Terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica pouco invasiva e sem efeitos térmicos aprovada para o tratamento de doenças neoplásicas e vasculares proliferativas, capaz de produzir necrose tecidual seletiva através de administração de um fármaco fotossensibilizador seguido da aplicação de luz em comprimento de onda adequado. Na presença de luz o fotossensibilizador passa à forma ativada, e na presença de oxigênio molecular presente nas células, produz espécies reativas de oxigênio e oxigênio singleto que induzem as células alteradas à morte. O melhor entendimento dos mecanismos e da resposta celular à TFD, a disponibilidade de fontes de luz mais baratas, confiáveis e de fácil manuseio, bem como bons resultados em pesquisa clínica, dão credibilidade à técnica e a sua difusão na prática clínica. Estudos recentes em dosimetria têm mostrado melhores resultados terapêuticos com o fracionamento da dose de luz uma vez que permite a reoxigenação dos tecidos durante o período em que esse não está sendo iluminado. Neste estudo, investigou-se o dano tecidual (profundidade de necrose) e os danos celulares, especificamente na mitocôndria (estado 3, estado 4, taxa do controle respiratório, relação de ADP/O, potencial de membrana e intumescimento ou ?swelling?) do fígado normal de rato submetendo-o a regime de fracionamento da dose de luz. Vinte e cinco ratos Wistar receberam 1.5 mg/kg do fotossensibilizador Photogem 30 minutos antes da iluminação com laser de diodo (? = 630nm), potência 200 mW, intensidade 250 mW/cm2 e dose total fixa de 200 J/cm2. Os animais foram divididos em 5 grupos de 5 animais, cada um sendo iluminado em intervalos diferentes de claro (C) e escuro (E): 800s, 400s, 200s, 100s e 50s, alternando, respectivamente nesses grupos, os períodos de C/E em 800s/0s, de 400s/400s, de 200s/200s, de 100s/100s e de 50s/50s. Os animais foram mortos 30 horas após a aplicação do Photogem. O tecido iluminado foi submetido à análise histológica. As lâminas histológicas mostraram uma tendência de aumento na profundidade de necrose, com um aumento de até 30% em comparação ao regime contínuo e também uma tendência de diminuição na RCR e na relação ADP/O em função do tempo de escuro, principalmente até 200s do intervalo de C/E. Com tempo do fracionamento menor, as tendências de ADP/O e de RCR se invertem. O intumescimento e o potencial de membrana não mostraram diferença significativa com os diferentes regimes de iluminação. Conclui-se que o aumento de eficiência em PDT devido ao fracionamento da dose de luz é proporcionado pela maior disponibilidade de oxigênio na área tratada o que pode ocorrer pela reversão da oclusão vascular provisória ou do menor consumo de oxigênio pela reação fotodinâmica até o esquema do fracionamento da dose de luz de 200s. Para intervalos de escuro maiores tem-se uma limitação da reposição do oxigênio com conseqüente redução dos danos mitocondriais. O regime de fracionamento de dose de luz melhora a eficácia da técnica de PDT e mostra uma relação causal com a profundidade de necrose, embora a determinação da extensão dos intervalos de escuro seja fundamental para o sucesso da técnica. / Photodynamic therapy is a promising minimally invasive and non-thermal therapeutic modality approved for the treatment of neoplastic and vascular disease, which produces localized tissue necrosis with light following admistration of a photosensitizing drug. The drug is activated by light of a specific wavelength. The activated photosensitizer, in the presence of oxygen, generates singlet oxygen and reactive oxygen species that will induce selected cells to death. The current best understanding of PDT mechanisms and cellular response, the availability of cheaper, trustworthy and easy handling sources of light, as well as good results in clinical investigations, had provided trustworthiness to the technique and its diffusion in clinical practice. Recent dosimetry studies had suggested better therapeutical results with dose light fractionation. In this study, it was investigated the tissue damage (depth of necrosis) and cellular damage specifically in the mitochondria (state 3, state 4, respiratory control rate (RCR), ADP/O ratio, swelling and membrane potencial) in normal rat liver submitted to the fractionation of the light dose scheme. Twenty five Wistar rats received 1,5 mg/kg of the first generation Russian photossensitizer Photogem® 30 minutes before illumination with diode laser (? = 630nm), power 200 mW, fluence rate 250 mW/cm2 and fluence 200 J/cm2. Animals had been divided into 5 groups of 5 animals each, being illuminated in different intervals of light and dark (L/D): 800s, 400s, 200s, 100s and 50s, for each one had respectively alternated light/dark photodynamic therapy intervals of 800s/0s, 400s/400s, 200s/200s, 100s/100s and 50s/50s. The rats were sacrificed 30 hours after Photogem application. The illuminated tissue was submitted to histological analyze. The histological sections of the illuminated tissue volume showed a trend toward increasing depth of necrosis (increase 30%) as well as decreasing in RCR and ADP/O as a function of the increase in the dark interval, mainly until 200s of light interval. With lower fractionation time the trends of ADP/O and RCR becomes inverted. Swelling and membrane potencial did not show significant difference in all fractionation schemes. It can be concluded that the enhancement of PDT efficiency by the fractionation of light is due to improved oxygen supply to the treated area, which may be due to the reversal of the temporary vascular occlusion or slower photochemical consumption of oxygen until 200s fractionation scheme. For higher light intervals there is a limitation in the oxygen replenishment leading to a reduction of the mitochondrial damage. A fractionated light dose delivery can enhance PDT efficiency with Photogem and presents a causal relation with necrosis depth, although the determination of the extension of the dark intervals is fundamental for the success of technique.

A Terapia Fotodinâmica consiste em uma nova e promissora técnica de diagnóstico e tratamento de tumores malignos. O tratamento se baseia na administração intravenosa de um fotossensibilizador que acumula-se seletivamente em tecido tumoral, sendo a seguir excitado com luz visível gerando espécies tóxicas às células levando-as à morte. Neste trabalho estudou-se o Photodithazine (PDZ), uma nova droga fotossensibilizadora produzida na Rússia que consiste de um derivado hidrossolúvel de mono-L-aspartil clorina, com potencial aplicação em Terapia Fotodinâmica (PDT). A fotodegradação do PDZ foi induzida em diferentes condições e a citotoxicidade do PDZ não irradiado e previamente irradiado foi investigada na ausência (escuro) e presença de luz (claro) em células normais (VERO) e tumorais (HEp-2). A fotodegradação do PDZ foi induzida com laser (488 e 514 nm) e com LED (630 nm). Quando PDZ é fotodegradado ocorre uma diminuição da intensidade de absorção e fluorescência e o aparecimento de uma nova banda de absorção em 668nm, o que sugere transformações químicas que levam à formação de fotoprodutos. Análises realizadas através do método CCA (Convex Constrain Analysis) demonstraram que existem duas espécies distintas, uma que se degrada e outra que se forma (fotoprodutos) em função do tempo. Observa-se também que a fotodegradação do PDZ é mais rápida em 630nm seguida de 514 e 488nm. Comparando-se estes resultados com o Photogem® (fotossensibilizador aprovado para uso em PDT no Brasil), nota-se que o PDZ não apresenta agregação numa ampla faixa de concentração, absorve em comprimento de onda maior do que o Photogem® e fotodegrada em tempo menor. O estado de agregação do PDZ depende do pH e em soluções ácidas apresenta-se agregado. Estudos na presença de surfactantes mostraram que os processos de degradação e formação de fotoprodutos do PDZ apresentaram comportamento diferente do que em PBS. Experimentos com azida sugerem que a fotodegradação do PDZ ocorre pelo mecanismo tipo II, via formação de oxigênio singlete. O tempo de incubação do fotossensibilizador nas células e a presença de soro afetam a citotoxicidade do PDZ nas células normais e tumorais, na ausência ou presença de luz. Quando PDZ é irradiado ocorre uma diminuição da citotoxicidade nas células VERO e HEp-2 no escuro em função do tempo de irradiação, ou seja, os valores de IC50 aumentam 26, 14 e 34% nos comprimentos de onda 488, 514 e 630nm, respectivamente. Entretanto, o aumento do IC50 para as células HEp-2 é de aproximadamente 58% contra 25% para as células VERO. No estudo citotóxico no claro, o aumento do tempo de incubação e tempo de irradiação aumentam a citotoxicidade do PDZ não irradiado. No claro, a citotoxicidade do PDZ é enormemente potencializada pela luz tanto para as células VERO quanto para as células HEp-2. Com o aumento do tempo de exposição da solução de PDZ à luz a citotoxicidade do fotossensibilizador no claro aumenta discretamente para ambas linhagens. Verificou-se que os fotoprodutos formados após a irradiação do PDZ são menos citotóxicos no escuro (2,2 vezes) do que o PDZ não irradiado e cerca de 18 vezes mais citotóxicos na linhagem normal e 10 vezes mais citotóxico na linhagem tumoral no claro. O PDZ apresentou uma importante vantagem sobre o Photogem®, ou seja, é menos citotóxico no escuro e mais citotóxico no claro para ambas linhagens. Esses resultados sugerem um enorme potencial de aplicação clínica desse fotossensibilizador derivado de clorina em Terapia Fotodinâmica. / Photodynamic Therapy (PDT) consists in a technique for cancer treatment. The treatment is based on intravenous administration of the photosensitizer (PS), which is selectively retained in tumor tissue, and when is activated with visible light it can be able to become cytotoxic, being responsible for tumor death. In this study the PS used was Photodithazine (PDZ), a derivative water-soluble of mono-L-aspartil chlorine produced in Russia. It was investigated the PDZ degradation by light (photobleaching) in several conditions and the cytotoxicity of non-irradiated and previously irradiated PDZ in the absence (dark) and presence of light in culture of normal (VERO) and tumor cells (HEp-2). These results were compared with results obtained for Photogem® (photosensitizer approved for use in PDT in Brazil, a hematoporphyrin derivative). PDZ photobleaching was induced with laser in two wavelengths (488 and 514nm) and with LED in 630nm. The degradation was monitored by the decreasing in the absorption and fluorescence intensities. It was observed the appearance of a new absorption band in 668nm (band of photoproducts) suggesting chemistry transformation. Analyses performed with the CCA method (Convex Constrain Analysis) demonstrated that two distinct species are present after the degradation of PDZ, one of then probably being the photoproducts. The photobleaching of PDZ is faster in 630nm than in 514 and 488nm. In the used concentration range of PDZ there is no predominance of aggregated species in physiologic pH, it absorbs in wavelengths higher than Photogem® and degradates in shorter time than Photogem®. However the aggregation of PDZ depends on pH. Only in low pH PDZ presented aggregated species. Studies with surfactants showed that the degradation and formation of photoproducts of PDZ is different than in PBS. Experiments with azide (the singlet oxygen scavenger) suggest that the photobleaching of PDZ occurs by the type II mechanism (singlet oxygen formation). In the cytotoxic studies of PDZ it was observed that the incubation time of the photosensitizer with cells and the presence of serum affect its cytotoxicity in non-tumor and tumor cells in absence and presence of light. When PDZ is previously irradiated occurs a decreasing in cytotoxicity in the dark in function of the irradiation time in both lines. However, the increase of IC50 is approximately 58% for HEp-2 and 25% for VERO. In the presence of light, the cytotoxicity of non-irradiated PDZ increases as a function of incubation and irradiation time. The cytotoxicity of PDZ is greater when in the presence of light in VERO and HEp-2. The increase of irradiation time of the PDZ solution enhances the cytotoxicity of photosensitizer in both cell lines. It is possible to conclude that the photoproducts of PDZ after irradiation are more cytotoxic in the dark (2,2 times) than non-irradiated PDZ and are more cytotoxic (18 folds) in non-tumor cells and 10 folds more cytotoxicity in tumor cell line in the presence of light. PDZ presents an important advantage compared to Photogem®, it is less cytotoxic in the absence of light and more citotóxicas in the presence of light than Photogem® for both cell lines. These results suggest a greater potential for clinical application for this chlorine photosensitizer.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica para induzir dano ao tecido tumoral e consiste na administração de uma droga fotossensível que pode ser seletivamente retida no tecido tumoral e que produz oxigênio singlete quando irradiada em comprimento de onda adequado na presença de oxigênio molecular. Fotossensibilizadores do tipo porfirinas podem ser degradados pela luz modificando a concentração do fotossensibilizador (FS) no tumor. Este processo chamado de fotodegradação caracteriza-se pela diminuição nas intensidades das bandas de absorbância e fluorescência e pode ser acompanhado pela formação de fotoprodutos. Neste estudo o FS usado foi Photogem®, um derivado de hematoporfirina produzido na Rússia e que está sendo usado em TFD no Brasil. A fotodegradação do sensibilizador e formação de fotoprodutos foi monitorada pelas mudanças nas propriedades de fluorescência e absorbância, assim como pela formação do fotoproduto evidenciado pelo aparecimento de uma nova banda em torno de 640nm em PBS e 660nm em soluções de Triton X-100 e Brij-35. A fotodegradação do Photogem® e a formação dos fotoprodutos foram induzidas pela irradiação com laser e LED em diferentes concentrações, comprimentos de ondas de irradiação (351, 488, 514 e 630nm), em diferentes intervalos de tempo e intensidades de irradiação. A citotoxicidade do Photogem® e seus fotoprodutos em células tumorais (HEp-2) e células normais (VERO) foram investigadas no escuro e no claro. Experimentos em animais foram realizados com o objetivo de verificar a profundidade de necrose causada por Photogem® e seus fotoprodutos. Os resultados sugerem que os fotoprodutos do Photogem® são menos citotóxicos tanto no claro como no escuro e esta citotoxicidade diminui com o aumento do tempo de irradiação prévia do Photogem® . Os fotoprodutos obtidos do Photogem® em 514nm precisam de 1 h de irradiação em ambas as linhagens celulares para ter a mesma citotoxicidade que Photogem® irradiado por 14 min em células tumorais e 25 min em células normais. Os resultados sugerem que diferentes processos ocorrem na degradação do FS quando em diferentes meios (PBS, surfactantes e solventes), em diferentes concentrações e condições de irradiação (comprimento de onda, potência, tempo). Em TFD, os sensibilizadores estão tipicamente presentes em altas concentrações nas células tumorais. Desta forma, a fotodegradação dos fotossensibilizadores em taxas apropriadas durante a iluminação em PDT, pode vir a diminuir a concentração destes fotossensibilizadores nos tecidos normais, levando a uma diminuição da fotossensibilidade e fototoxicidade (pele), enquanto quantidade suficiente de fotossensibilizador pode persistir nas células tumorais para posterior fotodestruição, resultando em menor dano para o tecido normal. Assim a fotodegradação do fotossensibilizador é o elo fundamental da distribuição da dose fotodinâmica nos fluidos biológicos, estando relacionado com a cinética de eliminação do fotossensibilizador do organismo. Para os dados obtidos in vivo para a profundidade de necrose em tecido de fígado de ratos do Photogem®?e seus fotoprodutos obtidos pela degradação em 514nm e em 630nm, observou-se que na dose de irradiação de 150J/cm2 em ambas as concentrações (1,5 and 2mg/Kg ), a profundidade de necrose é maior para Photogem seguida de Photogem® degradado previamente em 514 e 630nm. Na dose de irradiação de 200J/cm2 e na concentração de 2mg/Kg não existe diferença na profundidade de necrose para Photogem®?bem como para seus fotoprodutos, o que pode estar relacionado com a fototoxicidade dos fotoprodutos, que em altas concentrações e doses de irradiação, apresentam uma maior atividade fotodinâmica. Os resultados obtidos in vivo concordam com os obtidos in vitro, uma vez que nos experimentos citotóxicos, Photogem® irradiado mostrouse menos tóxico do que Photogem® não irradiado e nos experimentos em animais observou-se uma menor profundidade de necrose para Photogem® irradiado. Estes resultados podem ser úteis para o estabelecimento da dosimetria para Photogem® em Terapia Fotodinâmica. / Photodynamic therapy (PDT) is a technique for inducing tumor tissue damage following administration of a drug that can be selectively retained in malignant tissue and produce singlet oxygen when irradiated in adequate wavelengths in the presence of molecular oxygen. Photosensitizers of porphyrin type can be degraded by light (photobleaching), modifying the concentration ratio of the photosensitizer (PS) in the tumor vs. normal tissue. This process, usually called photobleaching, is characterized by a decrease in the absorption and fluorescence intensities. It has been shown that, during photobleaching, the formation of redshifted absorbing photoproducts takes place. In this study the PS used was Photogem®, a hematoporphyrin derivative produced in Russia and being used in PDT in Brazil. The sensitizer photobleaching and photoproduct formation was monitored by fluorescence and absorption properties changes as well as by the photoproducts formation evidenced by the appearance of a new absorption band around 640nm in PBS and in 660nm in Triton X-100 and Brij-35 solution. Photogem® photobleaching and photoproducts formation was induced by laser and LED irradiation in different concentrations, irradiation wavelengths (351, 488, 514 and 630nm), in different time intervals and intensities of irradiation. The cytotoxicity of Photogem® and its photoproducts in tumor (HEp-2) and non-tumor (VERO) cell lines were analyzed in the dark and in the light. Experiments in animals were performed in order to access the depth of necrosis caused by Photogem® and its photoproducts in rat liver tissue. The results suggest that the photoproducts of Photogem® are less cytotoxic than Photogem® either in the dark or in the light, and the cytotoxicity decreases with the previous irradiation time of Photogem®. The photoproducts of Photogem® obtained at 514nm need one-hour irradiation for both cell lines to have the same cytotoxicity of Photogem® irradiated for 14min in tumor cells and 25min in non-tumor cells. The results suggest that different processes occurs in the PS degradation when in different environments (PBS, surfactants and solvents), in different concentrations and irradiation conditions (wavelength, potency, time). In PDT, the sensitizers are typically present in high concentrations in tumor cells. At the same time, the degradation of photosensitizers in properly elevate rates during the illumination in PDT, can lead to a decrease in the concentrations of these photosensitizers in normal tissue, decreasing the photosensibility and phototoxicity (skin), while adequate amount of photosensitizer can be maintained in tumor cells for photodestruction, resulting in a small damage for normal tissue. Photodegradation of photosensitizers is the fundamental connection of photodynamic dose distribution in the biological fluids, being related with the kinetic of photosensitizer elimination in the organism. For the data obtained in vivo for depth of necrosis of Photogem® x vii and its photoproducts obtained by degradation in 514nm and in 630nm, it was observed that in the irradiation dose of 150J/cm2 in both concentrations (1,5 and 2mg/Kg ), the depth of necrosis is greater for Photogem® followed by Photogem® previously degradated in 514 and then in 630nm. In the dose of 200J/cm2 and in the concentration 2,0mg/kg, there is no differences in the depth of necrosis for non-irradiated Photogem® as well as for its photoproducts, what can be correlated with the phototoxicity of the photoproducts, that in high concentrations and elevate irradiation doses, present a greater photodynamic activity. These results obtained in vivo are in agreement with the ones in vitro, since in the cytotoxic experiments the photoproducts are less cytotoxic than non irradiated Photogem® presenting in the animals a small depth of necrosis. These findings may be helpful for establishment of dosimetry for Photogem® in Photodynamic Therapy

A onicomicose é a mais frequente das doenças ungueais, pode ser causada por dermatófitos, leveduras e fungos não-dermatófitos. A infecção caracteriza-se por unhas quebradiças, espessadas e despigmentadas ou com excesso de pigmentação. O tratamento convencional consiste na administração sistêmica de antifúngicos e antibióticos por longos períodos, podendo ser o responsável pelo aumento de linhagens microbianas resistentes às drogas disponíveis. Esse fator associado a alta incidência deste tipo de infecção na população tornam importante o desenvolvimento de novas tecnologias e opções terapêuticas. Esta dissertação está composta por duas partes: pesquisa básica (estudos in vitro) e aplicada (estudo clínico), além do desenvolvimento de equipamento para o tratamento da onicomicose por Terapia Fotodinâmica (TFD). A TFD consiste no emprego do fotossensibilizador (FS) ativado por luz em comprimento de onda adequado que, na presença de oxigênio, produz espécies reativas de oxigênio tóxicas que inativam as células alvo (fungos e bactérias). Nos ensaios in vitro, utilizamos um dos principais fungos causadores da onicomicose, o Trychophyton mentagrophytes e dois fotossensibilizadores diferentes: Solução de curcuminóides (PDTPharma Ltda., Cravinhos-SP, Brasil) e Photogem&reg (Limited Liability Company Photogem, Moscou, Rússia), onde analisamos por microscopia confocal o tempo de incubação dos fotossensibilizadores nos fungos e a viabilidade celular dos micro-organismos para os diversos parâmetros avaliados. Para os estudos clínicos, foram desenvolvidos dois equipamentos emissores de luz em comprimentos de onda distintos: em 630 nm, para o Photogem&reg, e em 470 nm, para a curcumina. Estes foram desenvolvidos no IFSC (Grupo de Óptica, Laboratório de Apoio Tecnológico) e consiste em diodos emissores de luz (LED) acoplados em presilhas anatomicamente desenhadas para as unhas dos pés e das mãos. Foram tratados 90 pacientes divididos em dois grupos, diferenciados pelo fotossensibilizador tópico utilizado: Photogem&reg (1 mg/mL) ou curcumina (1.5 mg/mL). Após 1 hora a presença do fotossensibilizador foi confirmada por imagem de fluorescência e o local iluminado por 20 minutos (fluência de 120 J/cm2). Nova avaliação clínica foi realizada após sete dias e o acompanhamento do tratamento foi realizado tanto por imagens, quanto por exames laboratoriais. Observou-se a cura de 63 pacientes com uma média de seis meses de tratamento. Em comparação aos tratamentos convencionais, a TFD apresenta resultados mais rápidos, sem recidivas. Além disso, aspectos como o baixo custo da instrumentação envolvida, a possibilidade de tratamento local ao invés de sistêmico e a simplicidade de operação são fatores relevantes para a garantia da implantação dessa tecnologia no tratamento de um problema de saúde de ampla incidência. O protótipo utilizado durante o estudo resultou em patente que se tornou ainda alvo de interesse comercial por uma empresa nacional, juntamente com uma das medicações testadas. Com os resultados obtidos, foi possível concluir que a TFD possui potencial para se tornar uma importante ferramenta no tratamento da onicomicose. / Onychomycosis is the most common nail diseases may be caused by dermatophytes, yeasts and non-dermatophyte fungi. The infection is characterized by brittle nails, thickened and pigmented or pigmented with excess. Conventional treatment consists of systemic administration of antifungals and antibiotics for long periods and may be responsible for the increased microbial strains resistant to available drugs. This factor associated with high incidence of this type of infection in the population become important to develop new technologies and treatment options. This dissertation is composed of two parts: basic research (in vitro studies) and applied (clinical study), and the development of equipment for the treatment of onychomycosis Photodynamic Therapy (PDT). The PDT is the use of photosensitizer (FS) activated by light at a wavelength appropriate that, in the presence of oxygen, produces reactive oxygen species that inactivate toxic target cells (fungi and bacteria). In vitro, we used one of the main causative fungi of onychomycosis, Trichophyton mentagrophytes and the two different photosensitizers: Solution of curcuminoids (PDTPharma Ltda., Cravinhos-SP, Brazil) and Photogem&reg (Photogem Limited Liability Company, Moscow, Russia) where analyzed by confocal microscopy incubation time of photosensitizers in fungi and cell viability of micro-organisms for the various parameters. For clinical studies, we developed two light emitting devices in distinct wavelengths: 630 nm, for Photogem&reg, and 470 nm for curcumin. These were developed in the IFSC (Optics Group, Laboratory Technology Support) and consists of light emitting diodes (LED) coupled cleats anatomically designed for toenails and hands. Were treated 90 patients divided into two groups differentiated by topical photosensitizer used: Photogem&reg (1 mg/ml) or curcumin (1.5 mg/mL). After 1 hour the presence of the photosensitizer was confirmed by fluorescence image and bright place for 20 minutes (fluence of 120 J/cm2). New clinical evaluation was performed after seven days of treatment and follow-up was conducted by both images, as per laboratory. It was observed healing of 63 patients with an average of six months of treatment. Compared to conventional treatments, PDT offers faster results without recurrence. Moreover, aspects such as the low cost of instrumentation involved, the possibility of local treatment rather than systemic and simplicity of operation are important factors for ensuring the implementation of this technology in the treatment of a health problem of widespread impact. The prototype used during the study resulted in patent that became even target of interest for a national company, along with one of the drugs tested. With these results, we concluded that PDT has the potential to become an important tool in the treatment of onychomycosis.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica inovadora para o tratamento de tumores cutâneos. As ftalocianinas têm sido utilizadas como fotossensibilizantes sistêmicos devido à sua alta afinidade ao tecido tumoral e seu efeito acentuado quando irradiadas com luz. No entanto, a lipossolubilidade e o baixo coeficiente de partilha óleo/água dessas substâncias dificultam sua aplicação tópica, levando ao desenvolvimento de derivados carregados, como a zinco ftalocianina tetrassulfonada (ZnPcS4) na tentativa de aumentar sua solubilidade em água, bem como melhorar sua captação pelas células tumorais. Entretanto, moléculas carregadas têm dificuldades em atravessar o estrato córneo (EC), a principal barreira da pele. Como a iontoforese é uma técnica não-invasiva capaz de aumentar e controlar a penetração de moléculas carregadas na pele, ela parece ser uma alternativa para aumentar a penetração cutânea da ZnPcS4 nas camadas da pele onde os tumores estão presentes. Dessa forma, foram realizados experimentos in vitro de iontoforese de um gel hidrofílico da ZnPcS4 aplicado topicamente na presença e ausência de NaCl. Estudos de iontoforese in vivo também foram realizados, empregando ratos Wistar como modelo animal, bem como experimentos em cultura de células tumorais para avaliar a citotoxicidade do fármaco em estudo. O método analítico para quantificação do fármaco na pele foi validado quanto à linearidade, precisão, exatidão, sensibilidade e seletividade. A iontoforese catódica promoveu um aumento significativo da retenção da ZnPcS4 tanto no EC como na epiderme viável nos experimentos realizados na presença e ausência de NaCl em relação à aplicação passiva da formulação e de iontoforese anódica, sendo que ocorreu um aumento da quantidade do fármaco retido nas diferentes camadas da pele quando o sal foi retirado da formulação. Os estudos in vivo com a formulação também mostraram que a corrente elétrica aumentou a penetração do fármaco para as camadas mais profundas da pele em relação aos experimentos passivos de permeação, o que foi evidenciado pela intensidade de fluorescência do fármaco visualizada por microscopia confocal e pela quantidade de fármaco retido nas diferentes camadas da pele. Resultados em cultura de células tumorais A431 sugerem que a concentração de fármaco que chega à epiderme viável após experimentos de iontoforese catódica é capaz de matar mais de 90% dessas células tumorais quando a dose de irradiação de 5 J/cm2 é aplicada. Além disso, quando a corrente elétrica é aplicada em cultura celular, não foi observado nenhum aumento significativo da citotoxicidade da ZnPcS4, demonstrando que a aplicação de corrente elétrica não fez com que a entrada do fármaco para o interior das células tumorais aumentasse. Não restam dúvidas, no entanto, que a corrente elétrica aumentou a penetração do fármaco nas camadas profundas da pele, além de levar a uma distribuição homogênea da ZnPcS4 nessas camadas após 15 minutos de aplicação. / Photodynamic therapy (PDT) is an innovative therapeutic modality for the treatment of cutaneous tumors. The phthalocyanines have been used as systemic photosensitizing agents due to its high affinity to tumor tissues and its accentuated effect when irradiated with light. However, the lipophilicity and the low partition coefficient oil/water of these substances difficult its topical application, leading to the development of charged derivatives, such as the zinc phthalocyanine tetrasulfonated (ZnPcS4) in an attempt to increase the water solubility, as well as improve the drug uptake by tumor cells. However, charged molecules have difficulties to cross the stratum corneum (SC), the main barrier of the skin. As iontophoresis is a noninvasive technique able to improve and control the penetration of charged molecules through the skin, it seems to be an alternative for enhancing ZnPcS4 penetration into the deep layers of the skin, where cutaneous tumors reside. This way, in vitro iontophoresis experiments of a hydrophilic gel containing ZnPcS4 applied topically in the presence and absence of NaCl were performed. In vivo iontophoresis studies were also carried out employing Wistar rats as animal model, as well as experiments in culture of tumour cells to evaluate the cytotoxicity of the drug. The analytical method for the quantification of the drug in the skin was validated considering the parameters of linearity, precision, accuracy, sensitivity and selectivity. The cathodal iontophoresis promoted a significant increase in retention of ZnPcS4 in both SC and viable epidermis in the experiments conducted in the presence and absence of NaCl in relation to the formulation applied passively or by anodal iontophoresis. Therefore, there was an increase in the amount of the drug retained in different layers of the skin when salt was removed from the formulation in the cathodal iontophoresis. In vivo studies also demonstrated that the electrical current increased penetration of the drug to the deeper layers of the skin in relation to passive experiments, evidenced by the fluorescence intensity of the drug showed by confocal microscopy and by the amount of drug retained in the different layers of the skin. Results with A431 tumor cells suggest that the concentration of the drug that reaches the viable epidermis after cathodal iontophoresis is able to kill more than 90% of these tumor cells when the radiation dose of 5 J/cm² was applied. In addition, when the electric current was applied to the cells, it was not observed any significant increase of cytotoxicity, demonstrating that the electric current application did not increased the uptake of the ZnPcS4 by the tumor cells. There are no doubts, however, that the electric current increased the ZnPcS4 penetration to the deep layers of the skin and lead to a homogeneous distribution of ZnPcS4 in these layers after 15 minutes of application.

O câncer de pele, no Brasil, é responsavel por 25% de todos os tipos de câncer. Uma alternativa aos tratamentos usuais é a Terapia Fotodinâmica (TFD). Os processos fotodinâmicos em geral dependem da retenção de um composto fotossensível nos tecidos alvos e posterior irradiação com luz visível em comprimento de onda adequado. Após ativação, o fármaco tranfere energia para outras moléculas do meio, podendo gerar espécies como o oxigênio singlete (1O2) , radicais livres (O2,OH) e outras espécies reativas de oxigênio (EROs), essas, são responsáveis pelo processo fotooxidativo e indução da morte celular. Neste trabalho, o fármaco fotossensível NzPc (uma ftalocianina) foi estudado para verificar se suas características fotofísicas e fotoquímicas são adequadas a TFD, e, em seguida, foi associado a nanotubos de carbono de parede múltipla (NTCPM) funcionalizados com o tensoativo Pluronic F-127. Esse sistema de liberação de fármaco desenvolvido, foi caracterizado através de ensaios in vitro nas linhagens de melanoma de rato B16-F10 e carcinoma humano OSCC . O sistema NzPc/NTCPM/PF-127 apresentou atividade fotodinâmica superior ao fármaco na forma livre, possibilitando, maior interiorização do fármaco nas linhagens celulares e maior morte celular após irradiação. / Skin cancer in Brazil are responsible for 25% of all cancers. An alternative to the usual treatments is photodynamic therapy (PDT). Photodynamic processes in general depend on the retention of a photosensitive compound in target tissues and subsequent irradiation with visible light at an appropriate wavelength. After activation, the drug, transfer energy to other molecules of the medium, which can generate species reactivate such as singlet oxygen (1O2), free radicals (O2 , OH) and other reactive oxygen species (ROS), these are responsible for photo-oxidative process and induction of cell death. In this work, NzPc photosensitive drug (a phthalocyanine) was studied to see if their photophysical and photochemical characteristics are suitable for PDT, and then was associated with multi-walled carbon nanotubes (MWCNT) functionalized with surfactant Pluronic F-127. This drug delivery system developed was characterized by in vitro assay on strains of mouse melanoma B16-F10 and carcinoma human OSCC. The system presented NzPc/NTCPM/PF-127 photodynamic activity than the drug in the free form, enabling greater internalization of the drug in cell and increased cell death after irradiation.

O surgimento de resistência bacteriana aos tratamentos convencionais tem proporcionado o desenvolvimento de novas modalidades terapêuticas para o tratamento e/ou controle da cárie dentária. Nesse contexto, a utilização da terapia fotodinâmica (TFD) é sugerida como alternativa para a inativação de microrganismos patogênicos envolvidos na gênese da cárie. O objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (TFD) sobre três culturas de S. mutans: uma cepa padrão de S. mutans (ATCC 25175) e dois isolados clínicos (43513 e 47513) oriundos da saliva de crianças. O corante (C) azul de orto-toluidina (TBO) foi utilizado associado à iluminação com LEDs (L) no comprimento de onda vermelho. Estas suspensões foram transferidas para placas de 96 orifícios, tratadas com quatro concentrações de TBO (0,25; 2,5; 25 e 250 µg/mL) e expostas a quatro dosimetrias (12; 24; 36 e 48 J/cm2) constituindo o grupo C+L+ (TFD). Suspensões adicionais foram tratadas somente com as quatro concentrações de TBO (C+L-) ou apenas com as quatro dosimetrias (C-L+). Amostras não submetidas ao tratamento com a fonte de luz nem ao corante, constituíram a condição C-L- (controle positivo). Alíquotas de 100 µL de cada orifício foram transferidas para tubos de ensaio para se verificar a presença ou ausência de crescimento microbiológico. Adicionalmente, alíquotas de 25 µL do grupo correspondente a TFD (C+L+) foram semeadas em placas de Petri, as quais foram incubadas a 370C por 48 horas para posterior visualização de halos de inibição e/ou crescimento microbiológico correspondente a efetividade ou ineficiência da TFD, respectivamente. Com o intuito de confirmar os achados, essas mesmas amostras foram submetidas à análise pela microscopia confocal a laser. Os resultados demonstraram que a TFD, em determinadas condições experimentais, foi efetiva no controle do crescimento microbiológico das espécies de S. mutans usadas neste estudo. A concentração mínima de TBO necessária para a inativação in vitro das três culturas de S. mutans foi de 2,5 µg/mL associada à dosimetria mínima de 24 J/cm2 da fonte de luz LED utilizada no estudo. / The increase of bacterias resistance to conventional treatment resulted in the development of new therapeutic modalities for dental caries treatment and/or prevention. In this field, the use of photodynamic therapy (PDT) is suggested as an alternative for inactivation of patogenic microrganisms involved in the etiology of tooth decay. The aim of this study was to evaluate in vitro the antimicrobian effect of the photodynamic therapy (PDT) on bacteria suspensions of S. mutans (ATCC 25175) and two suspensions (43513 and 47513) from infants saliva. Toluidine blue O (TBO) (D) and a red light-emmiting diodes (LEDs) (L) were used in association. Samples were inserted into 96 well-plate and treated with four TBO concentrations (0.25; 2.5; 25 e 250 µg/mL) and exposed to four dosimetries (12; 24; 36 e 48 J/cm2) defining the D+L+ group (PDT). Additional samples were treated only with TBO (D+L-) or only with red LEDs (D-L+). The treatment without dye and none red LED constituted the D-L- condition (positive control). Aliquots from D+L+ (TFD group) were inserted in Petri dishes, which were incubated at 370C for 48 hours. Posterior analysis of microbiologic growth, corresponding to PDT effectivity, was conducted. These samples were also submitted to laser confocal microscopy analysis for microbiologic data confirmation. The results showed PDT effectiveness for S. mutans inactivation in particular conditions. It was demonstrated that PDT was efficient to kill S. mutans species in the presence of the TBO at 2.5 µg/mL (minimum concentration) associated to 24 J/cm2 dosimetry.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da terapia fotodinâmica (TFD) como adjuvante à terapia periodontal (TP), no preparo básico e na fase de terapia periodontal de suporte (TPS), de pacientes diabéticos tipo 2. O estudo foi divido em duas fases (fase 1 tratamento e fase 2 terapia de suporte). Foram selecionados 45 pacientes diabéticos tipo 2, dos quais 30 receberam a TP associada à TDF (Grupo G1) e 15 realizaram TP. Foi prescrita antibioticoterapia (doxiciclina 100mg/dia) por 14 dias a todos os pacientes de ambos os grupos. Foram avaliados no exame inicial e 3 meses após a terapia os seguintes parâmetros: Índice de Placa (IP), Profundidade de Sondagem (PS), Nível de Inserção Clínica (NIC),Sangramento à Sondagem (SS), Supuração (SUP), Hemoglobina Glicosilada (HbA1c), Glicemia em Jejum (GJ). Foi coletado um pool de amostras de fluido gengival e biofilme subgengival para análise da interleucina I beta (IL1-&beta;) e exame microbiológico. Os resultados da fase 1 serviram como dados iniciais para fase 2. Nesta fase 2, o Grupo G1 foi subdividido em dois grupos de 15 indivíduos: G1R onde foi realizada raspagem e alisamento; e G1-F onde foi realizada somente aplicação de PDT. O grupo G2 (n=15) recebeu raspagem e alisamento radicular. As mesmas avaliações da fase 1 foram feitas após 3, 6 e 9 meses da realização da TPS. Para avaliações entre dois grupos o teste de Mann-Whitney foi aplicado, enquanto para intra-grupos foi empregado o Wilcoxon signed rank test. Para a avaliação intra-grupo entre os tempos 3, 6, 9 e 12 meses foi utilizado o teste de Friedman. Foi admitido o nível de significância de 5%. Na fase 1 não houve diferenças significativas entre os grupos para os parâmetros avaliados (P>0,05). A análise intra-grupos demonstrou uma redução significativa da HbA1C (8,5 ± 0,9 / 7,5 ± 0,7) (P<0,01) e GJ (163,53 ± 68,04 / 154 ± 62,45) (P<0,01) para o grupo G1. Houve uma redução significativa das bactérias do complexo vermelho (P. gingivalis, T. forsythia e T. denticola) (P<0,05). Na fase 2 não houve diferenças entre grupos para os parâmetros avaliados. Houve redução significativa do número bolsas entre 4, 5 e &ge; 6 mm e aumento de sítios &le; 3 mm entre o tempo de 3 meses e as demais reavaliações (P<0,05). Houve redução da IL1-&beta; entre 3 e 6 meses para o grupos G1- R (P<0,05). Concluiu-se que a aplicação da TFD como adjuvante à terapia periodontal, em uma única aplicação, não foi capaz de promover efeitos adicionais sobre os parâmetros clínicos, laboratoriais e microbiológicos avaliados, bem como sobre os níveis de IL1-&beta; presentes no fluido gengival. A aplicação da TFD na fase de TPS promoveu resultados semelhantes em relação aos grupos G1-R e G2 para todos os parâmetros avaliados. / The aim of this study was to evaluate the effectiveness of photodynamic therapy (PDT) as an adjunctive treatment to non-surgical periodontal therapy (PT) and periodontal supportive therapy (PST) in chronic periodontitis patients with type 2 diabetics. The study was conducted into two phases. Phase 1: Forty-five diabetics type 2 patients were selected and randomly treated with scaling and root planing (SRP) followed by a single episode of PDT (G1 group/n=30) or SRP alone (G2 group/n=15). Plaque Score (PS), Probing Depth (PD), Clinical Attachment Level (CAL), Bleeding Score (BS), Suppuration (S), Glycated Hemoglobin (HbA1c), and Fasting Glucose (FG) levels were measured at baseline and 3 months after therapy. Samples of subgingival biofilm and crevicular fluid were collected for microbiological and IL1-&beta; analysis respectively. Phase 2: Group G1 was subdivided in two subgroups: G1-R treated with SRP alone (n=15), and G1-F treated with PDT alone (n=15). G2 group was treated with SRP alone (n=15). The results of phase 1 were based on baseline to phase 2 analysis. The same parameters of phase 1 were measured at 3, 6, 9, and 12 months. Mann-Whitney test was applied to assess the differences between groups and Wilcoxon signed rank test for intra-groups differences. Friedman test was applied to assess the differences among 3, 6, 9, and 12 months. A significance level of 5% was established. In phase 1, no significant statistical differences were observed to any parameter evaluated between groups (P<0.05). Intra-groups analysis showed a significant reduction of HbA1C (8.5 ± 0.9 / 7.5 ± 0.1) (P<0.01), and FG (163.53 ± 68.04 / 154 ± 62.45) (P<0.01) for G1 group. There was also a significant reduction of bacterial red complex (P. gingivalis, T. forsythia and T. denticola) (P<0,05). In phase 2, there were no differences between groups for the parameters assessed. There was a significant reduction in the number of sites of 4 and 5 mm and &ge; 6 mm and increase of the number of sites with &le; 3 mm between 3 months and other times of revaluations (P<0,05). There was a reduction of IL1-&beta; between 3 and 6 months for the G1-R group (P<0,05). It can be concluded that the adjunctive application of a single episode of PDT to scaling and root planing did not show additional improvement in non-surgical periodontal therapy. The PDT in periodontal maintenance showed similar results in relation to the groups G1 and G2- R for all parameters assessed. Therefore, PDT can be used as a substitute of SRP during PST when mechanical instrumentation for plaque and calculus removal is not mandatory.

O câncer é uma doença que causa grande número de mortes a cada ano e os tratamentos convencionais normalmente ocasionam efeitos colaterais indesejados além do que nem sempre são eficazes. A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade alternativa de tratamento, que se baseia na combinação de um fotossensibilizador (FS), luz e oxigênio, e tem mostrado resultados promissores em vários tipos de câncer. No entanto, existem alguns desafios para o desenvolvimento de fotossensibilizadores que cumprem os requisitos para uso clínico. Os compostos, hipericina (HY) e curcumina (CUR), estão presentes em plantas medicinais, possuem altos rendimentos quânticos e podem ser usados como FS em TFD. O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência fotodinâmica da HY e CUR através de suas propriedades físico-químicas e biológicas, tais como coeficiente de absortividade molar (&#949), coeficiente de partição (Log P), fotodegradação, atividade fotodinâmica de geração de oxigênio singlete e a resposta biológica usando ensaios citotóxicos e microscopia de fluorescência para avaliar o tipo de morte celular. A HY apresenta propriedade anfifílica, enquanto a CUR, hidrofóbica. A HY é mais fotoestável, enquanto a CUR fotodegrada facilmente sob irradiação em 455 nm levando à formação de fotoprodutos que possuem menor citotoxicidade que a CUR íntegra, o que sugere que a eficiência da TFD diminui conforme este corante é irradiado. Além disso, a alta eficiência de geração de oxigênio singlete de HY corrobora com a sua fototoxicidade mais elevada em comparação com a CUR. A concentração inibitória média (IC50) da HY em células de carcinoma epidermóide de laringe humana (HEp-2) é 256 vezes menor para CUR sob a mesma dose de luz. A investigação do tipo de morte celular foi realizada por microscopia de fluorescência após TFD utilizando os FSs em concentração equivalente a duas vezes o valor de IC50. HY-TFD promoveu cerca de 1,5 vezes mais apoptose nas células HEp-2 do que a CUR. Além disso, a acumulação intracelular dos FSs analisada por Microscopia Confocal de fluorescência mostrou que a CUR apresenta uma velocidade de acumulação menor que a HY. Em conclusão, os resultados obtidos sugerem que a HY é um FS mais eficiente que a CUR para TFD, porém como a CUR e a HY apresentam baixa toxicidade na ausência de luz, são compostos seguros para serem utilizados clinicamente. / Cancer is a disease that causes several deaths each year and the treatment modalities are not quite selective and usually bring about intensive side effect besides not very effective sometimes. Photodynamic therapy (PDT) is an alternative treatment, which is based on the combination of a photosensitive molecule, light activation and oxygen. Many studies have shown promising results with PDT in diverse types of cancer. However, there are some challenges for the development of photosensitizers to comply the requisites for clinical use. The compounds hypericin (HY) and curcumin (CUR), are present in medicinal plants, have high fluorescence quantum yields and can be used as PS in PDT. In this study, we compare HY and CUR through the study of theirs physic-chemical and biological properties, as well as photo degradation, determination of the partition coefficient (Log P) and the molar absorptivity coefficient (&#949), the photodynamic activity as an indirect estimation of singlet oxygen generation potential and the biological response using cytotoxicity assays as well as fluorescence microscopy. The results suggested that HY presents amphiphilic property while CUR is hydrophobic. HY is more photostable than CUR, which is easily photodegradated at 455 nm leading to the formation of photoproducts. The cytotoxicity of these photoproducts was investigated being lower than that of CUR, which suggests that the efficiency of CUR-PDT decreases while this dye is irradiated. Furthermore, the elevated oxygen singlet generation of HY corroborates with its higher phototoxicity compared to CUR. The median inhibitory concentration (IC50) of HY in human epidermoid cancer cells (HEp-2) is 256 times lower than the IC50 for CUR at equal light irradiance. The investigation on the type of cell death was carried out by fluorescence microscopy after PDT using the photosensitizers at concentration equivalent to 2x IC50 values. HY-PDT induced around more 1.5 times apoptosis cell death than CUR-PDT. Besides, the intracellular accumulation of PS analyzed by fluorescence Confocal Microscopy has demonstrated that the accumulation of CUR is slower than HY. In conclusion, our findings suggest that HY is a more efficient PS than CUR for PDT, however, as CUR and HY present low toxicity in the absence of light, they are safe compounds to be clinically used.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2016-05-19T18:09:00Z No. of bitstreams: 1 Rubia Garcia Lopes.pdf: 6178642 bytes, checksum: 787a2ca51a971a3c09bda8ef659636e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T18:09:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rubia Garcia Lopes.pdf: 6178642 bytes, checksum: 787a2ca51a971a3c09bda8ef659636e1 (MD5) Previous issue date: 2014-12-11 / Halitosis is a term used to define the unpleasant breath that may have a systemic or oral origin. Volatile sulfur compounds produced by the Gramnegative bacteria mainly cause the bad breath. Using light - along with by chemical agents or not - is common to induce therapeutic and antimicrobial effects in the photodynamic therapy, and the antimicrobial effect happens only in the areas covered by the dye and irradiated by light. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial effect of the photodynamic therapy in adolescent halitosis, analyzing the volatile sulfur compounds concentration, measured by gas chromatography (OralChromaTM). 45 adolescents were assessed and randomly divided (through controlled clinical study) into 3 groups that received different treatments: group 1 treatment with photodynamic therapy applied on the back (dorsum) region and on the middle third of the tongue, group 2 tongue scraper and group 3 treatment with tongue scraper and photodynamic therapy. The halitosis diagnosis was performed before and after the OralChroma treatment. The Kruskal-Wallis test was applied and compared with the Student-Newman-Keuls test. The α = 0.05 significance level was considered for all analysis. After the treatment, there was a statistically significant decline on all groups (p <0.001); however, the photodynamic therapy and tongue scraper treatment proved to be more efficient to fully reduce the hydrogen sulfides (median = 0). This study provides a new option for treating adolescent halitosis with immediate effects without mechanical aggression to the lingual papillae, which is common in the conventional treatment with tongue scrapers. / A halitose é um termo utilizado para definir o odor desagradável e fétido que emana da boca, podendo apresentar origem sistêmica (10%) ou oral (90%). O mau odor é provocado principalmente por compostos sulforados voláteis, produzido pela ação de bactérias Gram-negativas. A luz acompanhada ou não de agentes químicos tem sido usada para induzir efeitos terapêuticos e antimicrobianos na terapia fotodinâmica (TFD), sendo que o efeito antimicrobiano fica confinado apenas às áreas cobertas pelo corante e irradiadas pela luz. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito antimicrobiano da TFD em adolescentes com halitose, pela análise da concentração de compostos sulforados voláteis, mensurado por cromatografia gasosa (OralChroma TM). Por meio de estudo clínico controlado, 45 adolescentes foram avaliados e divididos aleatoriamente em 3 grupos que receberam tratamentos distintos: grupo 1 tratamento com TFD aplicada na região de dorso e terço médio da língua, grupo 2 raspador lingual e grupo 3 tratamento combinado de raspador lingual e TFD. O diagnóstico de halitose foi realizado antes e depois do tratamento pela cromatorgrafia gasosa. Foi aplicado o teste de Kruskal-Wallis para comparação seguido do teste Student-Newman-Keuls. Para todas as análises foi considerado um nível de significância de α=0,05. Após o tratamento houve redução estatisticamente significante para todos os grupos (p < 0,001), contudo a associação da terapia fotodinâmica ao raspador lingual mostrou ser mais eficiente na redução total de sulfidretos (mediana=0). Conclui-se portanto, que esse estudo traz uma nova opção de tratamento para halitose, com efeito imediato e sem agressão mecânica as papilas linguais comum ao tratamento convencional com raspadores.