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<p> Diabetes mellitus is a major independent risk factor for cardiovascular disease (CVD) and stroke, however the cellular mechanisms by which diabetes contributes to vascular dysfunction are not fully understood. In recent decades, multiple molecular mechanisms have been implicated in hyperglycemia-associated vascular damage and CVD [1]. It is well established that hyperglycemia promotes intracellular glucose flux through the hexosamine pathway where the rate-limiting enzyme, glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase (GFAT) produces glucosamine-6-phosphate [2,3]. We have shown that elevated levels of intracellular glucosamine cause ER stress and activation of the UPR in multiple cell types [4]. Additionally, we have previously shown that ER stress is associated with lipid accumulation, activation of inflammatory pathways, and is associated with atherosclerotic plaque formation in hyperglycemic mice [ 4,5]. We hypothesize that the accumulation of intracellular glucosamine, observed in conditions of hyperglycemia, promotes atherogenesis via a mechanism that involves the hexosamine pathway, protein glycosylation and ER stress.</p> <p> Using in vitro over-expression studies, we investigated the role of GFAT in hyperglycemia-associated ER stress. We developed methods to increase GFAT expression in both HepG2 cells and HASMC. However, we found that GFAT over-expression is insufficient to induce an ER stress response. Further investigation of this system suggests that the over-expressed GFAT does not increase intracellular glucosamine levels to sufficiently promote ER stress.</p> <p> We have also investigated the role of protein glycosylation in glucosamine-induced ER stress. We have shown that O-linked glycosylation plays a role in ER stress induction. We have also shown that N-linked protein glycosylation is affected by elevated cellular glucosamine levels. Thus, dysregulated glycosylation of newly synthesized proteins may contribute to the accumulation of unfolded protein in the ER and lead to the activation of the UPR.</p> / Thesis / Master of Science (MSc)

Certains types de glucides et de lipides sont capables de modifier la prise alimentaire et l'adiposité chez les rongeurs. À long terme, une alimentation riche en graisses et en fructose peut augmenter la prise alimentaire et provoquer une stéatose hépatique chez les mammifères. De tels régimes combinés avec du sirop de maïs à haute teneur en fructose (HFCS) dans l'eau pourraient entrainer un phénotype similaire chez les canards destinés à la production de foie gras. Les buts de ces deux études étaient donc dans un premier temps, d'évaluer les effets à court terme d'un régime alimentaire riche en graisse et en fructose chez le canard mulard et dans un second temps, d'évaluer l'impact à long terme de ce type régime combiné à de l'eau de boisson sucrée. Pour les deux études, 48 canards mulards mâles ont été bloqués en fonction de leur poids et répartis au hasard dans différents groupes suivant un dispositif en blocs complets. Pour la première étude, ils ont été répartis dans deux groupes : Témoin (C); régime riche en gras et en fructose (FF). 12 canards supplémentaires du même lot ont été euthanasiés le jour 0 pour les mesures de base. Après 14 jours, le sang ainsi que le foie d'une partie des animaux ont été aléatoirement collectés (n=12/groupe). Pour la seconde étude qui a duré 92 jours, les canards ont été répartis dans quatre traitements (n=12 par groupe) : régime témoin (C) ; régime de contrôle et eau sucrée (CSW); régime riche en graisses, riche en fructose (FF) ou régime riche en matières grasses, riche en fructose et eau sucrée (FFSW). Le HFCS-55 a été mélangé avec de l'eau du robinet (13% v/p) et fourni ad libitum aux groupes CSW et FFSW. À court terme, nous avons pu constater une consommation énergétique plus faible pour les canards témoin ce qui suggère une altération potentielle des signaux de satiété. Cependant, à long terme, l'alimentation ainsi que l'eau de boisson sucrée a altéré négativement la consommation. Contrairement à nos attentes, ces types de régimes ont donc eu impact limité sur les canards mulards / Different types of dietary carbohydrate and lipids are known to alter feed intake and adiposity in rodents. Long-term feeding of high-fat, high-fructose diets has been shown to alter feed intake and cause fatty liver in mammals. Such diets in combination with the addition of high fructose corn syrup (HFCS) in the drinking water may result in a similar phenotype in ducks destined for the production of foie gras. The aims of these studies were therefore firstly to assess the short-term effects of a diet rich in fat and fructose in mulard ducks and secondly to assess the long-term impact of this type of diet combined with sugar water. Despite its higher energy content, feed intake was not reduced by the FF diet, suggesting a potential alteration of satiety signals, which may impact body liver and weight under longer-term interventions in ducks destined to produce foie gras. However, HFCS in the drinking water reduced voluntary feed intake, whereas overall, FF and C had similar feed intake. In contrast to rodent and human studies, FF diets failed to induce hyperphagia and liver steatosis. In the absence of overfeeding, the long-term feeding of high-fructose, highfat diets, does not promote fatty liver.

Infertility among women has become a growing issue in the world requiring a significant number of women to seek treatment by means of assisted reproductive technologies (ART). One suggested reason for the fertility issue is modern diet, leading to diseases such as obesity and type II diabetes. In this study, twenty gilts three weeks in age, were placed on one of five dietary treatments (n=4 gilts per treatment) containing 15% fat (FAT), 35% fructose (FRU), both fat and fructose (HFHF), or two different controls: one standard industry (IND) diet meant to result in optimal lean growth and a second diet to account for the reduced lysine (LYS) intake in the treatment diets. Two experiments were performed to assess the reproductive outcomes of pre-pubertal gilts consuming a high fat and/or high fructose diet and to demonstrate interactions between diet and infertility using pigs as a model. In the first experiment, follicular fluid was collected from these gilts and introduced into porcine in vitro maturation system to determine whether characteristics of the follicular fluid affect oocyte competence and embryo development. The follicular fluid of females consuming high fructose and fat diets did not alter nuclear maturation of oocytes (p>0.10). There were, however, detrimental effects on subsequent development of embryos, especially blastocyst formation, with the gilts having consumed the HFHF diet having reduced day 5 and 6 blastocysts formation when compared to the IVM follicular fluid free (FFF) group (p=0.03 and p=0.01, respectively). In regards to embryo quality, blastocysts from the FAT group had greater cell number when compared to all other groups. In the second experiment, the reproductive tissues; ovary, oviduct, and uterus were analyzed for genes of interest: estrogen receptor alpha (ESR1), estrogen receptor beta (ESR2), insulin like growth factor I (IGFI), insulin like growth factor I receptor (IGFIR), and growth differentiation factor 9 (GDF9). Resulting data was analyzed in three ways: 1) across all 5 treatments, 2) with gilts grouped by whether or not they consumed fat, or 3) with gilts grouped by whether or not they consumed fructose. There were no differences detected between individual treatments for ESR1 and ESR2. In the ovary samples, the fructose diets decreases ESR2 (p=0.05). Also, GDF9 ovarian expression tended to decrease with fructose consumption (p=0.07). Furthermore in the ovary, there was a positive correlation between ESR2 and GDF9 expression (r=0.92 and p<0.01). GDF9 expression was lower in the oviducts of gilts consuming fat diets when compared to non-fat diets (p=0.01). Neither IGFI nor IGFIR were altered in the reproductive tissues analyzed. Based on the results from both experiments, the consumption of fat and fructose alters both the developing embryo and gene expression in the reproductive tissues that support the growing embryo. Further investigation will provide more insight on the impact nutrition has on pre-pubertal reproductive development and subsequent fertility. / Master of Science

Sun, Fenghua. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 177-204). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Thesis (M.S.)--Pennsylvania State University, 1981. / Includes bibliographical references.

Une réaction simple de condensation de l'acide thiocyanique avec un cétohexose peut conduire à la formation d’une dizaine de 10 oxazolidinethiones (OZTs) ou oxazolinethiones (OXTs) distinctes. La question que nous nous sommes posée a été “comment gérer une chimie aussi complexe?” Un contrôle attentif des conditions de réaction, associé à des séquences de purification comportant des protections sélectives et diverses fonctionnalisations, peuvent certainement être utiles. Un jeu chimique subtil et stimulant a été développé entre des pré- et post-protections sélectives et des réactions originales de fonctionnalisation. Dans ce travail de thèse, nous avons mis à l’étude de nouvelles tactiques de synthèse et de purification pour accéder à des OZTs et des oxazolidinones (OZOs) ancrées sur des charpentes des cétohexoses. Ces travaux ont été mis en application notamment en série D-fructo et dans les séries épimères D-psico et D-tagato dont la chimie ont été peu explorée en comparaison d’autres séries monosaccharidiques. Nous avons ainsi mieux maîtrisé les approches chimiques permettant d’accéder à ces thionocarbamates saccharidiques et ainsi de valoriser ces molécules dont l’intérêt d’un point de vue biologique et chimique est important. Dans ces études, nous avons élaboré une bibliothèque de formes tautomères fixes de composés hybrides qui ont été soumis à des essais biologiques. Ainsi, ce groupe de composés a fait l’objet de tests antimicrobiens, livrant des résultats très intéressants. Par ailleurs, les meilleurs inhibiteurs de GLUT5 seront utilisés dans le développement de nouveaux outils biochimiques pour une meilleure compréhension des rôles joués par ce transporteur du D-fructose en relation au le diabète de type 2 et de l'obésité. / A simple condensation reaction of thiocyanic acid with a ketohexose can provide a library of up to 10 different molecules composed of oxazolidinethiones (OZTs) or oxazolinethiones (OXTs). The question arising is “how to manage such a complex chemistry?” Careful control of the reaction conditions associated with purification sequences (involving selective protection or functionalization) can certainly help. A subtle and challenging chemical game could be played between selective pre- and post-protections and original functionalizing reactions. In this PhD work, we disclose the development of new chemical and purification tactics to access OZTs and oxazolidinones (OZOs) anchored onto ketohexose scaffolds, namely D-fructo and its epimers D-psico, D-tagato, whose chemistry has been poorly investigated in comparison with other monosaccharidic systems. Furthermore we have improved our understanding about saccharidic thionocarbamates chemistry for a better valorization from both chemical and biological point of view. We have generated a library of fixed tautomeric forms of hybrid compounds to be submitted to biological tests. This panel of compounds was subjected to antimicrobial screening and some molecules have shown very efficient effects. Moreover, the leading inhibitors of GLUT5 will be used in the development of biochemical tools for a better comprehension of the role of this D-fructose transporter in relation to type 2 diabetes and obesity.

Implication du PTP dans la mort cellulaire β pancréatique L'hyperglycémie, l'hyperfructosémie et l'ischémie-reperfusion sont délétères pour la viabilité cellulaire β pancréatique, jouant un rôle majeur dans la perte de la masse cellulaire β. Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (PTP) est un canal mitochondrial impliqué dans le déclenchement de la mort cellulaire. Des données récentes montrent l'implication du PTP et du stress oxydant dans la toxicité induite par l'ischémie-reperfusion sur cardiomyocytes et également dans la glucotoxicité induite sur cellules endothéliales. La première partie de notre étude a visé à étudier l'implication de l'ouverture du PTP dans la mort cellulaire des cellules INS-1 et des îlots pancréatiques humains soumis à de fortes concentrations de glucose et de fructose. Nous démontrons que l'incubation des cellules INS-1 et des îlots pancréatiques humains en présence de 30 mM de glucose ou 2,5 mM de fructose déclenche une ouverture du PTP et induit la mort cellulaire. La metformine et la Cyclosporine A (CsA) préviennent l'ouverture du PTP et la mort cellulaire induite par le glucose et le fructose. La deuxième partie de notre travail montre que l'exposition des INS-1 à une heure de carence en substrat concomitante d'une hypoxie, suivie d'une restauration des conditions basales conduit à l'ouverture du PTP et à une majoration drastique de la mort cellulaire. Ces deux évènements sont totalement prévenus par l'incubation préalable par la CsA et la metformine mais aussi par la N-Acétyl-Cystéine (NAC) ou par l'exposition à une anoxie, soulignant ainsi le rôle fondamental du stress oxydant dans le déclenchement de l'ouverture du PTP et de la mort cellulaire. Nous montrons qu'au cours de l'ischémie-reperfusion simulée, la production de superoxide est bi-phasique : nous décrivons un premier pic de production au cours de la carence en substrat, lié à un flux reverse d'électrons au sein du complexe I de la chaîne respiratoire. Ce premier pic est suivi d'un deuxième pic de production après la restauration du niveau de substrats et d'O2, lié à l'ouverture du PTP. La NAC, l'anoxie ou la metformine préviennent les deux pics de production de superoxide tandis que la CsA prévient seulement le second pic. Enfin, nous montrons que l'hypoxie seule n'induit ni stress oxydant, ni ouverture du PTP ni mortalité cellulaire. L'ensemble de notre travail démontre le rôle central du PTP dans la gluco-fructotoxicité et dans la toxicité induite par l'ischémie-reperfusion sur la cellule β pancréatique. Ainsi, prévenir l'ouverture du PTP peut-être une approche intéressante pour préserver la viabilité cellulaire β. / PTP involvement in β pancreatic cell death Hyperglycemia, hyperfructosemia and ischemia-reperfusion play a major role in the progression of β cell loss in diabetes mellitus. The permeability transition pore (PTP) is a mitochondrial channel involved in cell death. PTP opening and oxidative stress have been shown to be involved in ischemia-reperfusion injury on cardiomyocytes and in hyperglycemia-induced cell death in endothelial cells. In the first part of this work, we have examined the involvement of PTP opening in INS-1 cells and human pancreatic islets cell death induced by high levels of glucose or fructose. We first reported that Metformin and Cyclosporin A (CsA) prevented Ca2+-induced PTP opening in permeabilized and intact INS-1 cells. We then shown that incubation of INS-1 cells and human islets in the presence of 30 mM glucose or 2.5 mM fructose induced PTP opening and led to cell death. Because both Metformin and CsA prevented glucose and fructose induced PTP opening, and hampered glucose and fructose induced cell death, we conclude that PTP opening is involved in high glucose and high fructose induced INS-1 and human islets cell death. We therefore suggest that preventing PTP opening might be a new approach to preserve β cell viability. In the second part of the work, we demonstrate that the incubation of INS-1 cells in the absence of energy substrates in hypoxic condition for 1 hour followed by incubation in normal condition led to PTP opening and to a dramatic increase in cell death. Both events were totally prevented when PTP opening was inhibited by either Cyclosporin A (CsA) or Metformin or when the cells were incubated in the presence of the antioxidant N-acetyl-cystein (NAC), in anoxia, highlighting the implication of oxidative stress is the commitment of PTP opening. Superoxide production increased during the removal of energy substrates, due to reverse electron flux through complex I and again increased when normal energy substrate and O2 were restored, due to PTP opening. NAC, anoxia or Metformin prevented the two phases of oxidative stress, while CsA prevented only the second one. Hypoxia alone did not induce oxidative stress, PTP opening or cell death. Our work demonstrates the implication of PTP opening in ischemia-reperfusion injury and gluco- fructotoxicty in β pancreatic cells. We therefore suggest that preventing PTP opening might be a new approach to preserve β cell viability.

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) est une manifestation du syndrome métabolique dont la prévalence est en constante évolution. Les stratégies thérapeutiques sont soit difficiles à mettre en œuvre soit d’une efficacité limitée. Nous avons étudié une approche nutritionnelle avec 3 acides aminés particuliers : la glutamine, l’arginine et la citrulline (Cit) pour leurs propriétés de pharmaconutriments azotés. Dans un modèle de NAFLD modérée induite par le fructose, seule la citrulline (1 g/kg/j) permettait une amélioration du métabolisme lipidique. Toutefois, l’étude de la cinétique de NAFLD suggérait un effet protecteur du simple apport azoté. L’effet spécifique de la Cit par rapport au simple apport azoté (AANE) a donc été déterminé dans un modèle de NAFLD induite par 8 semaines de régime enrichi en fructose. Ceci a permis de confirmer l’effet protecteur de la Cit et des AANE. Toutefois, la Cit exerce un effet plus spécifique sur l’expression de Srebp1c et de Fas et améliore la disponibilité périphérique en Arg, un élément important de l’insulino-sensibilité. La stéatose est associée à une perte de masse maigre, suggérant une oxydation des AA aux dépens de l’anabolisme musculaire, et une accumulation de lipides à l’origine de la stéatose et du gain de masse grasse viscérale ; la Cit et les AANE en agissant sur la NAFLD préviendraient cet effet du fructose. Nous avons ensuite évalué les effets de la Cit dans un modèle de stéatose plus sévère induite par le western diet. La Cit améliore la fonction hépatique (diminution des lipides et de l’inflammation hépatique) et préserve l’axe intestin-foie (restauration du groupe Bacteroides/Prevotella dans la muqueuse colique, diminution de l’inflammation intestinale et augmentation de l’expression de la Claudine 1) mais ne permet pas de prévenir l’ensemble des altérations liées au western diet. Il serait intéressant d’évaluer la relation effet/dose et l’efficacité de la Cit en association avec d’autres traitements. Par ailleurs, les mécanismes cellulaires restent à élucider. / Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a manifestation of the metabolic syndrome whose prevalence is constantly growing. Therapeutic strategies are either difficult to implement or of limited effectiveness. We studied a nutritional approach with three specific amino acids: glutamine, arginine and citrulline (Cit) for their pharmaconutrient properties. In a model of moderate fructose-induced NAFLD, citrulline alone (1 g/kg/day) improved lipid metabolism. However, the study of the kinetics of NAFLD suggested a protective effect of nitrogen supply by itself. The specific effect of Cit compared to that of nitrogen (NEAAs) has been determined in a model of 8 week fructose diet-induced NAFLD. This has confirmed the protective effect of Cit and NEAAs. However, Cit exerted a specific effect on the expression of Fas and SREBP1c and improves peripheral Arg availability, an important component of insulin sensitivity. Steatosis was associated with loss of lean mass, suggesting AA oxidation at the expense of muscle anabolism, and lipid accumulation causing steatosis and visceral fat gain; Cit and NEAAs by acting on NAFLD would prevent this effect of fructose. We then evaluated the effects of Cit in a model of more severe steatosis induced by western diet. Cit improved liver function (reduced fat and liver inflammation) and protected the liver-gut axis (restoration of Bacteroides/Prevotella group in the colonic mucosa, decreased intestinal inflammation and increased expression of claudin 1) but did not prevent all western diet-induced alterations. It would be interesting to assess the dose/effect relationship and the effectiveness of Cit in combination with other treatments. Furthermore, the cellular mechanisms remain to be elucidated.