Entsprechend der Zielsetzung dieser Arbeit wurden eng begrenzte Korngrößenbereiche der Ausgangskörnung vibrationsverdichtet und ein Zustand erreicht, der bei bestimmten Vibrationsparametern als stabil und reproduzierbar bezeichnet werden kann. Mittels eines Versuchsplanes sind stabile Körper hergestellt worden, bei denen eine ausreichende Festigkeit (bis 14 MPa) und eine definierte offene Porenvolumenstruktur (40-45 %) nachgewiesen werden konnte. Die Reproduzierbarkeit der durch Vibrationsverdichtung hergestellten Strukturen wurde anhand geringer Standardabweichung (< 5 %) der ermittelten Packungsdichte als auch der untersuchten Strukturencharakteristika bestätigt. Untersuchungen zur Einfiltration einer Feinkornfraktion in ein starres Gerüst mittels Vibrationsverdichtung zeigten, dass dieses Verfahren unter Beachtung von Einflußgrößen zur Herstellung von Gradientenwerkstoffen prinzipiell geeignet ist. Auch ein Einsatz der Vibrationsverdichtung zur gezielten Entmischung eines aus unterschiedlichen Körnungen zusammengesetzten keramischen Rohstoffgemisches konnte bestätigt werden.

Entsprechend der Zielsetzung dieser Arbeit wurden eng begrenzte Korngrößenbereiche der Ausgangskörnung vibrationsverdichtet und ein Zustand erreicht, der bei bestimmten Vibrationsparametern als stabil und reproduzierbar bezeichnet werden kann. Mittels eines Versuchsplanes sind stabile Körper hergestellt worden, bei denen eine ausreichende Festigkeit (bis 14 MPa) und eine definierte offene Porenvolumenstruktur (40-45 %) nachgewiesen werden konnte. Die Reproduzierbarkeit der durch Vibrationsverdichtung hergestellten Strukturen wurde anhand geringer Standardabweichung (< 5 %) der ermittelten Packungsdichte als auch der untersuchten Strukturencharakteristika bestätigt. Untersuchungen zur Einfiltration einer Feinkornfraktion in ein starres Gerüst mittels Vibrationsverdichtung zeigten, dass dieses Verfahren unter Beachtung von Einflußgrößen zur Herstellung von Gradientenwerkstoffen prinzipiell geeignet ist. Auch ein Einsatz der Vibrationsverdichtung zur gezielten Entmischung eines aus unterschiedlichen Körnungen zusammengesetzten keramischen Rohstoffgemisches konnte bestätigt werden.

Adrenocortical carcinomas (ACC) are aggressive tumors associated with a heterogeneous but generally poor prognosis and limited treatment options for advanced stages. Despite promising molecular insights and improved understanding of ACC biology, efficient targeted therapies have not been identified yet. Thus, this study aims to identify potential new drug targets for a future personalized therapeutic approach. RNA was isolated from 104 formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples from ACC patients, 40 of those 104 cases proved to be suitable for further mRNA analyses according to the quality check of the extracted RNA. Gene expression of 84 known cancer drug targets was evaluated by quantitative real-time PCR using 5 normal adrenal glands as reference. Protein expression was investigated for selected candidate drug targets by immunohistochemistry in 104 ACC samples, 11 adenomas and 6 normal adrenal glands. Efficacy of an available inhibitor of the most promising candidate was tested by functional in vitro experiments in two ACC cell lines (NCI-H295R and MUC1) alone or in combination with other drugs. Most frequently overexpressed genes were TOP2A, IGF2, CDK1, CDK4, PLK4 and PLK1. Nuclear immunostaining of CDK1, CDK4 and PLK1 significantly correlated with the respective mRNA expression. CDK4 was chosen as the most promising candidate for functional validation as it is actionable by FDA-approved CDK4/6 inhibitors. ACC samples with copy number gains at CDK4 locus presented significantly higher CDK4 expression levels. The CDK4/6 inhibitor palbociclib showed a concentration- and time- dependent reduction of cell viability in vitro, which was more pronounced in NCI-H295R than in MUC1 cells. This was in line with higher CDK4 expression at western blot analysis in NCI-H295R cells. Furthermore, palbociclib was applied in combination with dual IGFR/IR inhibitor linsitinib showing a synergistic effect on reducing cell viability. In conclusion, this proof-of-principle study confirmed RNA profiling to be useful to discover potential drug targets. Detected drug targets are suitable to be investigated by immunohistochemistry in the clinical setting. Moreover, CDK4/6 inhibitors are promising candidates for treatment of a subset of patients with tumors presenting CDK4 copy number gains and/or overexpression, while linsitinib might be an interesting combination partner in patients with both IGF2 and IGF1R overexpression. These results are intended as a basis for a validation study in a prospective cohort, further evaluation in vivo in suitable mouse models or testing in patients with ACC in clinical trials are needed and might improve the future management of patients with ACC in terms of precision medicine. / Nebennierenrindenkarzinome (ACC) sind aggressive Tumore, die mit einer heterogenen, aber insgesamt ungünstigen Prognose sowie limitierten therapeutischen Optionen für fortgeschrittene Stadien assoziiert sind. Trotz hoffnungsvoll stimmenden molekularen Einblicken und verbessertem Verständnis für die Biologie des ACC wurden bisher keine effektiven Targeted Therapies (zielgerichtete Therapien) identifiziert. Daher strebt diese Studie die Identifikation potentieller neuer Drug Targets (Arzneimittelzielpunkte) im Rahmen einer zukünftigen personalisierten Therapie an. RNA wurde von 104 formalinfixierten und paraffineingebetteten Tumorproben von ACC Patienten isoliert, 40 der 104 Fälle zeigten sich nach der Qualitätsprüfung der extrahierten RNA geeignet für weiterführende mRNA-Analysen. Genexpression von 84 bekannten Karzinom-Drug Targets wurden durch quantitative Real-Time PCR unter Nutzung von 5 normalen Nebennieren als Referenz evaluiert. Proteinexpression wurde in selektierten Kandidaten-Drug Targets durch Immunhistochemie in 104 ACC-Proben, 11 Adenomen und 6 normalen Nebennieren untersucht. Das Potential eines verfügbaren Inhibitors gegen das vielversprechendste Kandidatengen wurde in funktionalen in vitro Experimenten mit zwei ACC-Zelllinien (NCI-H295R und MUC1) allein und in Kombination mit einem anderen Medikament getestet. Die am häufigsten überexprimierten Gene stellten TOP2A, IGF2, CDK1, CDK4, PLK4 und PLK1 dar. Die immunhistologische Kernfärbung für CDK1, CDK4 und PLK1 korrelierten signifikant mit der jeweiligen mRNA-Expression. CDK4 wurde als erfolgversprechendster Kandidat für weitere funktionale Validierung ausgewählt, da es durch FDA-genehmigte CDK4/6-Inhibitoren angreifbar ist. ACC-Proben mit Copy Number Gains des CDK4 Genlocus zeigten signifikant höhere CDK4 Expressionslevel. Der CDK4/6-Inhibitor Palbociclib wies eine zeit- und konzentrationsabhängige Reduktion der Zellviabilität in vitro auf, welche ausgeprägter in NCI-H295R- als in MUC1-Zellen war. Dies war in Einklang mit stärkerer CDK4 Expression in den NCI-H295R-Zellen in der Western Blot Analyse. Weiterhin wurde Palbociclib in Kombination mit dem dualen IGFR/IR-Inhibitor Linsitinib eingesetzt, dies zeigte einen synergistischen Effekt auf die Reduktion der Zellviabilität. Zusammenfassend bestätigte diese Proof-of-Principle den Nutzen von RNA Profiling zur Erfassung potentieller Drug Targets. Die ermittelten Drug Targets sind geeignet für immunhistochemische Untersuchungen im klinischen Setting. Darüber hinaus sind CDK4/6-Inhibitoren vielversprechende Kandidaten für die Behandlung einer Teilgruppe von Patienten mit Tumoren, die CDK4-Copy Number Gains und/oder -Überexpression aufweisen, während Linsitinib ein interessanter Kombinationspartner in Patienten mit sowohl IGF2- wie auch IGF1R-Überexpression darstellen könnte. Diese Resultate sollen als Basis für eine Validationsstudie in einer prospektiven Kohorte dienen, weitere Evaluation in vivo in geeigneten Mausmodellen oder Untersuchung in ACC-Patienten in klinischen Studien sind erforderlich und könnten das zukünftige Management von ACC-Patienten verbessern im Rahmen der Präzisionsmedizin.

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Despite advances in nuclease-based genome editing technologies, correcting human disease-causing genomic inversions remains a challenge. Here, we describe the potential use of a recombinase-based system to correct the 140 kb inversion of the F8 gene frequently found in patients diagnosed with severe Hemophilia A. Employing substrate-linked directed molecular evolution, we develop a coupled heterodimeric recombinase system (RecF8) achieving 30% inversion of the target sequence in human tissue culture cells. Transient RecF8 treatment of endothelial cells, differentiated from patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) of a hemophilic donor, results in 12% correction of the inversion and restores Factor VIII mRNA expression. In this work, we present designer-recombinases as an efficient and specific means towards treatment of monogenic diseases caused by large gene inversions.

Die Aktivierung des NF-kB Vorläuferproteins p100 und p105 erfolgt durch eine proteasomale Trunkierung, um die aktiven p52 und p50 zu erzeugen. Zur Erforschung wurde eine Massenspektrometrie-basierende Proteomik-Strategie entwickelt, die mit der gezielten Reaktionsüberwachungstechnik plus einer Isotopenmarkierung verwendet wurde. In einem endogenen murinen embryonalen Fibroblasten-System konnte gezeigt werden, dass beide Vorläufer zu den jeweiligen Produkten in einer parallelen und sich einander bedingenden Weise in Reaktion auf einen Lymphotoxin-β-Rezeptor-Agonisten verarbeitet werden. Unsere SRM-SILAC- Methode erlaubte die Unterscheidung von Prä-Stimulationsprotein-Populationen aus Proteinen, die de novo nach der Stimulation synthetisiert wurden, und zeigte eine Tendenz für ältere Vorläufermoleküle, sich einer Degradation zu unterziehen, während die de novo-Moleküle auf die Produkte verarbeitet wurden. Die langsame und anhaltende Kinetik, die ein typisches Merkmal des nicht-kanonischen NF-κB- Weges ist. Darüber hinaus, konnten wir beobachten, dass die hydrolytische Aktivität der AAA ATPase VCP / p97 in der Bildung von de novo p52 und p50 eine Rolle spielt. Durch ein MS-basiertes Screening für strahlungsinduzierte Protein-Interaktoren eines weiteren NF-κB-Players, der die regulatorische Untereinheit des IKK-Komplexes IKKγ / NEMO bildet, konnte der Enhancer von mRNA Decapping 4 (EDC4) entdeckt werden. Durch die zusätzliche Untersuchung der E3-Ligase, Parkin, konnte eine Verbindung mit dem NF-κB-Weg durch eine lineare Ubiquitinierung hergestellt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Parkin ist Hauptkomponenten des linearen Ubiquitin-Ketten-Assemblierungskomplexes (LUBAC). Die Proteomanalyse im Proteinkinase A (PKA) -Signalisierungsweg konnte zwei neuartige Regulationsformen identifizieren: K63-verknüpfte Polyubiquitinierung die katalytische Untereinheit von PKA, PKAC in Richtung eines lysosomalen pathways führt, und auch durch einen Pseudosubstrat-Hemmungsmechanismus. / Activation of the NF-κB precursor protein p100 and p105 by a specific proteasomal truncation to yield the active products p52 and p50 is a distinct feature of the non- canonical pathway but the mechanism governing it remains elusive. A novel mass spectrometry-based proteomics strategy was developed, using the targeted selected reaction monitoring technique in conjunction with stable isotope labeling for both absolute quantitation of proteins and to mark precursor protein populations relative to the application of the lymphotoxin β stimulation. In an endogenous murine embryonic fibroblast system, we have shown that both precursors are processed to the respective products in a parallel and interdependent manner in response to a lymphotoxin β receptor agonist. Our Dynamic SRM-SILAC method allowed distinction of pre-stimulation protein populations from proteins synthesized de novo post- stimulation, and revealed a tendency for older precursor molecules to undergo degradation while the de novo molecules went on to be processed to the products, accounting for the slow and persistent kinetics that are a hallmark of the non- canonical NF-κB pathway. In addition, the hydrolytic activity of the AAA ATPase VCP/p97 was implicated in the generation of de novo p52 and p50. An MS-based proteomics screen for specific, radiation-induced protein interactors of another key NF-κB player, the regulatory subunit of the IKK complex, IKKγ/NEMO, turned up the Enhancer of mRNA Decapping 4 (EDC4). This unexpected finding has expanded the known role of NF-κB regulation of protein levels beyond transcription into mRNA stability. Separate investigations into the ubiquitin E3 ligase, parkin, connected it to the NF-κB pathway through a linear ubiquitination it helps catalyze on IKKγ/NEMO. Proteomic analysis of polyubiquitin in the protein kinase A (PKA) signalling pathway helped to identify two novel modes of regulation: a lysosomal degradation pathway; as well as a pseudosubstrate inhibition mechanism.

Graft-versus-host disease (GvHD) of the skin is a severe allo-immune reaction and complication following allogeneic stem cell transplantation. Over the past years, intensive pre-clinical research has led to an improved understanding of the pathophysiology of acute and to a lesser extend chronic GvHD. This has translated into the approval of several new agents for the treatment of both forms of GvHD. This review summarizes the most recent advances in underlying pathomechanisms, clinical trials and newly approved agents for GvHD, with a special focus on skin involvement.