLD1 en neuronas st también demostró que el bloqueo farmacológico de esta vía de señalización provocaba una marcada disminución en la expresión del neurofilamento liviano. En células WT α-sin la inhibición farmacológica de la vía de la PLD1 y de las ERK1/2 provocó una drástica disminución de los niveles del neurofilamento liviano que fueron prácticamente indetectables, potenciándose, de este modo, los resultados hallados en presencia de sobreexpresión de la α-sinucleína. Para corroborar observado, realizamos un ensayo de recuperación de función realizando una transfección transitoria de células WT α-sin con las formas constitutivamente activas de la PLD1, la fosfolipasa D2 y de las ERK1/2 para luego analizar la expresión del neurofilamento liviano. Observamos una recuperación en los niveles de expresión de este neurofilamento en células positivas para PLD1 y ERK1/2 en neuronas WT α-sin. También analizamos la expresión del marcador de apoptosis caspasa-3 clivada que resultó aumentado significativamente cuando se sobreexpresó la PLD1 de forma transitoria. Esto nos llevó a concluir que ante la sobreexpresión de la α-sinucleína las neuronas adoptan una estrategia de supervivencia en detrimento de la pérdida del neurofilamento liviano y, consecuentemente, del fenotipo neuronal. En el segundo capítulo utilizamos el pesticida maneb, un agroquímico asociado con la inducción de síndrome parkinsoniano, y evaluamos su efecto en las líneas celulares vv y WT α-sin. Encontramos que el tratamiento con el pesticida produjo un incremento de la muerte celular acompañado de un aumento de las especies reactivas de oxígeno y de la permeabilidad de la membrana plasmática. La sobreexpresión de la α-sinucleína resultó ser protectora frente al pesticida. Esta observación se vio acompañada por un aumento en la expresión de dos enzimas del sistema de defensa antioxidante, superóxido dismutasa y glutamato-cisteína ligasa. También evaluamos la expresión y la fosforilación de la α-sinucleína, y observamos que el tratamiento con el pesticida aumentó la expresión de esta proteína, algo que no sucedió cuando la proteína ya se encontraba sobreexpresada. La fosforilación de la α-sinucleína se vio significativamente aumentada por tratamiento con maneb en el caso de células vv, y no hubo cambios en las células WT α-sin con respecto al control. También evaluamos la fosforilación de Tau como marcador de neurodegeneración y encontramos que los niveles de pTau aumentaron tanto por exposición al pesticida como por sobreexpresión de la α-sinucleína, siendo aún mayor este incremento en las células WT α-sin tratadas con maneb. También tratamos a las células con el antioxidante N-acetilcisteína para determinar las implicancias del incremento de especies reactivas de oxígeno inducido por maneb en la expresión de la α-sinucleína, y encontramos que efectivamente la expresión de la proteína disminuyó por tratamiento con el antioxidante tanto en células vv como WT α-sin. Para indagar en los mecanismos de señalización involucrados en la respuesta a la toxicidad del pesticida, estudiamos el estado de la vía fosfatidilinositol 3 quinasa/proteína quinasa B/y el factor de transcripción FoxO3a (PI3K/Akt/FoxO3a). Encontramos que Akt incrementaba su expresión en el núcleo con el tratamiento con maneb, de igual manera en células vv y WT α-sin, mientras que su fosforilación se veía incrementada tanto en el citosol como en el núcleo de las dos líneas celulares trabajadas. En el caso de FoxO3a, su expresión se vio aumentada por sobreexpresión de la α-sinucleína y conjuntamente con el tratamiento con maneb; su fosforilación aumentó de forma muy significativa por tratamiento con maneb en ambas líneas celulares. Evaluamos, en último lugar, la alteración de la expresión de FoxO3a y la viabilidad celular por tratamiento con el inhibidor de PI3K LY294002. Encontramos un aumento de la expresión del factor de transcripción por tratamiento conjunto con el inhibidor y el pesticida en las dos líneas celulares. En cuanto a la viabilidad, el tratamiento con inhibidor y pesticida produjo una disminución significativa de igual magnitud tanto en células vv como WT α-sin. Podemos decir entonces que la respuesta al daño inducido por maneb y la protección por sobreexpresión previa de la α-sinucleína en este modelo celular podría estar siendo mediada por la vía PI3K/Akt/FoxO3a. En resumen, en este trabajo de tesis se caracterizó el rol de dos vías de señalización dependientes de la producción de lípidos bioactivos en procesos de daño neuronal asociados con sinucleinopatías. / Neurodegenerative diseases are characterized by neuronal death in a selective and progressive manner leading to the gradual loss of functions in different brain areas. These disorders mostly develop in a sporadic form, being a small percentage due to inheritance. In general, these neurodegenerative disorders have share different molecular features, namely, the presence of oxidative stress and pathological protein aggregates, both of which lead to proteotoxicity and mitochondrial dysfunction. The formation of intra- or extracellular protein aggregates in these pathologies constitutes a subject of recurrent study. These proteins are generally misfolded, with a predominance of β-sheet structures, which leads to the formation of oligomers, fibrils, and, finally, macromolecular aggregates. α-Synuclein is a small protein (19 kDa) that has been extensively studied for its structural and biophysical properties. Several biological functions have been attributed to α-synuclein, namely, the regulation of synaptic plasticity and the flow and release of synaptic vesicles in the neurotransmission process. However, its overexpression and pathological aggregation are hallmarks in a group of neurodegenerative disorders grouped under the name of synucleinopathies, including Parkinson's disease. This thesis work aimed to study the neuronal response to α-synuclein overexpression induced by two different methods: transfection of a neuronal cell line with the wild type form of human α-synuclein and the treatment with an agrochemical pesticide that has been shown to induce parkinsonism. In the first chapter, on the base of the still not fully dilucidated relationship between α-synuclein and lipids, we studied the role of the phospholipase D1 (PLD1) pathway and its product, phosphatidic acid, in the response to α-synuclein overexpression. For this purpose, human IMR32 neuroblastoma cells transfected with either the wild type form of α-synuclein (WT α-syn) or the empty vector (vv), and the untransfected cell line (st) were used as experimental models. WT α-syn cells, which displayed α-synuclein levels 2-3-fold higher than the controls (st and vv), showed a significant decrease in the levels of the neuronal marker neurofilament light chain, alterations in the actin cytoskeleton, and a decreased cell viability of 20%. This characterization allowed us to propose this biological model as representative of early-stage neurodegeneration associated with synucleinopathies. We also observed that α-synuclein overexpression caused a decrease in the protein and mRNA levels of PLD1, as well as in the activity of the enzyme, which was manifested by a lower production of phosphatidic acid. Also, the inhibition of PLD1 induced by α-synuclein overexpression caused an impairment in extracellular signal-regulated kinases (ERK1/2) signaling mainly represented by the decreased expression and phosphorylation of both kinases as well as their sequestration in the nuclear compartment. To elucidate a possible cross-talk between PLD1, ERK1/2, and α-synuclein, we used a pharmacological inhibitor of PLD1 in st cells. In these conditions, PLD1 inhibition caused a decrease in the phosphorylation level of ERK1/2 and a predominantly nuclear localization of these kinases. These effects were enhanced in WT α-syn cells, which would indicate a cross-talk between α-synuclein overexpression-induced PLD1 downregulation and the changes observed in ERK1/2 pathway. Moreover, PLD1 inhibition in st cells also triggered the decreased expression of the neurofilament light chain, and pharmacological inhibition of the PLD1 and ERK1/2 pathways in WT α-syn cells provoked almost the loss of the expression of the neuronal marker, showing potentiated effects in the latter case. To support these findings, we performed function recovery assays by inducing the transient expression of the constitutively active forms of PLD1, phospholipase D2, and ERK1/2 in WT α-syn cells. The restoration of PLD1 and ERK1/2 level in WT α-syn cells was able to recover the expression level of the neurofilament light chain. We also observed that the recovery of neurofilament light chain expression also triggered an increase in the apoptotic marker cleaved caspase-3. This led us to conclude that α-synuclein overexpression triggers a survival strategy in neurons that is characterized by the loss of the neurofilament light chain and, consequently, loss of the neuronal phenotype. In the second chapter, we evaluated the effect of the pesticide maneb, an agrochemical associated with the induction of parkinsonian syndrome, on vv and WT α-syn cells. We found that maneb treatment caused an increase in cell death, accompanied by the generation of reactive oxygen species and increased plasma membrane permeability. The exposure to the pesticide showed to be less harmful in neurons with α-synuclein overexpression than in control cells. The protection exerted by α-synuclein overexpression was accompanied by the increased expression of two enzymes of the antioxidant defense system: superoxide dismutase and glutamate-cysteine ligase. Maneb exposure increased α-synuclein expression and phosphorylation only in vv cells. Tau phosphorylation was also evaluated as a marker of neurodegeneration. p-Tau levels increased both by the exposure to the pesticide and by α-synuclein overexpression, being this increase even greater in the WT α-syn cells. To study the relationship between maneb-induced increase of reactive oxygen species and α-synuclein expression, we utilized the antioxidant N-acetyl-cysteine in our experiments. N-acetyl-cysteine decreased the levels of α-synuclein expression in vv and WT α-syn cells. To investigate the signaling mechanisms involved in the neuronal response to maneb toxicity, we studied the PI3K/Akt/FoxO3a pathway. We found that Akt expression was increased in the nuclear compartment of vv and WT α-syn cells treated with maneb. However, Akt phosphorylation was found to be increased in the cytosolic and nuclear compartments of both cell lines treated with the pesticide. Similar results were observed in FoxO3a expression and phosphorylation in both cell lines.Finally, we evaluated the alteration of FoxO3a expression and cell viability by treatment with the PI3K inhibitor LY294002. We found an increase in the transcription factor expression induced by the cotreatment of maneb and the PI3K inhibitor in vv and WT α-syn cells. In terms of cell survival, the treatment with LY294002, together with the pesticide, produced a similar decrease in cell viability in both cell lines. Based on these results, it can be concluded that the PI3K/Akt/FoxO3a pathway could mediate the response to maneb-induced damage in vv cells and that the neuroprotection exerted by α-synuclein overexpression could be mediated by different mechanisms that still need to be elucidated. In summary, this work characterized the role of two signaling pathways that produce bioactive lipids in neuronal damage processes associated with synucleinopathies. / TESIS PARCIAL en período de teletrabajo

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son los mayores responsables de la secreción y renovación de la matriz extracelular (MEC). Por otro lado, bajo condiciones patológicas como en el post-infarto al miocardio, los fibroblastos cardiacos se diferencian a miofibroblastos, células con un fenotipo mucho más activo en cuanto a la producción de la MEC, además ambos elementos celulares son claves en el desarrollo del remodelamiento cardiaco después de un infarto agudo al miocardio. Una regulación controlada en el crecimiento de la población de fibroblastos y miofibroblastos es importante para una correcta cicatrización y mantención de la función cardiaca. Uno de los mayores reguladores de la población cardiaca es el Sistema Renina-Angiotensina (RAS) y se ha reportado que en una situación post-infarto este sistema se encuentra sobre-activado, específicamente la enzima convertidora de angiotensina y el receptor subtipo AT1 de angiotensina (AT1R). Nuestro modelo experimental consideró sobrexpresar el AT1R en ambos tipos celulares con el uso de adenovirus y evaluar si angiotensina II (Ang II) modula la viabilidad celular. Nuestros resultados demuestran que la estimulación con Ang II conduce a una masiva muerte del fibroblasto cardiaco neonato que sobrexpresa el AT1R (FCN-AdAT1R) de una manera tiempo-dependiente. Ang II gatilla la apoptosis por la vía mitocondrial, promoviendo el aumento de los niveles de Bax, la pérdida del potencial de membrana mitocondrial (mΔψ) y la fragmentación de la caspasa 3. Los efectos producidos por Ang II sobre los FCN-AdAT1R fueron bloqueados por Losartan (antagonista específico AT1R) y por los inhibidores de la vía de la fosfolipasa C -proteínakinasa C (PLC-PKC), U73122 y Gö6976, respectivamente. Por otra parte, los miofibroblastos cardiacos neonatos que sobrexpresan el AT1R (MCN-AdAT1R), fueron menos propensos que los FCN-AdAT1R a los efectos inducidos por Ang II, en cuanto a muerte celular, apoptosis y aumentos en los niveles de Bax. La diferente sensibilidad a la apoptosis producida por Ang II por parte de los MCN-AdAT1R se debió en parte al cambio del fenotipo celular Nuestros resultados demuestran que Ang II ocasiona apoptosis del FCN-AdAT1R por la vía AT1R-PLC-PKC y que esta depende de la vía mitocondrial / The cardiac fibroblasts are main cells involved in secretion and turnover to extracellular matrix protein (ECM). Under pathological conditions characterized by inflammation, as in myocardial infarction, they are differentiated to cardiac myofibroblast, which are cells with a more active phenotype, producing higher ECM protein. Both cellular types are key elements in the development of cardiac remodeling after myocardial infarction. A tight regulation of fibroblast and myofibroblast growth is important to correct wound healing and maintain cardiac function. Renine-angiotensin-system (RAS) is the most important regulator of cardiovascular system, and have been reported that after myocardiac infarction the RAS is up-regulated, specifically angiotensin converting enzyme (ACE) and angiotensin type 1 receptor (AT1R). In our experimental model using adenovirus to overexpress the AT1R in cardiac fibroblast (FCN-AT1R), we evaluated the Ang II effects on cell viability. Ours results show that Ang II triggers FCN-AdAT1R death, in a time-dependent manner. The death cell produced for Ang II in our model was apoptosis by mitochondrial pathway, through an increase Bax expression, loss of mitochondrial membrane potential (mΔψ) and caspase 3 activation. These effects were blocked by Losartan (specific antagonist of AT1R) and by phospholipase C-proteinkinase C (PLC-PKC) inhibitors, U73122 and Gö6976 respectively. For other hand, cardiac myofibroblast that overespressing AT1R (MCN-AdAT1R) were less sensible than FCN-AdAT1R to effect of Ang II on death cell, apoptosis and expression of Bax. The different sensibility to apoptosis Ang II-induced was due to the different phenotype. Ours results show that Ang II triggers apoptosis of FCN-AdAT1R by AT1R-PLC-PKC pathway through mitochondrial disruption

Phosphatidylinositol is a a minor membrane component of eukaryotic cells, however, it plays a crucial role in cell signaling pathways as a precursor for a number of signaling molecules and second messengers. Among the most significant ones are phosphoinositides created by phosphorylation of the hydroxyl groups of phosphatidylinositol at positions 3,4, and 5 of the inositol ring. Despite its significance, the spatial and temporal distribution and dynamics of phosphatidylinositol remains unclear owing mainly to the lack of a specific optical probe (biosensor) to visualize phosphatidylinositol in living cells. Biosensor for inositol phospholipids are based on lipid-binding domains of their effector proteins with high enough affinity and specificity for a given phosphoinositide - but nosuch domain is known for PI. However, an enzyme - phosphatidylinositol-dependent phospholipase C - that specifically recognizes phosphatidylinositol is known. This enzyme catalyzes the hydrolysis of phosphatidylinositol into diacylglycerol and inositol 1-phosphate and unlike eukaryotic homologs does not act upon the phosphorylated forms of phosphatidylinositol. The main aim of this thesis was to solve the structures of several inactive mutant forms of phospholipase C from Bacillus cereus complexed to myo-inositol which...

La inflamación es un factor clave en la patogénesis de diversas enfermedades de la retina que eventualmente terminan en la pérdida de la visión y ceguera, tales como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE), la retinopatía diabética (RD), endolftalmitis bacteriana y la uveítis. En este contexto, las células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) son esenciales para mantener la integridad estructural y funcional de la retina y se ha demostrado que, en estas condiciones patológicas, el EPR puede mediar importantes funciones inmunológicas y participar activamente de la respuesta inflamatoria. El objetivo principal de la presente tesis doctoral fue dilucidar los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta inflamatoria del EPR. En particular nos propusimos estudiar el rol de la vía de la fosfolipasa D (PLD), generadora de mensajeros lipídicos, en dos modelos de injuria inflamatoria: i) inducida por lipopolisacárido (LPS) y ii) por altas concentraciones de glucosa (HG), a modo de simular las hiperglucemias características de la diabetes. En el desarrollo de esta tesis utilizamos dos líneas celulares de EPR de origen humano, las líneas ARPE-19 y D407. Las PLD clásicas hidrolizan fosfatidilcolina (PC) para generar un segundo mensajero lipídico, el ácido fosfatídico (PA) y colina. El PA puede desfosforilarse por las lípido fosfato fosfohidrolasas (LPP) para generar diacilglicerol (DAG), otro lípido bioactivo. Por lo tanto, la vía de PLD/LPP puede modular la actividad de las proteínas que responden al DAG, como las proteínas quinasas C (PKC) y también de proteínas que son moduladas por el PA, como mTOR (del inglés, mammalian target of rapamycin), entre otras. Resultados previos de nuestro laboratorio habían demostrado la activación de la vía PLD y la participación de las isoformas clásicas (PLD1 y PLD2) en la respuesta inflamatoria de las células del EPR expuestas a LPS. En el capítulo I estudiamos el rol de la vía PLD en la activación de la señalización por PKC en las células del EPR expuestas a LPS. Demostramos que ambas PLD clásicas son necesarias para la activación de isoformas convencionales de PKC (α y βII), mientras que la activación de la isoforma novel PKCε solo es dependiente de la PLD1. Evidenciamos además que la PKCε media la supervivencia de las células del EPR expuestas al LPS promoviendo una menor activación de la caspasa-3 y aumentando la expresión de Bcl-2 y la activación de Akt. Por otra parte, las PKCα y β no estarían involucradas en la pérdida de la viabilidad inducida por el LPS. En conclusión, la vía PLD1-PKCε media la supervivencia de las células del EPR previniendo las señales apoptóticas inducidas por el LPS. En el capítulo II caracterizamos el modelo de injuria celular inducido por HG. La exposición de las células del EPR a HG indujo la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), la activación de la caspasa-3 y la disminución de la funcionalidad mitocondrial (parámetro de viabilidad celular). Demostramos además que los niveles elevados de glucosa inducen en las células del EPR la activación temprana y concatenada de la vía PLD y de la quinasa regulada por factores extracelulares (ERK1/2), la fosforilación del inhibidor de κB (IκB) y la activación del factor de transcripción nuclear κB (NFκB). La activación del NFκB inducida por la HG se correlacionó con el incremento en la expresión de los ARNm de interleuquinas (IL) proinflamatorias (IL-6, IL-8) y de la ciclooxigenasa-2 (COX-2). Finalmente, demostramos que en las células del EPR expuestas a HG los inhibidores farmacológicos de PLD1 (VU0359595) y de PLD2 (VU0285655-1) previenen la expresión de los mediadores proinflamatorios, la activación de la caspasa-3 y la reducción en la viabilidad celular. Los resultados obtenidos en las células expuestas a LPS y al modelo de injuria inducida por HG demuestran que el rol de las PLD en las células del EPR difiere según cuál sea el origen de la injuria inflamatoria. Estos hallazgos indican la importancia de conocer los mecanismos moleculares involucrados en la respuesta inflamatoria del EPR desencadenada por distintos estímulos. Nuestros resultados postulan a las isoformas clásicas de PLD como posibles dianas terapéuticas para distintas enfermedades inflamatorias de la retina. / Inflammation is a key factor in the pathogenesis of several retinal diseases that eventually end in vision loss and blindness, such as age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy (DR), retinitis pigmentosa (RP) and uveitis. In this context, retinal pigment epithelial (RPE) cells are essential to maintain the integrity and function of the retina and it has been shown that, under these pathological conditions, RPE cells can mediate important immunological functions and actively participate in the inflammatory response. The main objective of this Ph. thesis was to elucidate the molecular mechanisms involved in the inflammatory response of the RPE. In particular, we wanted to study the role of the lipid messenger generating phospholipase D (PLD) pathway in two inflammatory injury models: i) induced by lipopolysaccharide (LPS) and ii) by high glucose (HG) concentrations, in order to simulate the typical hyperglycemia of diabetes. To this end, we used two human RPE cell lines: ARPE-19 and D407. Classical PLDs hydrolyze phosphatidylcholine (PC) to generate the lipid second messenger, phosphatidic acid (PA), and choline. PA can be further dephosphorylated by lipid phosphate phosphatases (LPP) in order to generate diacylglycerol (DAG), another lipid messenger. Thus, the PLD/LPP pathway can modulate the activity of DAG-responding proteins, such as protein kinases C (PKCs) and PA-responding proteins such as mTOR (mammalian target of rapamycin), among others. Previous results from our laboratory demonstrated the activation of the PLD pathway and the participation of classical PLD isoforms (PLD1 and PLD2) in the inflammatory response of RPE cells exposed to LPS. In the first chapter of this thesis, we studied the role of the PLD pathway in the activation of LPS-induced PKC signaling in RPE cells. We demonstrated that both PLDs are necessary for the activation of conventional PKC isoforms (PKCα/βII) while the activation of the novel PKCε is dependent only on PLD1. We also showed that PKCε mediates the survival of RPE cells exposed to LPS by promoting less activation of caspase-3 and increasing Bcl-2 expression and activation of Akt. In contrast, PKCα and β may not be involved in the cell viability loss induced by LPS. In conclusion, the PLD1-PKCε pathway mediates RPE cell survival by preventing apoptotic signals induced by LPS. In chapter II we characterized the model of cellular injury induced by HG. RPE cell exposure to HG induced reactive oxygen species (ROS) generation, caspase-3 activation and reduced mitochondrial functionality (cell viability parameter). We also demonstrated that in RPE cells high glucose levels induce the early and concatenated activation of the PLD pathway and of extracellular signal regulated kinase (ERK1/2), the phosphorylation of inhibitor of κB (IκB) and the activation of nuclear factor κB (NFκB). The activation NFκB induced by HG was found to correlate with the increased expression of proinflammatory interleukins (IL-6, IL-8) and cyclooxygenase-2 (COX-2) mRNA. Finally, we demonstrated that in RPE cells exposed to HG pharmacologycal inhibitors of PLD1 (VU0359595) and PLD2 (VU0285655-1) prevent the expression of proinflammation mediators, the activation of caspase-3 and the reduction in cell viability. The results obtained in RPE cells exposed to LPS and in the model of cellular injury induced by HG demonstrate that the role of PLD isoforms in RPE cells differs depending on the origin of the inflammatory injury. These findings indicate the importance of knowing the molecular mechanisms involved in the RPE inflammatory response elicited by different stimuli. Our results postulate classical PLD isoforms as possible therapeutic targets for several retinal inflammatory diseases. / TEXTO PARCIAL en período de teletrabajo