La pathogénicité des souches d'Escherichia coli producteurs de Shiga-Toxines (STEC) dans les fromages est peu connue à ce jour et bien que la prévalence des STEC dans les matrices au lait cru soit élevée, le nombre de cas épidémiologiques liés à leur consommation reste rare. L'objectif de la thèse est d'apporter des éléments de compréhension de cette pathogénicité en axant nos travaux sur (i) la caractérisation génétique de souches isolées de produits laitiers, (ii) l'étude de l‘inhibition de l'adhésion des EHEC grâce aux globules gras du lait et des fromages au lait cru. Les données de l'étude sur la diversité génétique par PFGE d'une Une collection de souches de STEC isolées de produits au lait cru présentent une grande diversité de profils de macrorestriction révélés par électrophorèse en champ pulsé (PFGE). L'analyse de leur profil de virulence par approche rt-qPCR a montré que, à l'exception de quelques gènes (stx1/2 chez les STEC O26:H11 et les gènes stx1, nleF et Z6065 chez les STEC O157:H7), ces souches isolées de produits laitiers possèdent le patrimoine génétique propre à déclencher les pathologies à EHEC. Des associations entre les globules gras et les EHEC ont été mise en évidence par microscopie à épi fluorescence. Nos travaux ont également montré une inhibition de l‘adhésion de deux souches EHEC à des enthérocytes en culture (modèle in vitro).Enfin, des tests d‘adhésion des EHEC dans une matrice fromagère appauvrie ou non en globules gras, en modèle souris ont été réalisés. Les données ont montré que la présence de globules gras induit un retard d‘excrétion des EHEC d‘un jour. Les globules gras induisent également une variation du site d‘implantation (de 6 cm) au niveau du colon. Nos travaux apportent des connaissances sur la pathogénicité des STEC issus de produits laitiers. Néanmoins, des études complémentaires sont nécessaires pour statuer sur la pathogénicité des STEC isolés de fromages au lait cru et apporter des réponses concrètes aux industriels de cette filière et aux instances décisionnelles pour l‘établissement d‘une éventuelle réglementation. / Pathogenic Shiga toxin producing Escherichia coli (STEC) are foodborn pathogens wordwild and their pathogenicity in dairy products are yet not well define. Despite their presence in such foodstuff, STEC outbreaks or isolated infectious cases due to consumption of dairy products remain rare. The main objectif of this thesis was to evaluate the potential pathogenicity of STEC in dairy products. This work was divided into two main axes: (i) the genetic characterization of STEC isolated from dairy products and (ii) the inhibition of EHEC adhesion to intestinal tract due to Milk Fat Globule (MFG) of milk and raw milk cheeses. A collection of STEC strains from dairy products showed a hight genetic diversity by PFGE analysis. Virulence profil analysis by rt-qPCR showed that dairy STEC strains present genes implicated into disease enhancement, exception of stx1/2 genes for O26:H11 STEC and stx1, nleF et Z6065 genes for O157:H7 STEC. Interactions between STEC cells and MFG, in raw milk, were confirmed by epifluorescence microscopy. EHEC adherence inhibition property of MFG to enterocytes was demonstrated by an in vitro approach. EHEC adhesion test managed in streptomycin treated CD1 mice demonstrated that the presence of MFG in cheese matrices used to feed animals induced a lag of excretion of EHEC cells one day post-feeding. Moreover, MFG induced a shift of 6 cm of the primo-implantation site of EHEC. Our study provides knowledge about pathogenicity of STEC isolated from dairy products. However, further studies are needed to determine the pathogenicity of the isolated products STEC in raw milk cheeses and provide practical solutions to industrial and risk assessment managers to developed potential reglementations.

Nous avons étudié la présence de bactéries lactiques capables de produire des bactériocines dans des fromages traditionnels Slovènes. Dans cinq échantillons de Tolminc (fromage au lait de vache) et quatre échantillons de Kraški ovčji sir (fromage au lait de brebis), nous avons recherché la présence de 19 gènes de bactériocines par PCR. L'ADN a été extrait directement à partir des fromages ainsi qu'à partir de consortia microbiens de ces fromages isolés sur gélose CATC, Rogosa et M17. Nous avons utilisé des tests par diffusion sur gélose pour déterminer l'activité antimicrobienne des consortia sur différentes bactéries indicatrices. L'activité anti-staphylococcique a aussi été déterminée in situ dans du lait et du fromage. L'avantage compétitif des souches productrices de bactériocines a été évalué en effectuant des repiquages successifs des consortia dans du lait. Lors de ces essais, nous avons suivi la présence de différents déterminants génétiques de bactériocines ainsi que l'activité antimicrobienne des consortia. Ces mêmes propriétés ont aussi été déterminées pour des souches individuelles productrices de bactériocines, qui ont été isolées du consortium initial ou de consortia obtenus après propagation dans le lait. La mise en évidence de gènes de bactériocines par PCR dépendait de l'efficacité d'extraction de l'ADN. L'extraction de l'ADN total était plus efficace lorsque l'homogénéisation du fromage était réalisée avec une solution de citrate de sodium. Dans l'ADN issu des fromages et consortia microbiens, nous avons détecté plusieurs gènes de bactériocines. Leur nombre diminuait lors de la propagation dans le lait, ce qui indique un faible avantage compétitif des souches productrices de bactériocines. Les résultats n'ont montré un avantage compétitif que pour des souches comportant des déterminants génétiques de la cytolysine. Nous n'avons détecté une production de bactériocines dans les fromages que lorsque qu'une culture pure d'une souche productrice de nisine A a été ajoutée. La différence entre la détection de déterminants génétiques de bactériocines et l'activité antimicrobienne montre la complexité qui relie ces deux propriétés.En raison des limitations concernant les tests par diffusion sur gélose pour détecter l'expression des gènes in situ, nous avons mis en place une méthode moléculaire basée sur la reverse transcription et la PCR en temps réel. Cette méthode sera très utile pour de futures études concernant le rôle des bactériocines dans les fromages. / We examined the presence of lactic acid bacteria (LAB) able to produce different bacteriocins in traditional Slovenian cheeses. In five samples of Tolminc cheese (from cows' milk) and four samples of Kraški ovčji sir (from ewes' milk) we looked for the presence 19 LAB bacteriocins' gene determinants using PCR. The DNA analysed was extracted directly from cheese samples as well as from cultivable microbial consortia of cheese which were isolated on CATC, Rogosa and M17 agar media. We used diffusion tests to determine the antimicrobial activity of microbial consortia against different indicator bacteria. Anti-staphylococcal activity was also determined in situ in milk and cheese. Competitive advantage of bacteriocinogenic strains was examined by consecutive propagation of microbial consortia in milk. During this we followed the presence of different bacteriocin gene determinants and antimicrobial activity of microbial consortia. The same properties were also determined for individual bacteriocinogenic strains that were isolated from initial consortia and from consortia obtained after propagation in milk. The success of finding bacteriocin gene determinants with PCR depended greatly on the efficiency of DNA extraction. The extraction of total DNA was the most successful when sodium citrate was used for cheese homogenisation. In DNA of different cheeses and microbial consortia we detected a number of bacteriocin gene determinants. Their number was reduced during the process of propagation in milk, which indicates a poor competitive advantage of some bacteriocinogenic strains. The results demonstrated competitive advantage only for strains that carried gene determinants for cytolysin. We detected bacteriocin activity in cheese only when monoculture of nisin A producer was added. The discrepancy between detected bacteriocin gene determinants and antimicrobial activity shows the complexity that links these two properties. This method will be very useful in the future studies of the role of bacteriocins in cheese.

La qualité sensorielle des fromages au lait cru est variable selon la nature de l’alimentation des vaches laitières mais les mécanismes sous-jacents sont encore mal élucidés. Cette thèse avait pour objectif d’étudier les rôles respectifs et les interactions des composantes biochimique et microbiologique du lait, modulées par l’alimentation des vaches, dans la construction des caractéristiques sensorielles des fromages. Dans un premier temps, nous avons fait varier à la fois la composition biochimique et la composition microbiologique des laits en nous appuyant sur une expérimentation long terme comparant deux systèmes de pâturage qualifiés « d’extensif » (EXT) et de « semi-intensif » (SEMI). La structure des communautés bactériennes de la peau des trayons des vaches laitières, et dans une moindre mesure, celle des laits et des fromages de type Cantal ont varié selon les systèmes de production. Nos résultats confirment que le trayon est un réservoir potentiel de diversité microbienne, non seulement pour le microbiote du lait mais aussi pour celui du fromage. Les fromages EXT étaient caractérisés par une texture fondante et collante et une croûte moins épaisse comparativement aux fromages SEMI. Cependant, les deux systèmes de pâturage ont eu peu d’effet sur la flaveur des fromages, peut-être en raison de la trop grande similarité de la composition biochimique et microbiologique des laits des deux systèmes. Dans un deuxième temps, nous avons fait varier uniquement et de manière accentuée la composition de la matière grasse laitière via l’alimentation des vaches (herbe pâturée versus ensilage de maïs). Dans cette optique, des fromages de type Cantal ont été fabriqués à partir de deux crèmes pasteurisées de composition en acides gras différente et du même lait écrémé. Nous avons montré que l’effet de l’alimentation des vaches sur la texture des fromages était particulièrement lié à la composition de la matière grasse laitière tandis que celle-ci jouait un rôle mineur dans le développement de la flaveur des fromages. La crème la plus riche en acides gras saturés a été associée à une abondance relative plus élevée des ferments bactériens/fongiques et des OTUs dominants sur la surface des fromages et à la formation d’une croûte plus épaisse. Par comparaison, la croûte des fromages fabriqués avec une crème riche en acides gras insaturés était caractérisée par une plus grande diversité fongique et par la présence d’espèces sous dominantes en abondance relative plus élevée. Cette thèse apporte des connaissances nouvelles sur l’effet de la composition de la matière grasse laitière sur les équilibres microbiens et le développement des caractéristiques sensorielles des fromages, et plus spécifiquement sur l’influence des deux composantes biochimique et microbiologique sur l’aspect de la croûte des fromages affinés. / The sensory quality of raw milk cheeses varies according to cow diet but the underlying mechanisms are still poorly understood. The aim of this PhD work was to understand the respective roles and possible interactions between the biochemical and microbiological milk components, modulated by cow diet, on the development of the sensory properties of cheeses. In the frame of a long term experiment comparing two groups of cows managed in two grazing systems qualified of “extensive” (EXT) or “semi-intensive” (SEMI), we made Cantal-type cheeses using milk varying both in its biochemical and microbial composition. The structure of the bacterial communities of the teat skin of dairy cows, and to a lesser extent, that of milk and cheese varied according to the production systems. Our results confirm that the teat skin is a potential reservoir of microbial diversity not only for the microbiota of milk but also for cheese. The EXT cheeses were characterized by a more melting and sticky texture and a thinner rind compared to the SEMI cheeses. However, due to the similarity of the biochemical and microbiological composition of the milks from both systems, the flavour of the resulting cheeses was little impacted. Therefore, we designed a second trial aiming at controlling the microbial composition of milk and accentuating the difference of milk fat composition, via cow diet (maize silage vs pasture). We made Cantal-type cheeses from two pasteurized creams with different fatty acid profiles added to the same skimmed milk. The milk fat composition had a strong influence on cheese texture but it played a minor role on the development of cheese flavour. The cream rich in saturated fatty acids was associated to a higher relative abundance of bacterial / fungal starter strains and of dominant OTUs on the surface of cheese, and to the development of a thicker rind. By comparison, the rind of cheeses made with the cream rich in unsaturated fatty acids was characterized by a higher fungal diversity and the presence of sub-dominant species in greater relative abundance. This thesis provides new knowledge on the effect of the composition of milk fat on the microbial balance and on the development of the sensory characteristics of cheeses, and more specifically on the influence of both biochemical and microbiological components of milk on the aspect of the rind of mature cheeses.

Une caractéristique nutritionnelle peu connue des fromages est leur potentiel acidifiant, qui se révèle au cours du métabolisme et, à long terme, est susceptible d’induire des effets délétères sur la santé du consommateur. Malgré des conséquences physiopathologiques bien connues, très peu d’études se sont intéressées au potentiel acidifiant/alcalinisant des aliments et aucune à celui des fromages. L’objectif principal était d’évaluer d’une part le potentiel acidifiant des fromages et identifier ses déterminants au cours de la fabrication et d’autre part d’explorer des stratégies d’optimisation technologique permettant de réduire le potentiel acidifiant des fromages, tout en assurant leurs qualités gustatives. Le potentiel acidifiant a été évalué sur la base de l’indice PRAL (Potential Renal Acid Load, en tenant compte des teneurs en protéine, P, Cl, Na, K, Mg et Ca) et de la teneur en anions organiques (lactate et citrate). Dans un premier temps, l’étude du potentiel acidifiant de cinq types de fromages du commerce a permis d’établir un lien fort entre le type du fromage et son potentiel acidifiant. L’indice PRAL le plus faible est celui du fromage frais avec - 0,8 mEq/100 g, les indices les plus élevés atteignant 25,3 mEq/100 g pour le fromage à pâte pressée non-cuite (Cantal) et 28,0 mEq/100 g pour le fromage à pâte persillée (Fourme d’Ambert). Ce positionnement a ainsi permis de sélectionner un modèle fromage pour la suite des travaux : la Fourme d’Ambert. Dans une seconde phase, l’égouttage et le salage ont été identifiés comme les deux étapes technologiques déterminantes dans la génération du potentiel acidifiant du modèle fromage choisi, au cours de la transformation fromagère, suivie en milieu industriel. Ces études démontrent un déséquilibre important entre les éléments acidifiants (Cl, P, protéines) et les éléments alcalinisants majeurs (Na et Ca) du PRAL. En particulier, les Cl suivis par le P, ont exercé un très fort impact expliquant les indices élevés obtenus. Enfin, une substitution du NaCl par des sels organiques de calcium (lactate et citrate de Ca) a été testée en conditions industrielles pendant le salage à sec de la Fourme d’Ambert. Les deux sels ont montré un réel intérêt pour substituer partiellement le sel des fromages, sans affecter les propriétés sensorielles des produits finis et notamment les saveurs salée et amère. La substitution au lactate de Ca permettrait d’optimiser le potentiel acidifiant des fromages, en diminuant le PRAL et la teneur en Na et en augmentant la teneur en lactate. La substitution au citrate de Ca serait plutôt indiquée dans le cadre d’un enrichissement en Ca. En conclusion, ces études ont permis d’identifier les leviers à maîtriser pour réduire le potentiel acidifiant des fromages. L’approche adoptée a proposé la mise en application d’un concept connu principalement des nutritionnistes jusqu’ici dans les domaines de la biochimie et de la technologie alimentaires. Les perspectives d’innovation envisagées sont pertinentes avec les enjeux de santé publique actuels, en visant la réduction en Na dans les fromages et en participant à la limitation de l’acidose métabolique latente induite par les régimes occidentaux. Enfin, les retombées économiques de ces recherches sont prometteuses pour les filières fromagères. / A disregarded nutritional feature of cheeses is their acid-forming potential when ingested, associated with deleterious effects for consumers’ health. Despite the well-known pathophysiological consequences, very few studies investigated the acidifying/alkalizing potential of foods and especially, none targeted cheeses. The research project aimed on the one hand to evaluate the acid-forming potential of cheeses and identify the main key steps of the manufacture involved in this phenomenon and on the other hand to explore technological optimization strategies to reduce the acid-forming potential of cheeses, without altering their sensory properties. The acid-forming potential was evaluated on the basis of their Potential Renal Acid Load (PRAL) index (considering protein, P, Cl, Na, K, Mg and Ca contents) and organic anions contents (lactate and citrate). Firstly, the study of the acid-forming potential of five commercial cheeses from different cheese-making technologies established a strong link between the type of cheese and their acid-forming potential. PRAL index ranged from - 0.8 mEq/100 g for fresh cheese to 25.3 mEq/100 g for hard cheese (Cantal) and 28.0 mEq/100 g for the blue-veined cheese Fourme d’Ambert. This positioning allowed to select Fourme d'Ambert as model cheese for next steps. Secondly, draining and salting were identified as the main key steps responsible for the generation of the acid-forming potential of the model cheese, by following an industrial cheese-making process. These studies emphasized a great imbalance between acidifying elements of PRAL calculation (Cl, P and proteins elements) and alkalinizing ones (Na and Ca). Particularly, Cl followed by P elements had a strong impact on the PRAL value. Finally, the salt substitution with organic calcium salts (calcium lactate and calcium citrate) was tested under industrial conditions during the dry salting of Fourme d'Ambert cheese. Both salts showed a real nutritional interest to partially replace salt in cheese, without affecting their sensory properties and especially the salty and the bitter flavors. The salt substitution by calcium lactate could reduce the acid-forming potential of cheeses, by decreasing the PRAL and the sodium content and by increasing the lactate content. The calcium citrate substitution would rather be recommended for Ca enrichment of cheeses. As a conclusion, these studies allowed to identify technological solutions to reduce the acid-forming potential of cheeses. The adopted approach proposed the implementation of a concept, known mainly by nutritionists so far, to the biochemistry and the food technology fields. The considered prospects for innovation are relevant with the current public health issues, targeting the reduction of Na in cheeses and participating in the limitation of the Western diets induced metabolic acidosis. Finally, the economic benefits of this research are promising for cheese-making producers.