A 2,8-DHA Urolitíase é uma doença resultante de uma desordem hereditária que leva a deficiência de atividade da enzima APRT do grupo das PRTases. Até o momento, foram encontradas 18 mutações em pacientes, das quais 7 são missense. O presente trabalho dedica-se ao estudo funcional e estrutural dessas 7 mutações e da deleção ΔF173. Construções dos mutantes D65V, L110P, M136T, R67Q, R89Q, I112F e F173G foram obtidas no vetor pET-29a(+) e clonados em E. coli. Os protocolos de expressão e purificação foram estabelecidos, onde as enzimas foram obtidas após uma etapa cromatográfica na coluna CHTTM Hidroxiapatita Cerâmica no grau de pureza necessário. A única exceção foi o mutante I112F que se mostrou insolúvel durante a expressão. Um ensaio cinético acoplado através de kit para detecção de PPi foi padronizado e permitiu a caracterização cinética da hAPRT nativa e de seu mutantes. Os mutantes apresentaram perdas de eficiência de uma ordem de magnitude, com exceção do F173G, cujos valores foram comparáveis aos da hAPRT nativa. Ensaios de cristalização foram realizados para todos os mutantes e resultaram em cristais para os mutantes F173G, R67Q e R89Q. Esses cristais foram coletados na linha de Cristalografia de Macromoléculas 2 no LNLS. Os conjuntos de dados estão sendo analisados e as estruturas estão em fase final de refinamento. / 2,8-DHA Urolithiasis is a disease resulting from an inherited disorder that leads to deficiency of APRT, an enzyme of the PRTases group. So far, 18 mutations were found in patients, 7 of which are missense. This work is dedicated to the functional and structural study of these 7 mutations and the deletion ΔF173. Mutants constructions D65V, L110P, M136T, R67Q, R89Q, I112F and F173G were obtained in the vector pET-29a (+) and cloned in E. coli. The expression and purification protocols were established and the enzymes were obtained after 1 chromatographic step using the CHTTM Hydroxyapatite Ceramics column in the required purity. The only exception was the mutant I112F that resulted insoluble during expression. A coupled kinetic assay using PPi detection kit was standardized and allowed the kinetic characterization of native hAPRT and its mutants. The mutants had an efficiency loss of an order of magnitude, with the exception of F173G, whose values were comparable to those of native hAPRT. Crystallization trials were performed for all mutants and resulted in crystals for mutants F173G, R67Q and R89Q. These crystals were collected on Macromolecules Crystallography 2 line at LNLS. The datasets are being analyzed and the structures are in the final stages of refinement.

A 2,8-DHA Urolitíase é uma doença resultante de uma desordem hereditária que leva a deficiência de atividade da enzima APRT do grupo das PRTases. Até o momento, foram encontradas 18 mutações em pacientes, das quais 7 são missense. O presente trabalho dedica-se ao estudo funcional e estrutural dessas 7 mutações e da deleção ΔF173. Construções dos mutantes D65V, L110P, M136T, R67Q, R89Q, I112F e F173G foram obtidas no vetor pET-29a(+) e clonados em E. coli. Os protocolos de expressão e purificação foram estabelecidos, onde as enzimas foram obtidas após uma etapa cromatográfica na coluna CHTTM Hidroxiapatita Cerâmica no grau de pureza necessário. A única exceção foi o mutante I112F que se mostrou insolúvel durante a expressão. Um ensaio cinético acoplado através de kit para detecção de PPi foi padronizado e permitiu a caracterização cinética da hAPRT nativa e de seu mutantes. Os mutantes apresentaram perdas de eficiência de uma ordem de magnitude, com exceção do F173G, cujos valores foram comparáveis aos da hAPRT nativa. Ensaios de cristalização foram realizados para todos os mutantes e resultaram em cristais para os mutantes F173G, R67Q e R89Q. Esses cristais foram coletados na linha de Cristalografia de Macromoléculas 2 no LNLS. Os conjuntos de dados estão sendo analisados e as estruturas estão em fase final de refinamento. / 2,8-DHA Urolithiasis is a disease resulting from an inherited disorder that leads to deficiency of APRT, an enzyme of the PRTases group. So far, 18 mutations were found in patients, 7 of which are missense. This work is dedicated to the functional and structural study of these 7 mutations and the deletion ΔF173. Mutants constructions D65V, L110P, M136T, R67Q, R89Q, I112F and F173G were obtained in the vector pET-29a (+) and cloned in E. coli. The expression and purification protocols were established and the enzymes were obtained after 1 chromatographic step using the CHTTM Hydroxyapatite Ceramics column in the required purity. The only exception was the mutant I112F that resulted insoluble during expression. A coupled kinetic assay using PPi detection kit was standardized and allowed the kinetic characterization of native hAPRT and its mutants. The mutants had an efficiency loss of an order of magnitude, with the exception of F173G, whose values were comparable to those of native hAPRT. Crystallization trials were performed for all mutants and resulted in crystals for mutants F173G, R67Q and R89Q. These crystals were collected on Macromolecules Crystallography 2 line at LNLS. The datasets are being analyzed and the structures are in the final stages of refinement.

Esta tese apresenta em sua introdução uma revisão bibliografia sobre a importância das enzimas Fosforribosil-transferases (PRTases) para a homeostase tanto em células de mamíferos como em células de protozoários Kinetoplastidas. É ressaltada a estreita relação entre mutações pontuais encontradas no gene da enzima Adenina Fosforribosiltransferase (APRT) e a doença humana Dihidroxiadenina Urolitiase. A doença leishmaniose, causada por Kinetoplastidas do gênero Leishmania, é descrita indicando a possível utilização das enzimas da via de recuperação de purinas como alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos contra leishmaniose. Os experimentos descritos nesta tese, visam a produção heteróloga da enzima (APRT) de Homo sapiens, elucidação da estrutura cristalográfica e análise estrutural das mutações encontradas em pacientes com Dihidroxiadenina Urolitiase. A proteína homóloga de Leishmania terentolae também foi objetivo de estudo. Com essa APRT, os experimentos descritos nesta tese visam a elucidação da estrutura tridimensional e a utilização da enzima na busca de novos inibidores de PRTases. Os resultados apresentados nesta tese mostram que os objetivos do estudo foram alcançados. A elucidação da estrutura da APRT de H. sapiens possibilitou discutir as prováveis alterações estruturais provocadas pelas mutações pontuais do gene da APRT. Novos inibidores de PRTases de Leishmania foram obtidos. Adicionalmente, os inibidores das enzimas foram testados em culturas de Leishmania major promastigota e promoveram inibição do crescimento do parasita. / This thesis in its introduction presents a brief bibliografic revision about the importance of the phosphoribosyltransferase enzyme (PRTases) to cellular homeostasis, both in mammalian cell as in the protozoa Kinetoplastida. It is emphasized the close relation between point mutatons found in the gene coding for Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) and disease Dihidroxiadenine Urolitiasis. The deseases leishmaniasis, caused by Kinetoplastidae beloing to the Leishmania genera, is described indicating the possible use of the purine salvage pathway (PRTases) as targets for the future development of novel drugs against leishmaniasis. The experience described in this thesis aims at the heterologous production of the enzyme APRT of Homo sapiens, its crystallographic structure elucidation and structural analysis of mutations found in patient with Dihidroxiadenine Urolitiasis. The Leishmania tarentolae homologue was also the aim of this work. With this APRT the experiments describes in this thesis aim at the structural resolution of the enzyme and its use in the screening for novel PRTases inhibitors. The results presented in this thesis show that the objectives of the work have been achieved. The structural elucidation of the human APRT allowed the discussion of the potential modifications caused bu the point mutations in the APRT gene. Novel inhibitors of PRTases of Leishmania major promastigote cultures and promoted the growth inhibition of this parasite.

Esta tese apresenta em sua introdução uma revisão bibliografia sobre a importância das enzimas Fosforribosil-transferases (PRTases) para a homeostase tanto em células de mamíferos como em células de protozoários Kinetoplastidas. É ressaltada a estreita relação entre mutações pontuais encontradas no gene da enzima Adenina Fosforribosiltransferase (APRT) e a doença humana Dihidroxiadenina Urolitiase. A doença leishmaniose, causada por Kinetoplastidas do gênero Leishmania, é descrita indicando a possível utilização das enzimas da via de recuperação de purinas como alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos contra leishmaniose. Os experimentos descritos nesta tese, visam a produção heteróloga da enzima (APRT) de Homo sapiens, elucidação da estrutura cristalográfica e análise estrutural das mutações encontradas em pacientes com Dihidroxiadenina Urolitiase. A proteína homóloga de Leishmania terentolae também foi objetivo de estudo. Com essa APRT, os experimentos descritos nesta tese visam a elucidação da estrutura tridimensional e a utilização da enzima na busca de novos inibidores de PRTases. Os resultados apresentados nesta tese mostram que os objetivos do estudo foram alcançados. A elucidação da estrutura da APRT de H. sapiens possibilitou discutir as prováveis alterações estruturais provocadas pelas mutações pontuais do gene da APRT. Novos inibidores de PRTases de Leishmania foram obtidos. Adicionalmente, os inibidores das enzimas foram testados em culturas de Leishmania major promastigota e promoveram inibição do crescimento do parasita. / This thesis in its introduction presents a brief bibliografic revision about the importance of the phosphoribosyltransferase enzyme (PRTases) to cellular homeostasis, both in mammalian cell as in the protozoa Kinetoplastida. It is emphasized the close relation between point mutatons found in the gene coding for Adenine phosphoribosyltransferase (APRT) and disease Dihidroxiadenine Urolitiasis. The deseases leishmaniasis, caused by Kinetoplastidae beloing to the Leishmania genera, is described indicating the possible use of the purine salvage pathway (PRTases) as targets for the future development of novel drugs against leishmaniasis. The experience described in this thesis aims at the heterologous production of the enzyme APRT of Homo sapiens, its crystallographic structure elucidation and structural analysis of mutations found in patient with Dihidroxiadenine Urolitiasis. The Leishmania tarentolae homologue was also the aim of this work. With this APRT the experiments describes in this thesis aim at the structural resolution of the enzyme and its use in the screening for novel PRTases inhibitors. The results presented in this thesis show that the objectives of the work have been achieved. The structural elucidation of the human APRT allowed the discussion of the potential modifications caused bu the point mutations in the APRT gene. Novel inhibitors of PRTases of Leishmania major promastigote cultures and promoted the growth inhibition of this parasite.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:38:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruna Lovizutto Protti Wohlke.pdf: 1421829 bytes, checksum: 1654b1beeb77d5566e82213f52b50a17 (MD5) Previous issue date: 2012-03-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A malária continua a ser a maior causa de morbidade e mortalidade mundial com até três milhões de mortes anuais. O tratamento da malária, causada por Plasmodium. falciparum, dependeu por décadas do uso da aminoquinolina cloroquina. Contudo a resistência à cloroquina em uma escala global expôs a capacidade com que o parasita pode desenvolver resistência a drogas. É, portanto, necessário o desenvolvimento de estudos que assegurem que drogas mais eficazes sejam descobertas de forma sustentável e que novos alvos moleculares para agentes antimalária sejam revelados. Através de análises de biologia celular e molecular foi possível sequenciar o genoma de P. falciparum e identificou-se novos alvos alvos terapêuticos antimalária. A proteína alvo estudada neste projeto foi a Hipoxantina guanina fosforribosiltransferase do P. falciparum, que está relacionada com a via de recuperação das purinas .O gene da enzima foi identificado no genoma do P. falciparum, e produzido por síntese química com códons preferenciais de Escherichia coli, clonado em um forte promotor de expressão para esta bactéria, expresso e a proteína recombinante purificada mostrou-se ativa. A enzima será utilizada futuramente em estudos de binding e inibição com novos compostos químicos e/ou componentes de extratos de microrganismos e plantas amazônicas

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Francisco Javier Medrano Martin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T15:38:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dantas_DeysedeSouza_D.pdf: 4937353 bytes, checksum: 5c9b26f6ef8ed34e974ca6c8bb0708f2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os genes que codificam para a 6-oxopurina fosforribosiltransferase (HPRT, EC2.4.2.8) dos organismos Pyrococcus horikoshii e Schistosoma mansoni foram clonados em vetores de expressão. As proteínas foram expressas e purificadas em larga escala no sistema de expressão de Escherichia coli. Estudos cinéticos mostraram que a enzima de P. horikoshii é capaz de usar hipoxantina, guanina e xantina. Os dois primeiros substratos apresentam uma eficiência catalítica semelhante. A xantina apresenta um valor menor (ao redor de 20 vezes mais baixo), mas a constante catalítica é comparável com a da hipoxantina. A proteína não foi capaz de se ligar a GMP-agarose, mas sim pode ligar o outro substrato da reação reversa, pirofosfato inorgânico, com baixa afinidade (Kd = 4,7 ± 0,1 mM). Os dados de espalhamento dinâmico de luz, gel filtração e espalhamento de raios X a baixo ângulo mostram que esta proteína é um homohexâmero em solução. Este hexâmero é compacto e resistente à ação limitada de enzimas proteolíticas. Estudos de estabilidade frente a agentes químicos mostraram que a proteína é bastante estável resistindo os efeitos da uréia sem desenovelar completamente com a maior concentração do agente (8,0 M). Os dados obtidos com cloreto de guanidina mostraram que a proteína possui, no mínimo, um estado intermediário de desnaturação, como mostram os diferentes perfis obtidos com as diferentes técnicas usadas nos estudos de desnaturação. Os dados preliminares obtidos com a HPRT de S. mansoni mostraram que, na presença da cauda de histidinas, a proteína está presente como um octâmero alongado. Mas, muito provavelmente ela deve ser um tetrâmero. A presença de caudas fusionadas nas proteínas recombinantes pode afetar a estrutura e função das proteínas / Abstract: The genes that code for the 6-oxopurine phosphoribosyltransferase (HPRT, EC2.4.2.8) from the organisms Pyrococcus horikoshii and Schistosoma mansoni were cloned in expression vectors. The proteins were expressed and purified in large scale in the de Escherichia coli expression system. Kinetic studies showed that the enzyme from P. horikoshii is able to use hypoxanthine, guanine and xanthine. The first two substrates show a similar catalytic efficiency. Xanthine show a lower value (around 20 times), but the catalytic constant is comparable to that of hypoxanthine. The protein was unable to bind to GMP-agarose, but was able to bind the other substrate of the reverse reaction, inorganic pyrophosphate, with low affinity (Kd = 4.7 ± 0.1 mM). Dynamic light scattering, gel filtration and small angle X-ray scattering data show that the protein is a homohexamer in solution. This hexamer is compact and resistant to the limited action of proteolytic enzymes. Stability studies with chemical agents showed that the protein is very stable being able to stand the effects of urea without unfolding completely at the highest agent concentration (8.0 M). Data obtained with guanidine hydrochloride showed that the protein presents, at least, one unfolding intermediate state, as can be seen with the different profiles obtained with different techniques used in the unfolding studies. Preliminary data obtained from HPRT from S. mansoni showed that in the presence of the histidine tag, is present as a long octamer. But, most likely it should be a tetramer. The presence of histidine tag fused to the recombinant proteins could affect the structure and function of proteins / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

O presente trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e purificação da proteína HGPRT de Leishimania tarentolae, para a caracterização e cristalização dessa enzima, a fim do seu estudo estrutural e funcional. O gene da HGPRT foi amplificado a partir de uma biblioteca genômica de Leishmania tarentolae da cepa UC Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I. Esse gene foi clonado no vetor de expressão pET29a(+) e usado na transformação da bactéria Escherichia coli BL21 (DE3). Esse sistema de expressão apresentou uma superexpressão da proteína recombinante, que foi purificada em cromatografia de forma iônica, com o uso da coluna de troca anônica POROS 20HQ. A proteína purificada foi utilizada para sua caracterização, como a determinação das constantes cinéticas (Km, Vmax e Kcat) para os diferentes substratos. A proteína foi encontrada como dímero em solução e o pI de aproximadamente 8,2. Além disso, essa proteína foi utilizada nos ensaios de cristalização pelo método de difusão de vapor em gotas suspensas. Os cristais obtidos foram utilizados nos testes da difração de raios-X sendo coletado um conjunto de dados no Laboratório Nacional de Luz Síncroton. Os dados de difração de raios-X foram processados com o uso do pacote de programa HKL. A resolução da estrutura cristalográfica foi obtida pelo método de substituição molecular através do programa AmoRe. Para o refinamento da estrutura foram utilizados os programas de refinamento automático CNS e REFMAC, e a manipulação na estação gráfica foi realizada através do programa O. A estrutura da HGPRT foi resolvida a 2,1 &#197 de resolução com os fatores de concordância Rwork e Rfree finais de 17,34 e 21,53%, respectivamente. / The aims of this work were the cloning, expression and purification of the protein HGPRT from Leishimania tarentolae, for the characterization and crystallization of the enzyme for it structural and functional study. The full-length hgprt gene was isolated from a leishmania tarentolae UC strain Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I genomic library. This gene was cloned in the expression vector pET29a+, and used in the transformation of the bacteria Escherichia coli BL21(DE3). This expression system presented a super-expression of the recombinant protein, which was purified by ionic change chromatography, utilizing the anionic change column POROS 20HQ. The purified protein was utilized for its characterization, including its kinetics constants (Km, Vmax e Kcat) for different substrates. The protein was found to be a dimmer in solution with pI close to 8.2. Besides, this protein was used in the crystallization assays by the steam diffusion in suspended drop technique. The obtained crystals were utilized in the x-ray diffraction studies. The data collection was performed in the Laboratório Nacional de Luz Síncroton. The X-ray diffraction data were processed utilizing the package program HKL. The crystallographic structure resolution was obtained by the molecular replacement method from the AmoRe program. For the structure refinement, the automatic refinement programs CNS and REFMAC were used, and the graphic manipulation was made through the O program. The structure of the HGPRT was resolved with 2,1 &#197 of resolution and final agreement factors Rwork and Rfree of 17,34% and 21,53%, respectively.

O presente trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e purificação da proteína HGPRT de Leishimania tarentolae, para a caracterização e cristalização dessa enzima, a fim do seu estudo estrutural e funcional. O gene da HGPRT foi amplificado a partir de uma biblioteca genômica de Leishmania tarentolae da cepa UC Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I. Esse gene foi clonado no vetor de expressão pET29a(+) e usado na transformação da bactéria Escherichia coli BL21 (DE3). Esse sistema de expressão apresentou uma superexpressão da proteína recombinante, que foi purificada em cromatografia de forma iônica, com o uso da coluna de troca anônica POROS 20HQ. A proteína purificada foi utilizada para sua caracterização, como a determinação das constantes cinéticas (Km, Vmax e Kcat) para os diferentes substratos. A proteína foi encontrada como dímero em solução e o pI de aproximadamente 8,2. Além disso, essa proteína foi utilizada nos ensaios de cristalização pelo método de difusão de vapor em gotas suspensas. Os cristais obtidos foram utilizados nos testes da difração de raios-X sendo coletado um conjunto de dados no Laboratório Nacional de Luz Síncroton. Os dados de difração de raios-X foram processados com o uso do pacote de programa HKL. A resolução da estrutura cristalográfica foi obtida pelo método de substituição molecular através do programa AmoRe. Para o refinamento da estrutura foram utilizados os programas de refinamento automático CNS e REFMAC, e a manipulação na estação gráfica foi realizada através do programa O. A estrutura da HGPRT foi resolvida a 2,1 &#197 de resolução com os fatores de concordância Rwork e Rfree finais de 17,34 e 21,53%, respectivamente. / The aims of this work were the cloning, expression and purification of the protein HGPRT from Leishimania tarentolae, for the characterization and crystallization of the enzyme for it structural and functional study. The full-length hgprt gene was isolated from a leishmania tarentolae UC strain Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I genomic library. This gene was cloned in the expression vector pET29a+, and used in the transformation of the bacteria Escherichia coli BL21(DE3). This expression system presented a super-expression of the recombinant protein, which was purified by ionic change chromatography, utilizing the anionic change column POROS 20HQ. The purified protein was utilized for its characterization, including its kinetics constants (Km, Vmax e Kcat) for different substrates. The protein was found to be a dimmer in solution with pI close to 8.2. Besides, this protein was used in the crystallization assays by the steam diffusion in suspended drop technique. The obtained crystals were utilized in the x-ray diffraction studies. The data collection was performed in the Laboratório Nacional de Luz Síncroton. The X-ray diffraction data were processed utilizing the package program HKL. The crystallographic structure resolution was obtained by the molecular replacement method from the AmoRe program. For the structure refinement, the automatic refinement programs CNS and REFMAC were used, and the graphic manipulation was made through the O program. The structure of the HGPRT was resolved with 2,1 &#197 of resolution and final agreement factors Rwork and Rfree of 17,34% and 21,53%, respectively.