Copaifera langsdorffii Desf., popularmente conhecida como \"copaíba\", distribui-se abundantemente no cerrado brasileiro, sendo que diversas atividades biológicas já foram descritas na literatura para o seu oleorresina. Contudo, nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa vem estudando as partes aéreas desta espécie e verificou-se que o extrato hidroalcoólico das folhas de C. langsdorffii apresentava atividade antilitiásica. Com a intenção de descobrir quais são os compostos relacionados a esta atividade, foi realizado o estudo fitoquímico das folhas. Com o auxílio de análises cromatográficas foi possível verificar o perfil de cada fração e, assim, escolher as mais promissoras para isolamento de compostos. A partir da fração em acetato de etila obtiveram-se os flavonoides quercetina-3-O-?-L-ramnopiranosídeo (quercitrina) e canferol-3-O-?-L-ramnopiranosídeo (afzelina), isolados por cromatografia contra-corrente (HSCCC), seguida de purificação por cromatografia líquida de alta eficiência preparativa (CLAE-preparativa). Já a partir da fração aquosa obtiveram-se os derivados galoilquínicos 5\'\'-O-metil-3,4-di-O-galoilquínico e 5\',5\'\'-di-O-metil-3,4-di-O-galoilquínico por cromatografia de filtração em gel (Sephadex), seguida de purificação em CLAE-preparativa. Nos testes farmacocinéticos, o extrato hidroalcoólico, quercitrina e o galoilquínico 5\',5\'\'-di-O-metil-3,4-di-O-galoilquínico foram os compostos selecionados para serem estudados. Para ambos os compostos, métodos analíticos foram validados em plasma e em salina para a realização dos estudos farmacocinéticos. Realizou-se também a calibração da sonda de microdiálise in vitro por retrodiálise, para se determinar as condições a serem empregadas in vivo. De maneira geral, quercitrina se ajustou ao modelo farmacocinético de dois compartimentos e, após administração intravenosa de 1 mg/kg, apresentou meia vida curta (t1/2 = 0,40 ± 0,07 h), uma rápida (? = 11,32 ± 1,90 h-1) e boa (Vdss = 2,10 ± 0,52 L/kg) distribuição tecidual e alta depuração (CL = 6,85 ± 0,62 L/h/kg). Por análise dos microdialisados renais, a fração livre de quercitrina nos rins foi 13 vezes maior do que a concentração livre no plasma. O composto galoilquínico, por se tratar de um composto inédito, foi estudado farmacocineticamente por via intravenosa em três concentrações (1 mg/kg, 1,5 mg/kg e 2 mg/kg) e se ajustou bem ao modelo de dois compartimentos com eliminação por Michaelis-Menten, apresentando comportamento não linear (ASC0-? 103,85 ± 23,90; 273,7 ± 81,6 e 363,6 ± 142,32 ?g h/mL, respectivamente). Não foi possível quantificar a concentração livre nos rins por microdiálise para o galoilquínico, pois o mesmo se ligava a sonda. Dessa maneira, o estudo de distribuição tecidual foi realizado, demonstrando que tanto quercitrina quanto o galoilquínico apresentavam alta penetrabilidade nos rins, com uma razão tecido renal/plasma de 23,7 e 12,4, respectivamente. Com relação ao perfil farmacocinético do extrato hidroalcoólico de C. langsdorffii e da fração butanólica após administração por via oral, verificou-se que não foi possível detectar nenhum dos isolados no plasma, sugerindo que tais substâncias foram metabolizadas e, provavelmente, tornaram-se ainda mais hidrossolúveis para posterior eliminação por via renal. Frente aos resultados, conclui-se que quercitrina e galoilquínico são substâncias de rápida eliminação e que podem estar relacionadas à atividade antilitiásica descrita para o extrato das folhas de C. langsdorffii. / Copaifera langsdorffii Desf., popularly known as \"copaíba\" is abundantly distributed in the Brazilian cerrado, with several biological activities that have been described in the literature for its oleoresin. However, since few years ago, our research group has been studying the aerial parts of this species, and it was found that the hydroalcoholic extract of its leaves display antilithiatic activity. Aiming to identify the compounds related to this activity, the phytochemical study of the leaves hydroalcoholic extract was undertaken. By using chromatography techniques, it was possible to choose the most promising fractions to isolate compounds. From the ethyl acetate fraction, it was isolated by countercurrent chromatography (HSCCC) followed by preparative HPLC purification, the flavonoids quercetin-3-O-?-L-rhamnopyranoside (quercitrin) and kaempferol-3-O-?-L-rhamnopyranoside (afzelin). From the aqueous fraction, it was isolated the galloylquinic acid derivatives 5\'\'-O-methyl-3,4-di-O-galloylquinic and 5\',5\'\'-di-O-methyl-3,4-O-di-galloylquinic by using gel filtration chromatography (Sephadex) followed by preparative HPLC purification. For the pharmacokinetic assays, the hydroalcoholic extract, quercitrin and 5\', 5\'\'-di-O-methyl-3,4-di-O-galloylquinic acid were chosen to be studied. For both compounds, it was validated analytical methods in plasma and saline, to perform pharmacokinetic studies. It was also held the microdialysis probe calibration in vitro by retrodialysis, to determine the conditions to be employed in vivo. In general, quercitrin fitted to a two-compartmental pharmacokinetic model and after intravenous administration of 1 mg/kg, it presented a short half-life (t1/ 2 = 0.40 ± 0.07 h) a fast (? = 11.32 ± 1.90 h-1) and good (Vdss = 2.10 ± 0.52 L/kg) tissue distribution and high clearance (CL = 6.85 ± 0.62 L/h/kg). In the kidney microdialisates analyses, the free renal fraction of quercitrin was 13 times greater than the free plasma concentration. The galloylquinic compound, which is a new isolated one, was studied intravenously in three concentrations (1 mg/kg, 1.5 mg/kg and 2 mg/kg) and fitted to a two-compartmental model with Michaelis-Menten elimination, presenting the non-linear behavior (ASC0-? 103.85 ± 23.90, 273.7 ± 81.6 and 363.6 ± 142.32 ?g h/mL, respectively). It was not possible to quantify the free concentration of galloylquinic in the kidney by microdialysis, because it bound to the probe. Thus, the study of tissue distribution was performed, in which it was demonstrated that both quercitrin and galloylquinic showed high penetration in the kidneys, with a tissue/plasma ratio of 23.7 and 12.4, respectively. With regard to the pharmacokinetic profile of the hydroalcoholic extract of C. langsdorffii and n-butanol fraction after oral administration, it was found that it was not possible to detect any of the isolated compounds in plasma, suggesting that these compounds were metabolized and probably become even more water soluble for disposal renally. Based on the results, it is concluded that quercitrin and galloylquinic are rapidly eliminated and may be related to antilithiatic activity of the leaves of C. langsdorffii.

Copaifera langsdorffii (Fabaceae, Caesalpinioideae), conhecida popularmente como \"copaíba\", \"copaibeira\" ou \"pau d\'óleo\", é uma árvore de grande porte que se encontra amplamente distribuída pelo Brasil, desde a floresta amazônica até a vegetação do cerrado. A oleorresina, constituída principalmente por sesquiterpenos e diterpenos, é utilizada na medicina popular no tratamento de desordens infecciosas e inflamatórias. Por outro lado, estudos sobre suas folhas, as quais são constituídas majoritariamente por flavonoides e derivados galoilquínicos, são escassos. Assim, foi proposto o isolamento de marcadores químicos, desenvolvimento e validação de método analítico por CLAE-UV-DAD, bem como o estudo sazonal. O extrato bruto obtido das folhas foi particionado com solventes de polaridade crescente: diclorometano, acetato de etila e n-butanol. As frações em n-butanol e aquosa apresentaram, majoritariamente, compostos polares, dentre os quais se destacaram os derivados galoilquínicos. Para isolamento desses compostos utilizaram-se a cromatografia de permeação em gel de Sephadex LH-20 e a cromatografia líquida de alta eficiência preparativa. Nas análises por CLAE-UV-DAD empregou-se coluna analítica Synergi Polar-RP (100 mm x 3,0 mm, 2,5 ?m) e fase móvel composta por ácido fórmico-água (0,1:99,9, solvente A) e isopropanol- metanol-acetonitrila (0,5:4:6, solvente B). O gradiente de eluição foi A:B (90:10 para 85:15) em 8,33 minutos, seguido por A:B (85:15 para 64:36) até 29,17 minutos, utilizando vazão de 0,68 mL/min. Os estudos de sazonalidade foram realizados com 10 acessos de C. langsdorffii cultivados no Sítio Beija-Flor (Cajuru/SP). A partir da fração aquosa foram isolados e identificados 16 derivados galoilquínicos: ácido 5\'-O-metil-3-Ogaloilquínico (AGQ-1), ácido 5\'\'-O-metil-3,4-di-O-galoilquínico (AGQ-2), ácido 5\',5\'\'-di-Ometil- 3,4-di-O-galoilquínico (AGQ-3), ácido 3,4-di-O-galoilquínico (AGQ-4), ácido 5\'\'-Ometil- 3,5-di-O-galoilquínico (AGQ-5), ácido 5\'-O-metil-3,5-di-O-galoilquínico (AGQ-6), ácido 5\'-O-metil-3,4-di-O-galoilquínico (AGQ-7), ácido 5\',5\'\'-di-O-metil-3,5-di-Ogaloilquínico (AGQ-8), ácido 5\',5\'\'-di-O-metil-4,5-di-O-galoilquínico (AGQ-9), ácido 3,5-di- O-galoilquínico (AGQ-10), ácido 4,5-di-O-galoilquínico (AGQ-11), ácido 5\'-O-metil-4,5-di- O-galoilquínico (AGQ-12), ácido 5\'\'-O-metil-4,5-di-O-galoilquínico (AGQ-13), ácido 3,4,5- tri-O-galoilquínico (AGQ-14), ácido 5\'\'-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico (AGQ-15), ácido 5\',5\'\',5\'\'\'-tri-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico (AGQ-16). Além disso, por meio das análises realizadas por CLAE-EM foi possível constatar a presença de outros 10 derivados galoilquínicos: ácido 3-O-galoilquínico, ácido 4-O-galoilquínico, ácido 5-O-galoilquínico, ácido 5\'-O-metil-4-O-galoilquínico, ácido 5\'-O-metil-5-O-galoilquínico, ácido 5\'-O-metil- 3,4,5-tri-O-galoilquínico, ácido 5\'\'\'-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico, ácido 5\',5\'\'-di-Ometil- 3,4,5-tri-O-galoilquínico, ácido 5\',5\'\'\'-di-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico, ácido 5\'\',5\'\'\'-di-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico. O método analítico mostrou-se adequado para quantificação de nove derivados galoilquínicos (AGQ-1, AGQ-5, AGQ-6, AGQ-7, AGQ-8, AGQ-9, AGQ-10, AGQ-15, AGQ-16) e dois flavonoides, quercitrina e afzelina, frente aos parâmetros seletividade, linearidade, sensibilidade, precisão e exatidão. Por meio de análise estatística multivariada dos estudos sazonais concluiu-se que os acessos apresentaram perfis químicos qualitativos e quantitativos semelhantes nas coletas isoladas e perfis quantitativos diferentes ao longo dos meses. / Copaifera langsdorffii (Fabaceae, Caesalpinioideae), popularly known as \"copaíba\", \"copaibeira\" or \"pau d\'oleo\", is a large tree widely distributed in Brazil, from Amazon rainforest to savannah vegetation. Its oleoresin, composed mainly of sesquiterpenes and diterpenes, is widely used in folk medicine to treat inflammatory and infectious disorders. On the other hand, studies about its leaves, composed mainly of flavonoids and galloylquinic acid derivatives, are scarce. Therefore, it was proposed to isolate leaves major compounds, to develop and validate an analytical method by HPLC-UV-DAD, as well as to udertake seasonal studies. The crude extract of the leaves was partitioned with solvents of increasing polarity: dichloromethane, ethyl acetate and n-buthanol, in sequence. Chemical profiles of n-buthanol and aqueous fractions showed to be composed of polar compounds, especially galloylquinic acid derivatives. These compounds were isolated by gel permeation chromatography using Sephadex LH-20 and preparative high-performance liquid chromatography. The HPLC-UV-DAD analyses were carried out on a Synergi Polar-RP (100 x 3.0 mm, 2.5 ?m) column. The mobile phase was made up of formic acid-water (0.1:99.9, solvent A), and isopropanol-methanol-acetonitrile (0.5:4:6, solvent B). The elution gradient was A:B (90:10 to 85:15) in 8.33 minutes, followed by A:B (85:15 to 64:36) up to 29.17 minutes using a flow rate of 0.68 mL/ min. The seasonal studies were performed from 10 C. langsdorffii accesses grown on Beija-Flor farm (Cajuru/SP). From the aqueous fraction it was isolated and identified 16 galloylquinic acid derivatives: 5\'-O-methyl-3-Ogalloylquinic acid (GQA-1), 5\'\'-O-methyl-3,4-di-O-galloylquinic acid (GQA-2), 5\',5\'\'-di-Omethyl- 3,4-di-O-galloylquinic acid (GQA-3), 3,4-di-O-galloylquinic acid (GQA-4), 5\'\'-Omethyl- 3,5-di-O-galloylquinic acid (AGQ-5), 5\'-O-methyl-3,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-6), 5\'-O-methyl-3,4-di-O-galloylquinic acid (AGQ-7), 5\',5\'\'-di-O-methyl-3,5-di-Ogalloylquinic acid (GQA-8), 5\',5\'\'-di-O-methyl-4,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-9), 3,5-di- O-galloylquinic acid (GQA-10), 4,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-11), 5\'-O-methyl-4,5-di- O-galloylquinic acid (GQA-12), 5\'\'-O-methyl-4,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-13), 3,4,5- tri-O-galloylquinic acid (GQA-14), 5\'\'-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid (GQA-15), 5\',5\'\',5\'\'\'-tri-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid (GQA-16). Furthermore, through HPLC-MS analysis it was identified additional 10 galloylquinic acid derivatives: 3-Ogalloylquinic acid, 4-O-galloylquinic acid, 5-O-galloylquinic acid, 5\'-O-methyl-4-Ogalloylquinic acid, 5\'-O-methyl-5-O-galloylquinic acid, 5\'-O-methyl-3,4,5-tri-Ogalloylquinic acid, 5\'\'\'-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid, 5\',5\'\'-di-O-methyl-3,4,5-tri- O-galloylquinic acid, 5\',5\'\'\'-di-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid, 5\'\',5\'\'\'-di-O-methyl- 3,4,5-tri-O- galloylquinic acid. The HPLC developed method was suitable to quantify nine galloylquinic derivatives (GQA-1, GQA-5, GQA-6, GQA-7, GQA-8, GQA-9, GQA-10, GQA-15, GQA-16) and two flavonoids, quercitrin and afzelin, related to the selectivity, linearity, sensitivity, precision and accuracy parameters. Through multivariate statistical analysis, it was possible to conclude that all ten diferrent populations of C. langsdorffii cultivated displayed similar qualitative and quantitative chemical profiles among isolated months and different quantitative profiles among different months.

Copaifera langsdorffii (Fabaceae, Caesalpinioideae), conhecida popularmente como \"copaíba\", \"copaibeira\" ou \"pau d\'óleo\", é uma árvore de grande porte que se encontra amplamente distribuída pelo Brasil, desde a floresta amazônica até a vegetação do cerrado. A oleorresina, constituída principalmente por sesquiterpenos e diterpenos, é utilizada na medicina popular no tratamento de desordens infecciosas e inflamatórias. Por outro lado, estudos sobre suas folhas, as quais são constituídas majoritariamente por flavonoides e derivados galoilquínicos, são escassos. Assim, foi proposto o isolamento de marcadores químicos, desenvolvimento e validação de método analítico por CLAE-UV-DAD, bem como o estudo sazonal. O extrato bruto obtido das folhas foi particionado com solventes de polaridade crescente: diclorometano, acetato de etila e n-butanol. As frações em n-butanol e aquosa apresentaram, majoritariamente, compostos polares, dentre os quais se destacaram os derivados galoilquínicos. Para isolamento desses compostos utilizaram-se a cromatografia de permeação em gel de Sephadex LH-20 e a cromatografia líquida de alta eficiência preparativa. Nas análises por CLAE-UV-DAD empregou-se coluna analítica Synergi Polar-RP (100 mm x 3,0 mm, 2,5 ?m) e fase móvel composta por ácido fórmico-água (0,1:99,9, solvente A) e isopropanol- metanol-acetonitrila (0,5:4:6, solvente B). O gradiente de eluição foi A:B (90:10 para 85:15) em 8,33 minutos, seguido por A:B (85:15 para 64:36) até 29,17 minutos, utilizando vazão de 0,68 mL/min. Os estudos de sazonalidade foram realizados com 10 acessos de C. langsdorffii cultivados no Sítio Beija-Flor (Cajuru/SP). A partir da fração aquosa foram isolados e identificados 16 derivados galoilquínicos: ácido 5\'-O-metil-3-Ogaloilquínico (AGQ-1), ácido 5\'\'-O-metil-3,4-di-O-galoilquínico (AGQ-2), ácido 5\',5\'\'-di-Ometil- 3,4-di-O-galoilquínico (AGQ-3), ácido 3,4-di-O-galoilquínico (AGQ-4), ácido 5\'\'-Ometil- 3,5-di-O-galoilquínico (AGQ-5), ácido 5\'-O-metil-3,5-di-O-galoilquínico (AGQ-6), ácido 5\'-O-metil-3,4-di-O-galoilquínico (AGQ-7), ácido 5\',5\'\'-di-O-metil-3,5-di-Ogaloilquínico (AGQ-8), ácido 5\',5\'\'-di-O-metil-4,5-di-O-galoilquínico (AGQ-9), ácido 3,5-di- O-galoilquínico (AGQ-10), ácido 4,5-di-O-galoilquínico (AGQ-11), ácido 5\'-O-metil-4,5-di- O-galoilquínico (AGQ-12), ácido 5\'\'-O-metil-4,5-di-O-galoilquínico (AGQ-13), ácido 3,4,5- tri-O-galoilquínico (AGQ-14), ácido 5\'\'-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico (AGQ-15), ácido 5\',5\'\',5\'\'\'-tri-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico (AGQ-16). Além disso, por meio das análises realizadas por CLAE-EM foi possível constatar a presença de outros 10 derivados galoilquínicos: ácido 3-O-galoilquínico, ácido 4-O-galoilquínico, ácido 5-O-galoilquínico, ácido 5\'-O-metil-4-O-galoilquínico, ácido 5\'-O-metil-5-O-galoilquínico, ácido 5\'-O-metil- 3,4,5-tri-O-galoilquínico, ácido 5\'\'\'-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico, ácido 5\',5\'\'-di-Ometil- 3,4,5-tri-O-galoilquínico, ácido 5\',5\'\'\'-di-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico, ácido 5\'\',5\'\'\'-di-O-metil-3,4,5-tri-O-galoilquínico. O método analítico mostrou-se adequado para quantificação de nove derivados galoilquínicos (AGQ-1, AGQ-5, AGQ-6, AGQ-7, AGQ-8, AGQ-9, AGQ-10, AGQ-15, AGQ-16) e dois flavonoides, quercitrina e afzelina, frente aos parâmetros seletividade, linearidade, sensibilidade, precisão e exatidão. Por meio de análise estatística multivariada dos estudos sazonais concluiu-se que os acessos apresentaram perfis químicos qualitativos e quantitativos semelhantes nas coletas isoladas e perfis quantitativos diferentes ao longo dos meses. / Copaifera langsdorffii (Fabaceae, Caesalpinioideae), popularly known as \"copaíba\", \"copaibeira\" or \"pau d\'oleo\", is a large tree widely distributed in Brazil, from Amazon rainforest to savannah vegetation. Its oleoresin, composed mainly of sesquiterpenes and diterpenes, is widely used in folk medicine to treat inflammatory and infectious disorders. On the other hand, studies about its leaves, composed mainly of flavonoids and galloylquinic acid derivatives, are scarce. Therefore, it was proposed to isolate leaves major compounds, to develop and validate an analytical method by HPLC-UV-DAD, as well as to udertake seasonal studies. The crude extract of the leaves was partitioned with solvents of increasing polarity: dichloromethane, ethyl acetate and n-buthanol, in sequence. Chemical profiles of n-buthanol and aqueous fractions showed to be composed of polar compounds, especially galloylquinic acid derivatives. These compounds were isolated by gel permeation chromatography using Sephadex LH-20 and preparative high-performance liquid chromatography. The HPLC-UV-DAD analyses were carried out on a Synergi Polar-RP (100 x 3.0 mm, 2.5 ?m) column. The mobile phase was made up of formic acid-water (0.1:99.9, solvent A), and isopropanol-methanol-acetonitrile (0.5:4:6, solvent B). The elution gradient was A:B (90:10 to 85:15) in 8.33 minutes, followed by A:B (85:15 to 64:36) up to 29.17 minutes using a flow rate of 0.68 mL/ min. The seasonal studies were performed from 10 C. langsdorffii accesses grown on Beija-Flor farm (Cajuru/SP). From the aqueous fraction it was isolated and identified 16 galloylquinic acid derivatives: 5\'-O-methyl-3-Ogalloylquinic acid (GQA-1), 5\'\'-O-methyl-3,4-di-O-galloylquinic acid (GQA-2), 5\',5\'\'-di-Omethyl- 3,4-di-O-galloylquinic acid (GQA-3), 3,4-di-O-galloylquinic acid (GQA-4), 5\'\'-Omethyl- 3,5-di-O-galloylquinic acid (AGQ-5), 5\'-O-methyl-3,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-6), 5\'-O-methyl-3,4-di-O-galloylquinic acid (AGQ-7), 5\',5\'\'-di-O-methyl-3,5-di-Ogalloylquinic acid (GQA-8), 5\',5\'\'-di-O-methyl-4,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-9), 3,5-di- O-galloylquinic acid (GQA-10), 4,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-11), 5\'-O-methyl-4,5-di- O-galloylquinic acid (GQA-12), 5\'\'-O-methyl-4,5-di-O-galloylquinic acid (GQA-13), 3,4,5- tri-O-galloylquinic acid (GQA-14), 5\'\'-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid (GQA-15), 5\',5\'\',5\'\'\'-tri-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid (GQA-16). Furthermore, through HPLC-MS analysis it was identified additional 10 galloylquinic acid derivatives: 3-Ogalloylquinic acid, 4-O-galloylquinic acid, 5-O-galloylquinic acid, 5\'-O-methyl-4-Ogalloylquinic acid, 5\'-O-methyl-5-O-galloylquinic acid, 5\'-O-methyl-3,4,5-tri-Ogalloylquinic acid, 5\'\'\'-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid, 5\',5\'\'-di-O-methyl-3,4,5-tri- O-galloylquinic acid, 5\',5\'\'\'-di-O-methyl-3,4,5-tri-O-galloylquinic acid, 5\'\',5\'\'\'-di-O-methyl- 3,4,5-tri-O- galloylquinic acid. The HPLC developed method was suitable to quantify nine galloylquinic derivatives (GQA-1, GQA-5, GQA-6, GQA-7, GQA-8, GQA-9, GQA-10, GQA-15, GQA-16) and two flavonoids, quercitrin and afzelin, related to the selectivity, linearity, sensitivity, precision and accuracy parameters. Through multivariate statistical analysis, it was possible to conclude that all ten diferrent populations of C. langsdorffii cultivated displayed similar qualitative and quantitative chemical profiles among isolated months and different quantitative profiles among different months.

Copaifera langsdorffii Desf., popularmente conhecida como \"copaíba\", distribui-se abundantemente no cerrado brasileiro, sendo que diversas atividades biológicas já foram descritas na literatura para o seu oleorresina. Contudo, nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa vem estudando as partes aéreas desta espécie e verificou-se que o extrato hidroalcoólico das folhas de C. langsdorffii apresentava atividade antilitiásica. Com a intenção de descobrir quais são os compostos relacionados a esta atividade, foi realizado o estudo fitoquímico das folhas. Com o auxílio de análises cromatográficas foi possível verificar o perfil de cada fração e, assim, escolher as mais promissoras para isolamento de compostos. A partir da fração em acetato de etila obtiveram-se os flavonoides quercetina-3-O-?-L-ramnopiranosídeo (quercitrina) e canferol-3-O-?-L-ramnopiranosídeo (afzelina), isolados por cromatografia contra-corrente (HSCCC), seguida de purificação por cromatografia líquida de alta eficiência preparativa (CLAE-preparativa). Já a partir da fração aquosa obtiveram-se os derivados galoilquínicos 5\'\'-O-metil-3,4-di-O-galoilquínico e 5\',5\'\'-di-O-metil-3,4-di-O-galoilquínico por cromatografia de filtração em gel (Sephadex), seguida de purificação em CLAE-preparativa. Nos testes farmacocinéticos, o extrato hidroalcoólico, quercitrina e o galoilquínico 5\',5\'\'-di-O-metil-3,4-di-O-galoilquínico foram os compostos selecionados para serem estudados. Para ambos os compostos, métodos analíticos foram validados em plasma e em salina para a realização dos estudos farmacocinéticos. Realizou-se também a calibração da sonda de microdiálise in vitro por retrodiálise, para se determinar as condições a serem empregadas in vivo. De maneira geral, quercitrina se ajustou ao modelo farmacocinético de dois compartimentos e, após administração intravenosa de 1 mg/kg, apresentou meia vida curta (t1/2 = 0,40 ± 0,07 h), uma rápida (? = 11,32 ± 1,90 h-1) e boa (Vdss = 2,10 ± 0,52 L/kg) distribuição tecidual e alta depuração (CL = 6,85 ± 0,62 L/h/kg). Por análise dos microdialisados renais, a fração livre de quercitrina nos rins foi 13 vezes maior do que a concentração livre no plasma. O composto galoilquínico, por se tratar de um composto inédito, foi estudado farmacocineticamente por via intravenosa em três concentrações (1 mg/kg, 1,5 mg/kg e 2 mg/kg) e se ajustou bem ao modelo de dois compartimentos com eliminação por Michaelis-Menten, apresentando comportamento não linear (ASC0-? 103,85 ± 23,90; 273,7 ± 81,6 e 363,6 ± 142,32 ?g h/mL, respectivamente). Não foi possível quantificar a concentração livre nos rins por microdiálise para o galoilquínico, pois o mesmo se ligava a sonda. Dessa maneira, o estudo de distribuição tecidual foi realizado, demonstrando que tanto quercitrina quanto o galoilquínico apresentavam alta penetrabilidade nos rins, com uma razão tecido renal/plasma de 23,7 e 12,4, respectivamente. Com relação ao perfil farmacocinético do extrato hidroalcoólico de C. langsdorffii e da fração butanólica após administração por via oral, verificou-se que não foi possível detectar nenhum dos isolados no plasma, sugerindo que tais substâncias foram metabolizadas e, provavelmente, tornaram-se ainda mais hidrossolúveis para posterior eliminação por via renal. Frente aos resultados, conclui-se que quercitrina e galoilquínico são substâncias de rápida eliminação e que podem estar relacionadas à atividade antilitiásica descrita para o extrato das folhas de C. langsdorffii. / Copaifera langsdorffii Desf., popularly known as \"copaíba\" is abundantly distributed in the Brazilian cerrado, with several biological activities that have been described in the literature for its oleoresin. However, since few years ago, our research group has been studying the aerial parts of this species, and it was found that the hydroalcoholic extract of its leaves display antilithiatic activity. Aiming to identify the compounds related to this activity, the phytochemical study of the leaves hydroalcoholic extract was undertaken. By using chromatography techniques, it was possible to choose the most promising fractions to isolate compounds. From the ethyl acetate fraction, it was isolated by countercurrent chromatography (HSCCC) followed by preparative HPLC purification, the flavonoids quercetin-3-O-?-L-rhamnopyranoside (quercitrin) and kaempferol-3-O-?-L-rhamnopyranoside (afzelin). From the aqueous fraction, it was isolated the galloylquinic acid derivatives 5\'\'-O-methyl-3,4-di-O-galloylquinic and 5\',5\'\'-di-O-methyl-3,4-O-di-galloylquinic by using gel filtration chromatography (Sephadex) followed by preparative HPLC purification. For the pharmacokinetic assays, the hydroalcoholic extract, quercitrin and 5\', 5\'\'-di-O-methyl-3,4-di-O-galloylquinic acid were chosen to be studied. For both compounds, it was validated analytical methods in plasma and saline, to perform pharmacokinetic studies. It was also held the microdialysis probe calibration in vitro by retrodialysis, to determine the conditions to be employed in vivo. In general, quercitrin fitted to a two-compartmental pharmacokinetic model and after intravenous administration of 1 mg/kg, it presented a short half-life (t1/ 2 = 0.40 ± 0.07 h) a fast (? = 11.32 ± 1.90 h-1) and good (Vdss = 2.10 ± 0.52 L/kg) tissue distribution and high clearance (CL = 6.85 ± 0.62 L/h/kg). In the kidney microdialisates analyses, the free renal fraction of quercitrin was 13 times greater than the free plasma concentration. The galloylquinic compound, which is a new isolated one, was studied intravenously in three concentrations (1 mg/kg, 1.5 mg/kg and 2 mg/kg) and fitted to a two-compartmental model with Michaelis-Menten elimination, presenting the non-linear behavior (ASC0-? 103.85 ± 23.90, 273.7 ± 81.6 and 363.6 ± 142.32 ?g h/mL, respectively). It was not possible to quantify the free concentration of galloylquinic in the kidney by microdialysis, because it bound to the probe. Thus, the study of tissue distribution was performed, in which it was demonstrated that both quercitrin and galloylquinic showed high penetration in the kidneys, with a tissue/plasma ratio of 23.7 and 12.4, respectively. With regard to the pharmacokinetic profile of the hydroalcoholic extract of C. langsdorffii and n-butanol fraction after oral administration, it was found that it was not possible to detect any of the isolated compounds in plasma, suggesting that these compounds were metabolized and probably become even more water soluble for disposal renally. Based on the results, it is concluded that quercitrin and galloylquinic are rapidly eliminated and may be related to antilithiatic activity of the leaves of C. langsdorffii.

As plantas do gênero Copaifera mais bem conhecidas como \"copaibeira\" são árvores tropicais, reconhecidas pela produção de uma oleorresina extraída do tronco, a qual vem sendo empregada por mais de 500 anos na medicina tradicional popular. Entre as espécies mais abundantes no Brasil destaca-se Copaifera langsdorffii L., que nas suas folhas têm um grande número de compostos fenólicos com potencial atividade biológica como antioxidante. Este estudo teve como finalidade isolar compostos das classes de flavonoides e galoilquínicos presentes nas folhas de C. langsdorffii e investigar seus possíveis efeitos citoprotetores frente à intoxicação com metais pesados. Foi obtido o extrato hidroalcoólico das folhas, e foi submetido a partições líquido-líquido. A fração em acetato de etila foi fracionada através de cromatografia contracorrente de alta velocidade (HSCCC), e a fração em n-butanol por cromatografia de exclusão em gel Sephadex. Foram isolados e identificados por RMN, dois flavonoides (quercitrina e afzelina) da fração em acetato de etila e dez derivados galoilquínicos da fração n-butanólica. Os flavonoides e dois derivados galoilquínicos (AGQ3 e AGQ4), foram avaliados em ensaios de citotoxidade com o protocolo de alamar blue nas linhagens celulares de hepatocarcinoma humano (HepG2) e feocromocitoma da medula suprarrenal de rato (PC12), em três diferentes concentrações (1, 10 e 100 ?M) por 24 h. A segurança do composto AGQ4 também foi avaliada através do ensaio de eficiência clonogênica contra a linhagem de pulmão de hamster chinês (V79). Após foram feitos ensaios de associação realizando pré-tratamentos de 1 hora com os compostos, para posterior exposição a doses tóxicas dos metais. Os ensaios de citotoxidade demostraram que nenhuma das concentrações avaliadas dos quatro compostos afetou a viabilidade das linhagens celulares. O ensaio de eficiência clonogênica mostrou que apenas uma concentração de 3,8 mM consegue reduzir significativamente a viabilidade na linhagem V79, mostrando o AGQ4 como um composto seguro para o uso in vitro. Os ensaios de associação mostraram que os quatro compostos têm efeito citoprotetor significativo na linhagem HepG2, contra mercúrio e chumbo a exceção do AGQ3 que em concentração de 100 ?M não mostrou proteger contra o chumbo. Por outro lado, os compostos não foram ativos contra o mercúrio na linhagem PC12, mostrando efeito contrário, pois os tratamentos metal-composto diminuíram a viabilidade em comparação com os tratamentos só com o metal. Apenas nas concentrações de 1 e 10 ?M se evidenciou efeito protetor dos compostos contra o chumbo. Em geral também foi observado um efeito de menor atividade na maior concentração do composto, que pode estar relacionado ao efeito pró-tóxico que alguns polifenóis apresentam em concentrações maiores. Tanto os flavonoides quanto os derivados galoilquínicos isolados de C. langsdorffii se mostraram com potencial na citoproteção contra a exposição ao chumbo e ao mercúrio / The Copaifera plants, better known as \"copaibeira\", are tropical trees recognized by the production of an oleoresin extracted from the tree trunk, which has been used for more than 500 years in traditional folk medicine. Among the most abundant species in Brazil is Copaifera langsdorffii L., which in its leaves have a large number of phenolic compounds with potential biological activity as antioxidant. Then, this study aimed to isolate compounds of the classes of flavonoids and galloylquinic derivatives present in the leaves of C. langsdorffii and to investigate their possible cytoprotective effects against heavy metal poisoning. The hydroalcoholic extract of the leaves was obtained and submitted to liquid-liquid partitions. The ethyl acetate fraction was subjected to high-speed countercurrent chromatography (HSCCC), and the fraction in n-butanol was subjected to Sephadex gel exclusion chromatography. Two flavonoids (quercitrin and afzelin) from the ethyl acetate fraction and ten galloylquinic derivatives of n-butanolic fraction were isolated and identified by NMR, using semi-preparative high performance liquid chromatography (CLAE-UV). Flavonoids and two galloylquinic acids (AGQ3 and AGQ4) were evaluated in alamar blue cytotoxicity assays in HepG2 cell lines (human hepatocarcinoma cells) and PC12 (rat adrenal pheochromocytoma cells), in three different concentrations (1, 10 and 100 ?M) for 24 h. The safety of compound AGQ4 was also assessed by the clonogenic efficiency assay against V79 (Chinese hamster lung) cell line. Once was proved that compound concentrations did not affect cell viability, association assays were performed by one hour pre-treatments of the compounds for further exposure to toxic doses of the metals. Cytotoxicity assays demonstrated that none of the evaluated concentrations of the four compounds affected the viability of the cell lines. The clonogenic efficiency assay showed that only a concentration of 3.8 mM of AGQ4 can significantly reduce viability in the normal cell line, showing the galloylquinic derivative as a highly safe compound for in vitro use. The association assays showed that the four compounds have a significant cytoprotective effect for the HepG2 cell line against Hg and Pb, except for AGQ3 which at 100 ?M concentration did not show protection against lead. Also the compounds did not show activity against Hg in the cell line PC12 and, in addition, they gave the opposite effect by decreasing cell viability in comparison with the treatments with only the metal. Only the concentrations of 1 and 10 ?M showed a protective effect of the compounds against lead. In general, a lower activity effect was also observed at the higher concentrations of the compounds, which may be related to the protoxic effect of some phenolic compounds. Both flavonoids and galloylquinic acid derivative compounds showed potential on the cytoprotection for exposure to lead and methylmercury.

Calculo renal, também conhecido como urolitíase, é comum com uma taxa de prevalência estimada global recente de 14,8%, a qual parece estar aumentando, com uma taxa de recorrência em cinco anos de até 50%. As várias atividades biológcas promissoras de extratos de plantas ricas em ácidos galolquínicos, como as folhas das espécies de Copaifera, levaram nosso interesse em sintetizar o éster metílico do ácido 3,4,5-tri-O-galoilquinico trissubstituído (TGAME), com o objetivo de desenvolver um composto com potencial para prevenção de cálculos renais. A síntese total incluiu seis etapas a partir dos ácidos quínico e gálico disponíveis comercialmente. O passo-chave na via sintética foi a esterificação de Steglich viável do quinato de metila com ácido 3,4,5-tribenziloxibenzóico usando diciclo-hexilcarbodiimida e N, N-(dimetilamino)piridina como reagentes de acoplamento. As estruturas químicas do composto final e seus intermediários sintéticos foram elucidados por métodos espectroscópicos, espectrométricos e espectrofotométricos de análises. O efeito potencial do composto sobre a ligação de cristal monoidratado de oxalato de cálcio (COM) à superfície de células de rim caninas tipo I de Madin-Darby (MDCKI) e o crescimento de cristais em modelo de túbulos Malpighi de Drosophila melanogaster foi investigado. As quantidades de membrana, citosólica e total de Annexina A1 (ANXA1), Alfa-enolase e HSP90 foram examinadas por análise de transferência de Western após fracionamento subcelular, as quais foram confirmadas por coloração por imunofluorescência de células cultivadas. O pré-tratamento de células MDCKI com TGAME por até 6 h diminuiu significativamente a ligação de cristal COM de uma maneira dependente da concentração. O TGAME (50 ?M) inibiu significativamente a expressão superficial de ANXA1 por microscopia de imunofluorescência, enquanto o ANXA1 intracelular aumentou. A análise de Western Blot confirmou alterações de expressão de ANXA1 na membrana e frações citosólicas de células tratadas com os compostos, enquanto a ANXA1 de células inteiras permaneceu inalterada. O TGAME também diminuiu significativamente o tamanho, o número e o crescimento de cristais de COM induzidos em um modelo de túbulos Malpighi de Drosophila melanogaster, o qual apresentou também potente atividade antioxidante em um ensaio de DPPH. Adicionalmente, realizamos estudos de biotransformação de derivados do ácido galoilquínico, utilizando fungos filamentosos, para prever seus comportamentos farmacocinéticos. Os resultados mostraram que os ácidos galoilquínicos das folhas de Copaifera lucens (fração n-butanólica, BF) foram transformados por Aspergillus alliaceus em um metabólito majoritário, o ácido 3-O-metil gálico (M1), que é um dos metabolitos conhecidos do ácido gálico estudado em humanos. O produto biotransformado foi identificado por UPLC-MS/MS. O pré-tratamento de células MDCKI com BF e seu produto transformado por 3 h diminuiu significativamente a ligação de cristal COM a estas células em concentrações de 50 ?g/mL e 5 ?M, respectivamente. Os compostos reduziram significativamente a expressão superficial das ANXA1 e HSP90 (proteínas de ligação COM) como evidenciado por microscopia de imunofluorescência, enquanto o nível intracelular aumentou. A análise por Western blot confirmou estas alterações nas frações de membrana e citosol das células tratadas com estes compostos, enquanto as células inteiras permaneceram inalteradas. M1 também apresentou atividade antioxidante promissora no ensaio DPPH. / Renal stone disease, also known as urolithiasis, is common with a recent overall estimated prevalence rate of 14.8% that appears to be rising, with a five-year recurrence rate of up to 50%. The promising diverse bioactivities of plant extracts rich in galloylquinic acids such as Copaifera species leaves prompted our interest to synthesize the tri-substituted 3,4,5-tri-O-galloylquinic acid methyl ester (TGAME), with the goal of developing a lead compound for kidney stone prevention. The total synthesis included six steps starting from commercially available quinic and gallic acids. The key step in the synthetic pathway was through Steglich esterification of methyl quinate with 3,4,5-tribenzyloxybenzoic acid using dicyclohexylcarbodiimide and N,N-(dimethylamino) pyridine as the coupling reagents. The chemical structures of the final compound and its synthetic intermediates were elucidated by spectroscopic, spectrometric and spectrophotometric methods of analyses. The potential effect of the compound on calcium oxalate monohydrate (COM) crystal binding to the surface of Madin-Darby Canine Kidney Cells type I (MDCKI) and crystal growth in a Drosophila melanogaster Malpighian tubule model were investigated. Membrane, cytosolic and total Annexin A1 (ANXA1), ?-enolase and HSP90 amounts were examined by Western blot analysis after subcellular fractionation, then confirmed by immunofluorescence staining of cultured cells. Pretreatment of MDCKI cells with TGAME for up to 6 h significantly diminished COM crystal-binding in a concentration-dependent manner. TGAME (50 ?M) significantly inhibited ANXA1 surface expression as evident by immunofluorescence microscopy, whereas intracellular ANXA1 increased. Western blot analysis confirmed ANXA1 expression changes in the membrane and cytosolic fractions of compound-treated cells, whereas the whole cell ANXA1 remained unchanged. TGAME also significantly decreased the size, number, and growth of COM crystals induced in a Drosophila melanogaster Malpighian tubule model, and possessed a potent antioxidant activity in a DPPH assay. We also have performed a biotransformation study of galloylquinic acid compounds using filamentous fungi to predict their pharmacokinetic behaviors. The results showed that galloylquinic acids from Copaifera lucens leaves (n-butanolic fraction, BF) were transformed by Aspergillus alliaceus into one major metabolite 3-O-methyl gallic acid (M1), which is one of the known metabolites of gallic acid studied in humans. The biotransformed product was identified by UPLC-DAD-MS/MS and 1H NMR. Pretreatment of MDCKI cells with BF (50 ?g/mL) and its transformed product M1 (5 ?M) for 3 h significantly diminished COM crystal-binding to these cells. The compounds significantly reduced surface expression of ANXA1 and HSP90 (COM-binding proteins) as evidence by immunofluorescence microscopy, whereas the intracellular level increased. Western blot analysis confirmed these changes in membrane and cytosolic fractions of compound-treated cells, whereas whole cells remained unchanged. M1 also showed a promising antioxidant activity in DPPH assay.